Detección de viremia en la infección experimental por Rubulavirus porcino (página 2)

MATERIAL Y MÉTODOS

Virus y antígeno viral. Se utilizó la cepa PAC3 (Jalisco/1992) del RVP, por su capacidad para producir infección en cerdos mayores de un mes de edad y por su diseminación sistémica (Ramírez-Mendoza y col., 1997). El virus fue replicado en cultivos de la línea celular PK-15 (riñón de cerdo), mantenidos en medio mínimo esencial (MEM) y suplementado con 5% de suero fetal bovino. Los sobrenadantes de las células infectadas se clarificaron por centrifugación a 3000xg durante 40 minutos.

Titulación Viral. La capacidad infectante del virus se determinó en dosis infectantes en cultivo celular al 50% (DICC50), de acuerdo con el método de Kärber (revisado en Blake y O´Connell 1993).

Animales de experimentación. Se emplearon 8 cerdos de 3 meses de edad, híbridos York- Landrace, provenientes de una granja libre de la enfermedad del ojo azul. Los animales se evaluaron clínicamente y se comprobó la ausencia de anticuerpos contra el RVP mediante una prueba inmunoenzimática indirecta. Se separaron en dos grupos de 4; los miembros del primer grupo se inocularon con 105 DICC50 del RVP por vía intranasal, y a los otros 4 se les empleó como testigos no infectados; ambos grupos permanecieron en cuartos de aislamiento separados, se les proporcionó agua y alimento a libre demanda.

Muestras sanguíneas. Se tomaron muestras de sangre de la vena cava superior antes y durante la infección con intervalos de 4 días. Se empleó sangre con EDTA para realizar los frotis que fueron utilizados en la detección de antígeno viral y para realizar los estudios de biometría hemática. Sangre sin anticoagulante se utilizó para obtener el suero y determinar el título de anticuerpos mediante ensayos inmunoenzimáticos.

Inmunofluorescencia. Los frotis sanguíneos se dejaron secar a temperatura ambiente y posteriormente se fijaron con ácido acético al 5% en metanol. Se agregó IgG de conejo especifica contra el RVP (cepa PAC-3) en dilución 1:500 y se incubó 1 hora a temperatura ambiente en cámara húmeda; se lavó con tampón de fosfatos (PBS) conteniendo 0.3% del detergente Tween- 20. Como segundo anticuerpo se agregó una dilución 1:1000 de inmunoglobulinas de carnero, específicas contra IgG de conejo, conjugadas con isotiocianato de fluoresceína. Las muestras se incubaron en cámara húmeda 1 hora a temperatura ambiente, se lavó con PBS-Tween- 20 por 15 minutos. Se montó la preparación con glicerol-PBS 1:1 y se observó con microscopio de fluorescencia.

Ensayo inmunoenzimático. Para la identificación de anticuerpos antivirales se utilizó una prueba de ELISA indirecto. Se colocaron 50 µl de antígeno viral total (2 µg/pozo) diluido en amortiguador de carbonatos 0.1M, pH 9.6 en cada pozo de una placa de 96 pozos con fondo plano y se dejó adsorber toda la noche a 4ºC; después de desechar el exceso de antígeno, se bloqueó con leche descremada al 0.3% en PBS por 1 hora a 37ºC. Se incubó 30 minutos a temperatura ambiente con diluciones seriadas de los sueros de cada cerdo y se lavó tres veces con PBS-Tween-20. Se añadió una dilución 1:5000 de anticuerpos de cabra conjugados a peroxidasa específicos contra IgG de cerdo, se incubaron 30 minutos a temperatura ambiente y se lavaron nuevamente con PBS-Tween-20. Como sustrato se utilizó H2O2/orto-fenildiamina y después de 10 minutos se detuvo la reacción con ácido sulfúrico 2.5 N. La absorbancia se determinó a 492 nm en un espectrofotómetro para microplacas (Coligan y col., 1994).

