Determinación del linfocito b en biopsias de tejido gingival de pacientes con periodontitis crónica (página 2)

MATERIALES Y MÉTODOS

En el presente estudio se evaluaron 10 biopsias en bolsas mayores o iguales a 7mm analizadas pro duplicado para un total de 20 muestras lográndose digitalizar un total de 585 campos `para las moléculas CD19, CD20 y CD22 tomadas de 2 pacientes con diagnóstico de periodontitis crónica avanzada.

Se realizó un bisel interno vestibular a palatino disecando la papila interproximal. Una vez obtenida la muestra posteriormente se llevó a nitrógeno líquido.

La muestra se descongeló y se orientó en sentido sagital (vestíbulo-lingual) y se procedió a realizar cortes de 4 micras.

Uno de los cortes se sometió a tinción con Hematoxilina-Eosina par corroborar el diagnóstico histológico y la correcta orientación del tejido. Las muestras fueron fiadas con acetona a -20 grados e inactivadas posteriormente. Los sitios inespecíficos se bloquearon, a continuación se marcaron con los anticuerpos monoclonales previa estandarización anti CD19, CD20, CD22.

Posteriormente se realizó la reacción con el anticuerpo secundario anti IgG biotilinado. Se continuó con la preparación de la solución de revelado y finalmente se inactivó la reacción y se observó al microscopio a 10X y 40X. Figura 1A, 1B y 1C.

Se llevó a cabo el proceso de contracoloración y de deshidratación de las láminas con etanol, se fijaron las láminas con Xilol y se llevó a cabo el proceso de montaje y finalmente se realizó la digitalización de imágenes y análisis morfométrico. Como control positivo se realizaron cortes de amígdala los cuales fueron sometidos a la misma técnica y se les agrego anti- CD19 y como control negativo se realizó tinción sin anticuerpo primario y otro sin anticuerpos secundarios.

Previo a la calibración las imágenes digitalizadas de los marcadores de membrana CD19 ,CD20 y CD22 las imágenes fueron estudiadas y observadas tanto por el examinador encargado del análisis histomorfométrico como por el estándar de oro que fue la persona entrenada en la digitalización de campos y en detectar cuales eran las zonas que presentaban inmunoreactividad.

Para realizar la calibración interexaminador y poder determinar la exactitud del instrumento se tomaron imágenes digitalizadas al azar de los diferentes marcadores cada una de las cuáles fueron sometidas al análisis histomorfométrico mediante el programa scion image individualmente y a ciego tanto por el estándar de oro como por el examinador responsable del análisis final de cada uno de estos marcadores.

Posteriormente los resultados fueron analizados y se les aplicó el coeficiente de correlación intraclase donde se obtuvo un resultado de 0.9989% lo que indicó un bajo grado de variabilidad presentado por los datos estándar de oro y el examinador a cargo del análisis histomorfométrico final.

Para la calibración interexaminador y poder determinar su precisión se sometió al examinador responsable del análisis histomorfométrico a realizar la identificación de las zonas que presentaban inmunoreactividad en 10 campos digitalizados tomados al azar, realizando este mismo procedimiento 5 veces en los mismos 10 campos variando el orden de los mismos y trabajando en este procedimiento durante ocho semanas. Posteriormente se analizaron los resultados y se aplicó la prueba estadística coeficiente de variación obteniéndose un resultado del 6% de variación en el análisis intraobservador.

ASPECTOS ESTADÍSTICOS

El análisis Histomorfométrico arrojó datos de expresión en proporciones y pixeles/área para los marcadores CD19, CD20 y CD22. Para el análisis de CD19, CD20 y CD22 se utilizaron medidas de tendencia central y de variabilidad y se evalúo la distribución normal con la prueba de Kolmogorov Smirnov con un nivel de significancia del 5%.

Para establecer la diferencia entre pacientes, entre sitios y entre tejidos se utilizó el análisis de varianza no paramétrico de Kruskall-Wallis a un nivel de significancia del 5%. Un análisis multivariante anova factorial permitió ajustar por los factores: paciente, tipo de tejido y sitio.

RESULTADOS

En el presente estudio se evaluaron 10 biopsias de 2 pacientes con diagnóstico de periodontitis crónica moderada-avanzada, uno de sexo femenino y otro de sexo masculino con edades de 31 y 49 años respectivamente con iguales características clínicas: pérdida de inserción mayor de 5mm, sangrado al sondaje, profundidad de bolsa mayor de 7mm y ausencia de supuración excesiva. El diagnóstico clínico fue corroborado histológicamente mediante tinción con Hematoxilina-eosina. La técnica Histomorfométrica permitió analizar la expresión para cada una de las proteínas de superficie detectada por los anticuerpos monoclonales CD19, CD20, CD22 tanto en tejido epitelial como en tejido conectivo.

