Anticuerpos policlonales antiinmunoglobulinas de salmón: Herramientas potenciales para diagnóstico

• Material y métodos
• Resultados y discusión
• Bibliografía

RESUMEN: A partir de sueros de salmón del Atlántico (Salmo salar) se han purificado sus inmunoglobulinas (Igs) mediante precipitación con sulfato de amonio al 50% de saturación, seguido de cromatografía de exclusión por tamaño molecular en Sephacryl S-300. La fracción de Igs purificadas fue utilizada como inmunógeno para generar un anticuerpo policlonal anti-Igs de salmón, el cual fue purificado por afinidad usando Sefarosa-proteína G. Mediante ensayo inmunorradiométrico contra el inmunógeno, la IgG anti-Igs de salmón demostró un elevado título (a lo menos 1/100.000) específico para el antígeno. El anticuerpo generado ofrece la posibilidad de detectar respuestas humorales en salmón y trucha (reactividad cruzada), con fines diagnósticos o de investigación.

Palabras claves:  anticuerpos policlonales,  salmón,  diagnóstico.

SUMMARY: Polyclonal antibodies anti-salmon immunoglobulins; potential tools for diagnosis. Immunoglobulins (Igs) from sera of Atlantic salmon (Salmo salar) were purified with 50% saturated ammonium sulphate followed by molecular sieving chromatography using Sephacryl S-300. The fraction of purified Igs was used as immunogen to generate a polyclonal antibody anti-salmon Igs. This antibody was affinity purified in a Sepharose-protein G column. By immunoradiometric assay against the immunogen, the rabbit IgG anti-salmon Igs showed a high specific titer (at least 1/100.000) for the antigen. This reagent offers the possibility of detection of salmon or trout (crossreactivity) humoral immune responses, both for diagnostic and research purposes.

Key words:  polyclonal antibodies, salmon,  diagnosis.

INTRODUCCIÓN

En Chile la década de los 80 representó el despegue de la producción de salmón de cultivo, situándose en el segundo lugar a nivel mundial. Las especies que representan los mayores volúmenes de producción las constituyen el salmón del Atlántico (Salmo salar), salmón coho (Oncorhynchus kisutch) y trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss). Dentro de los principales factores que ayudaron al desarrollo de esta industria en nuestro país destacó, en sus inicios, una ventajosa situación ictiosanitaria (Méndez y Munita, 1994).

Sin embargo, el éxito productivo, expresado en un aumento del retorno de divisas, se vio parcialmente obstaculizado con la aparición de bruscas mortalidades de salmón coho en el año 1989, derivadas de la infección con Piscirickettsia salmonis (Fryer y col., 1992). Esta última, actualmente, afecta al salmón del Atlántico, al salmón chinoock (Oncorhynchus tshawytscha) y trucha arco iris (Garcés y col., 1991).

Para disminuir el daño provocado por ésta y otras patologías se han desarrollado metodologías diagnósticas que apuntan a la detección del agente causal o de anticuerpos dirigidos contra éste. Dentro del primer enfoque destacan: el cultivo de microorganismos en líneas celulares (Wolf y Quimby, 1962; Fijan y col., 1983; Lannan y col., 1984), inmunofluorescencia directa o indirecta (Lewis y Allison, 1971; Lannan y col., 1991) y ensayo inmunoenzimático (ELISA) de captura del patógeno (Adams, 1992). Empleando el segundo enfoque: reacciones de aglutinación (Clark y col., 1987), inmunoprecipitación en geles (Suran y col., 1967), fijación del complemento (Dorson y Torchy, 1979) y ELISA (Kaattari y Yui, 1987).

No obstante la ventajosa sensibilidad ofrecida por los ensayos inmunométricos, su utilidad se ha visto restringida por serias dificultades, a nivel mundial, para la adquisición de anticuerpos contra inmunoglobulinas (Igs) de salmónidos. No parecería que estas dificultades se derivaran de problemas en la purificación del antígeno como se discute más adelante. Para contribuir al diagnóstico de diversas patologías, en este trabajo se describe una combinación de procedimientos experimentales simples y estándares para la producción de anticuerpos policlonales anti-Igs de salmón.

MATERIAL Y MÉTODOS

OBTENCION DE IG DE SALMON

Obtención de suero de salmón. Un grupo de 10 salmones del Atlántico (Salmo salar) de mar, adultos, sanos, de aproximadamente 2 kg, fueron anestesiados por inmersión en una solución acuosa de benzocaína al 0.001% v/v y sangrados mediante corte transversal profundo a nivel de las branquias (arterias aorta ventral y coronaria). Los sueros fueron obtenidos por procedimientos estándares y congelados a -20°C.

Purificación de Igs de salmón. De acuerdo a lo descrito por Havarstein y col. (1988) de los sueros de salmón se aislaron sus Igs, inicialmente por medio de precipitación con sulfato de amonio al 50% de saturación. Las Igs precipitadas fueron primero lavadas con sulfato de amonio al 50% de saturación y luego redisueltas en tampón fosfato salino (PBS) para su posterior diálisis contra PBS, durante toda la noche a 4°C. Posteriormente, este material fue sometido a cromatografía de exclusión por tamaño molecular en una columna (120 x 2.5 cm) de Sephacryl S-300, eluyendo con PBS. La separación cromatográfica fue monitorizada mediante geles de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), seguida de tinción con azul de Coomassie. Aquellas fracciones que mostraron cadenas pesadas (H) y livianas (L) fueron combinadas.  

GENERACION DE IGG POLICLONAL ANTI-IG DE SALMON

Inmunización de conejos. Dos conejos hembras neozelandesas, de 2 meses de edad fueron inmunizadas con 500 µg de proteína total, por inoculación, de Ig de salmón purificada (mezcla de fracciones cromatográficas 29-31). El protocolo consistió en una primera inoculación subcutánea de 5 ml (2.5 ml de coadyuvante de Freund completo y 2.5 ml de solución antigénica suspendida en suero fisiológico), una segunda subcutánea de igual volumen (2.5 ml de coadyuvante de Freund incompleto y 2.5 ml de solución antigénica) y una última intraperitoneal de 1 ml (0.5 ml de coadyuvante Freund incompleto y 0.5 ml de solución antigénica), todas ellas separadas por una semana. Las sangrías fueron semanalmente, empezando con una preinmune. Los sueros se obtuvieron mediante procedimientos estándares.

Purificación por afinidad de IgG de conejo anti-Ig de salmón. Alícuotas de 5 ml de suero de conejo (tercera sangría) fueron pasadas a través de una columna de afinidad de Sefarosa-proteína G. La columna, con la mayor parte de las IgG retenidas, fue lavada con 100 veces su volumen de PBS. Luego ésta fue eluida con buffer glicina (glicina 0.1M / NaCl 0.15M, pH 2.6), colectando el material eluido sobre buffer Tris 2M pH 8.0. La pureza de la IgG de conejo fue analizada mediante SDS-PAGE, seguida de tinción con azul de Coomassie.

Titulación de la IgG anti-Ig de salmón. Pocillos de placas de cloruro de polivinilo (PVC) fueron sensibilizados con 50 µl de una solución 20 µg/ml de Ig de salmón purificada. Los sitios reactivos remanentes se bloquearon con albúmina sérica bovina al 1% p/v en PBS. Diluciones seriadas de la IgG anti-Ig de salmón se hicieron reaccionar con la Ig adsorbida a la fase sólida. El revelado se efectuó con IgG de cabra anti-IgG de conejo, purificada por afinidad y radiomarcada con 125I. La radiactividad asociada específicamente a los pocillos fue medida en un contador gamma.