Estudios hematológicos. La concentración de hemoglobina (HB) se determinó por el método de cianometahemoglobina leída a 540 nm. El hematocrito (HTO) fue determinado por el método de microhematócrito. La cuenta de eritrocitos se realizó en pipeta empleando el diluyente de Gower (Na2SO4 12.5 g, CH3COOH 33.3 ml y agua destilada 200 ml). La concentración media de hemoglobina corpuscular se calculó con la siguiente fórmula: CMHC= HB/HTO. El volumen corpuscular medio se calculó de acuerdo con la fórmula VCM= HTO X 1000 / N° de glóbulos rojos. La hemoglobina corpuscular media se calculó mediante la fórmula HCM= HB / N° de glóbulos rojos. El número de leucocitos totales se determinó en pipeta empleando la solución de Turk (CH3COOH 2 ml, solución acuosa de violeta de genciana al 2% 1 ml, agua destilada 100 ml). La cuenta diferencial de leucocitos se realizó por el método de May-Grünwald-Giemsa (Nelson y Henry, 1995).

RESULTADOS

Signos clínicos. Todos los animales inoculados con el virus mostraron signos pasajeros de afección respiratoria, aumento de la secreción nasal, ojos llorosos, estornudos esporádicos, los cuales se presentaron entre las 24 y 48 horas p.i. Dos de los cerdos inoculados (cerdos 1 y 3) mostraron hipersensibilidad al sonido y al tacto entre los días 9 y 15 p.i. y uno de ellos (cerdo 1) mostró también alta agresividad durante esos días. Ningún otro signo fue observado en los animales infectados durante el tiempo que duró el experimento. Los animales testigos no mostraron signos de enfermedad.

Detección de antígeno viral. En todos los cerdos infectados se identificó al antígeno viral a partir del día 4 p.i. La marca fluorescente se observó en la superficie externa de eritrocitos y fue de alta intensidad, tanto que parecía ser fluorescencia inespecífica, pero la comparación con los controles negativos mostró que se trataba de una reacción antígeno-anticuerpo específica. Algunas veces los eritrocitos positivos al antígeno se observaron como grupos o grumos celulares con morfología alterada (figura 1B). La marca inmunofluorescente asociada a eritrocitos mostró una disminución notable en el transcurso del experimento (cuadro 1), interpretándose como totalmente negativa el día 16 p.i. En dos de los animales infectados también se identificó al antígeno viral en el citoplasma de leucocitos (figura 1C), esto comenzó a observarse en unas cuantas células el día 12 p.i., como una marca de baja intensidad, pero en los días posteriores aumentó el número de leucocitos positivos y la intensidad de la marca fluorescente (cuadro 1). Ninguno de los cerdos testigos mostró reacción positiva a la inmunofluorescencia durante todo el experimento (figura 1-A).

FIGURA 1. Inmunofluorescencia en frotis sanguíneos. A. Reacción negativa en un cerdo testigo no infectado. B. Reacción positiva intensa en un cerdo infectado con 105 DICC50 del Rubulavirus porcino, a los 4 días p.i. Note la alteración morfológica de los eritrocitos y falta de reacción en los leucocitos. C. Reacción positiva intracelular en leucocitos a los 12 días p.i. Blood slide immunofluorescence. A. Negative reaction in an uninfected control pig. B. Intense positive reaction in a pig infected with 105 TCID50 of porcine rubulavirus, at 4 days p.i. Note morphological alteration of erythrocytes and lack of reaction on leukocytes. C. Intracellular positive reaction in leukocytes at 12 days p.i.

Respuesta inmune humoral. La identificación de anticuerpos antivirales se realizó por el método de ELISA indirecto. Todos los animales (infectados y testigos) mostraron valores negativos antes de iniciar el experimento. Los cerdos infectados mostraron valores positivos a partir del día 4 p.i., los cuales aumentaron paulatinamente durante el tiempo que duró el experimento (figura 2). Esto no sucedió con los valores de absorbancia de los cerdos del grupo testigo que permanecieron negativos todo ese tiempo.

Estudios hematológicos. Esta serie de ensayos permite detectar posibles alteraciones sanguíneas relacionadas con la infección viral, en cuanto al número, morfología y tipo de las células sanguíneas durante el estado de viremia. Los valores obtenidos en los cerdos infectados experimentalmente se compararon con los valores citados por la bibliografía (Shalm y col., 1975) y con los valores promedio de los cerdos utilizados como testigos negativos. En general, los parámetros de la BH no se vieron alterados durante la infección por RVP o por su asociación con las células sanguíneas durante la viremia (cuadro 2).