Para todos los marcadores evaluados, los datos obtenidos no siguieron una distribución normal (Prueba de normalidad Kolmogorov Smirnov p= 0.0001). La mayor expresión teniendo en cuenta el porcentaje de expresión en pixeles en los tejidos evaluados fue para CD22 con un 57.9% en comparación de un 26.7% para CD20 y 21.2% para CD19 lo que mostró diferencias significativas siendo mayor la expresión de CD22 (p= 0.000 Anova no paramétrico de Kruskall- Wallis).

En cuanto a la expresión de los marcadores a nivel de tejido epitelial y conectivo evaluando la variabilidad se encontraron diferencias significativas entre los tejidos siendo mayor la expresión en tejido conectivo para los tres marcadores comparado con el tejido epitelial. (p= 0.001, test de Levene). Cuando se evaluaron las medianas se observó una diferencia estadísticamente significativa para el marcador CD22 a nivel de tejido conectivo (p=0.001 Anova no paramétrico de Kruskall-Wallis) pero no se observaron diferencias significativas entre las medianas de CD19 (p = 0.548 Anova no paramétrico de Kruskall-Wallis) y CD20 (p=0.130 Anova no paramétrico de Kuskall-Wallis)

Al comparar la variabilidad entre los pacientes se encontraron diferencias estadísticamente significativas siendo mayor la expresión de CD19 y CD22 en el paciente 1 comparado con el 2 (p= 0.000 test de Levene), Al comparar las medianas de CD19 y CD22 entre le paciente 1 y 2 se encontraron diferencias significativas siendo mayor en el paciente 1 (p=0.000 Anova no paramétrico de Kruskall- Wallis) mientras que no se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre las medianas de CD20+ entre el paciente 1 y 2 (p=0.594 Anova no paramétrico de Kuskall-Wallis)

Al evaluar el comportamiento intrapaciente, el paciente 1 mostró gran variabilidad entre sitios observándose diferencias significativas entre las medianas de CD20 por sitio (p=0.000 Anova no paramétrico de Kuskall-Wallis) pero siendo homogéneo este comportamiento para CD19 y CD22 donde no se encontraron diferencias significativas entre las medianas mientras que para el paciente 2 la expresión de CD19 CD20 y CD22 no mostró variabilidad entre sitios observándose un comportamiento similar.

Los resultados mostraron que las células B están presentes en todos los estadios de activación de las lesiones que presentan periodontitis crónica.

DISCUSIÓN

El propósito de este estudio fue determinar la presencia y localización de las moléculas de membrana CD19, CD20 y CD22 presentes en los linfocitos B en tejido con periodontitis crónica avanzada, mediante la técnica de inmunohistoquímica (Biotina-Avidina-Peroxidasa), en cada sitio evaluado, entre sitios del mismo paciente y en los sitios evaluados entre pacientes empleando los títulos adecuados de los anticuerpos monoclonales que permitieron identificar cada una de estas moléculas posiblemente involucradas en el reconocimiento antigénico durante la respuesta humoral en la enfermedad periodontal.

Los análisis histopatológicos y ultraestructurales de la enfermedad periodontal han permitido una división más clara de las etapas de la enfermedad en inicial, temprana, establecida y avanzada, soportado por datos morfológicos observados mediante microscopia de luz. Page y Schroeder 14 en 1976 y Mackler12 en 1977 publicaron sus hallazgos histológicos los cuales han servido como base en el entendimiento de la patogénesis de la enfermedad periodontal siendo su estudio de gran valor pero limitado a las técnicas in vitro desarrolladas en la época.

Estas técnicas mostraban los elementos celulares encontrados en los diferentes estadios de la lesión sin tener en cuenta el grado de maduración de cada una de las células involucradas y sin poder sugerir una posible función de la misma en determinado momento de la enfermedad.

Los últimos avances en técnicas inmunológicas hacen uso de anticuerpos monoclonales que reconocen diferentes antígenos de superficie sobre los componentes celulares. La técnica de inmunohistoquímica se ha convertido en un método adecuado para identificar poblaciones de linfocitos tanto B como T y es así como varios estudios han sido desarrollados basándose en esta, para detectar sobre biopsias de tejido inflamado diferentes marcadores de superficie.

En este estudio se identificaron las proteínas CD19, CD20 y CD22 moléculas regulatorias sobre la superficie celular de los linfocitos B que se expresan en sus diferentes estadios de maduración. La molécula CD19 es expresada por los linfocitos pre-B hasta el proceso de diferenciación a célula plasmática. La proteína CD20 es involucrada en la proliferación y diferenciación de linfocitos B y es expresada durante los estadios tempranos de célula pre-B persistiendo hasta la diferenciación a célula plasmática, su expresión a nivel de la superficie celular incrementa considerablemente siguiendo la activación de la célula B y finalmente la molécula CD22 que juega un papel significativo ya que es una molécula de adhesión de la célula B que puede funcionar en interacciones homotípicas y/o heterotípicas. Esta proteína es expresada en el citoplasma de las células B progenitoras y células pre-B pero es encontrada solamente sobre la superficie de las células B maduras siendo presente al mismo tiempo que la IgD, Su expresión incrementa después de la activación y desaparece con la fuerte diferenciación, por tanto esta molécula puede ser involucrada en la regulación de la activación de la célula B por que se ha visto que la unión del anticuerpo monoclonal CD22 a las células B in vitro incrementa tanto la liberación de calcio como la proliferación inducida después del entrecruzamiento de su receptor inmunoglobulina de membrana. Esta molécula es constitutivamente fosforilada pero el nivel de fosforilación es aumentado después de la activación de la célula B; además presenta una forma soluble que inhibe la activación de la célula T humanas mediadas por CD3 sugiriendo que está molécula puede ser importante en las interacciones T-B. De la misma manera se ha visto que algunas especies de CD22 que poseen siete dominios similares a las inmunoglobulinas son un ligando específico de la célula B para la molécula CD45Ro del linfocito T. (5, 6, 17,21)

Es importante mencionar también que la molécula CD22 + en los linfocitos B parece tener un papel importante en la degradación de la matriz extracelular, ya que se ha visto correlacionada con varias cantidades de MMp-1, MMP-2, MMP3 y con la forma activa de MMP9 característica que se suma a la producción de anticuerpos anticolágeno tales como IgM e IgG presentes en tejido gingival inflamado que también pueden conducir a la pérdida de fibras colágenas. (19)

En este estudio se observaron diferencias estadísticamente significativas en la expresión de las tres proteínas mencionadas siendo mayor la expresión de la molécula CD22 con un 57.7% con respecto a CD19 y CD20 que se expresaron en un 24.2% y 26.7% respectivamente; esto lleva a sugerir que en la periodontitis avanzada existe una constante presencia de células B maduras capaces de ser activadas por antígenos con su subsiguiente proliferación y que igualmente en los procesos crónicos de la inflamación existe la presencia de las células plasmáticas lo cual fue confirmado por la expresión variable de CD19 y la expresión de CD20.

Resultados similares a este estudio fueron presentados por Gemmell y Seymour (7) quienes reportaron la expresión del 62.44% de CD22 en 81 biopsias de tejido gingival de pacientes con periodontitis de moderada-avanzada mediante ensayo de inmunofluorescencia directa, donde no se tuvo en cuenta la expresión de esta molécula separadamente por tipo de tejido a diferencia con este estudio dónde se observo la expresión de CD22 tanto en epitelio como en conectivo y en donde se utilizó la técnica avidina biotina peroxidasa para identificar las moléculas de expresión sobre los linfocitos B.

Así mismo Malberg y col (13) observaron una expresión de CD22 del 33.0% también en biopsias de tejido gingival de pacientes con periodontitis avanzada para lo cual, posterior a la extracción de las células de los tejidos a estudiar, utilizaron como técnica de identificación celular el ensayo de inmunofluorescencia indirecta. Este estudio a diferencia del nuestro observó la expresión de los diferentes marcadores solo en tejido conectivo donde también se observó la expresión de CD3 del 54%, CD4 del 38.4% y CD8 del 17.7%.

En este estudio el marcador CD22 mostró mayor homogeneidad entre sus valores a diferencia de CD19 que muestra gran variabilidad, lo cual fue observado al realizar el análisis histomorfométrico donde la inmunoreactividad observada de la molécula CD22 era mejor delimitada, encontrando un número bajo de células con tinción, localizadas de manera aislada que se expresaban repetitivamente en los diferentes campos analizados mientras que el marcador CD19 presentó una gran variabilidad y se expresaba desordenadamente mostrando conglomerados de células abarcando diferentes extensiones del campo observando y presentándose su ausencia total en varios campos analizados y finalmente la expresión de CD20 la cual presentó un comportamiento intermedio.