FIGURA 2. Respuesta inmune humoral. Titulación de los anticuerpos séricos contra el rubulavirus porcino mediante ELISA indirecto. La línea de corte (punteada) se estableció mediante el promedio de la absorbancia de los sueros testigos negativos más dos veces su desviación estándar. Humoral immune response. Titration of serum antibodies against porcine rubulavirus in infected pigs by indirect ELISA. The cut off (dotted line) was calculated by the mean of the absorbance values corresponding to sera from uninfected control pigs plus two-fold their standard deviation.

DISCUSIÓN

En este trabajo demostramos la presencia de antígeno viral en la circulación sanguínea de cerdos infectados con RVP. El éxito de nuestro estudio comparado con el de otras investigaciones, en las que se intentó, pero no se logró, detectar al antígeno viral en sangre (McNeilly y col., 1997), probablemente se debe al método de fijación de los frotis sanguíneos con ácido acético al 5% en metanol, solución que mostró una notable diferencia con otras soluciones fijadoras en su capacidad para conservar las células sanguíneas y en su nivel de reacción inespecífica. Nuestros resultados indican que hay dos fases de diseminación hematógena. Una fase primaria que se produce entre los días 4 y 12 después de la inoculación, durante la cual, el virus se asocia a la superficie externa de eritrocitos, posiblemente por uniones específicas ligando-receptor mediadas por ácido siálico (Reyes-Leyva y col., 1997; 1999); y una segunda fase, posiblemente posterior a la replicación del virus en órganos linfoides, en que los leucocitos infectados sirven de vehículo de diseminación viral en órganos alejados del sitio inicial de replicación, como son los del aparato reproductor. Esto último concuerda con la identificación de antígeno viral en células mononucleares infiltradas en el tejido intersticial del epidídimo y testículos de cerdos infectados (Ramírez-Mendoza y col., 1997).

En un estudio previo demostramos que el RVP puede ser recuperado de cultivos de células blancas mononucleares obtenidas de sangre periférica de cerdos infectados (Hernández y col., 1998). La susceptibilidad de estas células a la infección por RVP ha sido demostrada por la expresión en su superficie del receptor viral que contiene sialil ( 2,3) galactosa (Hernández y col., 2002). La identificación de antígeno en el interior de células mononucleares sugiere que la infección viral podría afectar la función de estas células e inducir la desregulación de la respuesta inmunitaria de los animales infectados. Al respecto, se ha identificado una alteración en la relación de linfocitos CD4:CD8 y un desbalance a favor del fenotipo TH2, con incremento de IL- 10 y baja de IFN , en la respuesta inmune antiviral durante otras infecciones experimentales con RVP (Hernández y col., 2001 y 2002).

Nuestros datos sugieren que el virus deja de circular libremente en la sangre a partir del momento en que la producción de anticuerpos muestra un nivel elevado; esto ocurre en la segunda semana de infección en este y otros estudios estudios (Hernández y col., 1998). Esto puede deberse a que gran parte de los anticuerpos que se producen en respuesta a la infección viral están dirigidos contra la proteína de superficie HN, ya que su actividad es altamente neutralizadora (Hernández y col., 1998).

CONCLUSIONES

Se identificó la fase de viremia en cerdos infectados mediante ensayos de inmunofluorescencia en frotis sanguíneos. El antígeno viral se detectó en eritrocitos y leucocitos. Los anticuerpos formados contra el RVP fueron detectables a partir de la primera semana p.i., el aumento de anticuerpos coincide con la disminución del virus libre en sangre. La infección con rubulavirus porcino no produjo alteraciones en los diferentes parámetros de la biometría hemática analizados en este experimento.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a la Q.F.B. Gabriela Aguirre Saldívar y a la Q.F.B. María Eugenia Sánchez Parés por su excelente apoyo técnico.

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1 Lab. de Virología, Centro de Investigación Biomédica de Oriente, Instituto Mexicano del Seguro Social, HGZ Nº 5, Km 4.5 Carretera Atlixco-Metepec, CP 74360, Metepec, Puebla, México. Tel./Fax: 52+ 24 44 44 01 22. 2 Dept. de Producción Animal Cerdos, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, UNAM. 3 Dept. de Nutrición y Salud Animal, Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, Hermosillo, Sonora, México Proyecto financiado por CONACYT México (3228PB9607).