Igualmente Yamazaki y col (23) encontraron una gran variación en la expresión de CD19 y un comportamiento completamente heterogéneo de sección a sección y uniforme de área a área en la misma sección a tejido gingival tomado de 19 pacientes con periodontitis de moderada-avanzada, pero a diferencia de este estudio a los pacientes se les realizó una rutina terapéutica que incluyó motivación e instrucción en higiene oral además del raspaje y alisado. Para detectar la molécula también utilizaron la técnica avidina-biotina inmunoperoxidasa, reportando la expresión de CD19 en tejido conectivo dividido en tres porciones tercio sulcular, tercio medio y tercio oral donde se encontró la expresión del 51.8%, el 53.0% y el 33.3% respectivamente, hallazgos que no son acorde con el presente estudio donde el porcentaje de CD19 fue menor, resultados que pueden deberse a que no se tuvieron en cuenta estos tercios para el conteo de células y a que los pacientes previo a la toma de las muestras no tuvieron ningún tipo de tratamiento periodontal.

Por otro lado los hallazgos de este estudio están en concordancia a lo encontrado por WiKstrom y col (22) en 1996 quienes utilizaron la técnica de inmunoperoxidasa y el anticuerpo monoclonal CD19 para detectar linfocitos B en tejido conectivo de 13 pacientes con periodontitis moderada-avanzada los cuales se les realizó tratamiento periodontal previo a la toma de las biopsias. Se encontró una expresión de CD19 del 13% y un porcentaje del 18% de CD4 y del 15% para CD8. Los resultados muestran que el infiltrado celular ocupando el tejido conectivo en periodontitis fue dominado tanto por células B como T donde la numerosa presencia de linfocitos T en lesiones periodontales avanzadas se puede observar y la cual ya ha sido reportada por varios autores indicando la posible participación de estas en el proceso destructivo de la enfermedad. La pequeña diferencia con los porcentajes obtenidos en este estudio del 21.1% de expresión de CD19 puede deberse a que los pacientes no tuvieron terapia periodontal previo a la toma de biopsias por tanto se observó mayor expresión de estas moléculas.

En cuanto a la distribución individual de cada uno de los marcadores estudiados hubo diferencia significativa para CD19 y CD22 entre el paciente 1 y el paciente 2 observándose también que la expresión de estas proteínas puede variar entre paciente y paciente. Al evaluar su comportamiento intrapaciente el paciente 1 mostró una gran variabilidad entre sitios observándose diferencia entre la mayoría de los sitios del mismo paciente para el marcador CD20, sin encontrarse el mismo comportamiento en el paciente 2 dato que se debe tener en cuenta al analizar los futuros cortes que viene en el proceso. Sin embrago, el comportamiento fue homogéneo para CD19 y CD22 mostrando un comportamiento menos variable. Para el paciente 2 las moléculas de superficie CD19, CD20 y CD22 no mostraron diferencias significativas entre sitios del mismo paciente mostrando un comportamiento similar intraindividual.

Las biopsias analizadas en el presente estudio también fueron sometidas a la misma técnica inmunohistoquímica para obtener datos de la expresión de CD4, CD8 y CD3 donde se encontró una expresión en epitelio de CD4 del 25%, CD8 del 21.1% y de CD3 del 29% y a nivel de tejido conectivo una expresión de CD4 del 52% de CD8 del 55% y de CD3 del 48% ,mientras que los marcadores de linfocitos B mostraron una expresión en epitelio para CD19 del 18.5%,para CD20 del 20.6% y para CD22 del 44.6% y a nivel de conectivo una expresión de CD19 del 21.1%, CD20 del 29.9% y finalmente de CD22 del 64.65 datos que al igual que el estudio de Wikstrom y col (22) muestran que el infiltrado celular ocupando el tejido conectivo en periodontitis avanzadas es dominado por ambos grupos celulares de los linfocitos T y linfocitos B. Un aumento en la presencia de células T ha sido observada también por Sinden y Walker (18) en 1979 y Seymour (16) en 1985 quienes encontraron una población de células T aumentada y de células B del 55 y del 30% respectivamente en pacientes con periodontitis de moderada-avanzada pero a diferencia de este estudio los pacientes antes de la toma de la muestra fueron sometidos a tratamiento periodontal lo cual puede alterar la composición del infiltrado inflamatorio de células plasmáticas a un dominio de linfocitos presumiblemente T. En ambos estudios las células fueron extraídas para posteriormente ser identificadas mediante ensayo de inmunofluorescencia usando anticuerpos monoclonales. En el primer estudio mencionado las células B se identificaron por la presencia de SmIg o la presencia del receptor para el complemento y en el segundo estudio las células B se identificaron por medio de SmIg y un panel de anticuerpos monoclonales FMC1, FMC4 y FMC7.

EL FMC1 Exhibe especificidad para las células B, el FMC4 reacciona con HLA-DR de células B maduras activadas y células prolinfocíticas. Las células B marcadas con FMC7 se observaron en gran proporción indicando ser células B maduras igual que lo observado en el presente estudio donde el mayor porcentaje de células marcadas eran linfocitos B maduros.

Lo la indica la posible participación anterior del las células T en el proceso destructivo de la enfermedad del la periodontal. Sin embrago, en este estudio el marcador CD22 mostró una marcada expresión a nivel de tejido epitelial como el conectivo comparado con las poblaciones T, encontrándose un índice de población T/B a nivel de epitelio de CD4/CD22 de 0.5 CD8/CD22 de 0.4 y de CD3/ CD22 de 0.6 y nivel de tejido conectivo los índices T/B de CD4/CD22 de 0.8, CD8/CD22 de 0.8 y CD3/CD22 de 0.7.Estos hallazgos parecen indicar una mayor expresión de células B maduras que células T en los infiltrados celulares en pacientes con periodontitis crónicas severas.

Al igual que Reinhardt(15) el presente estudio encontró una marcada población de células B en sitios con enfermedad activa utilizando técnica avidina biotina peroradas utilizando el marcador Leu 12 (CD19+) Leu14 (CD22) que involucraba células B maduras y células plasmáticas pero a diferencia de éste se identificó la expresión sobre tres tercios : el sulcular, el medio y el oral encontrándose el mayor porcentaje en el tercio sulcular del 48.5% y en menor porcentaje de 10.8% en el tercio oral.

El concepto de la activación de células B policlonales debe tenerse en cuenta en la patogénesis de la enfermedad periodontal ya que no ha sido bien establecido. La activación policlonal puede resultar de células B mitogénicas o activadores policlonales como lectinas y carbohidratos que causan división celular con o sin células T ayudadoras. En el caso de la placa dental esta contiene numerosos componentes los cuales pueden activar células B de una manera policlonal como los liposacáridos. Frecuentemente la activación policlonal puede conducir a la producción de autoanticuerpos policlonales y se ha mencionado también que la sobreexpresión de determinadas moléculas sobre la superficie del linfocito B como el CD19 podría tener este mismo efecto haciendo que los linfocitos B secreten autoanticuerpos.

La alta expresión de las proteínas de membrana en los linfocitos B de las biopsias estudiadas corroboran la alta prevalencia de linfocitos B en la lesión periodontal, lo que lleva a sugerir el importante papel que cumplen en el desarrollo y destrucción de la enfermedad periodontal ya sea por su activación policlonal llevando a la producción de autoanticuerpos (IgG-M) , o por la secreción de IL-1 beta que contribuye al proceso de destrucción ósea o por la fuerte expresión de determinados marcadores de superficie como es el caso de CD22 que también podría contribuir a la degradación del colágeno o de CD19 que con su sobreexpresión se ha visto también a causar producción de auto-anticuerpos.

CONCLUSIONES

Se evidenció la presencia de células CD19, CD20 y CD22 positivas con localización en epitelio gingival y tejido conectivo de biopsias en pacientes con periodontitis crónica avanzada con una expresión aumentada y homogénea para el marcador CD22 con repecto a CD19 y CD20 tanto en tejido epitelial como en tejido conectivo. Se halló poca variabilidad de expresión de las proteínas entre los sitios de un mismo paciente para CD19 y CD22 sin embargo la proteína CD20 mostró variabilidad entre los sitios evaluados del mismo paciente. A diferencia de la expresión de estos marcadores entre pacientes sugiriendo la expresión variable de estos entre individuos afectados.

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Escobar Erika, OD, Periodoncista*** Lafaurie Gloria, OD, Periodoncista** Juliette De Avila, BCl,* Munevar Juan, OD, MSc* Castellanos Jaime, OD, PhD* Hurtado Hernán, Biólogo, PhD* Romero M Consuelo, BCl, MSc* *Instructor Asistente, Facultad de Odontología, Universidad El Bosque. ** Profesor Asociado, Facultad de Odontología, Universidad El Bosque. *** Residente de Periodoncia y Medicina Oral, Facultad de Odontología, Universidad El Bosque.