Anticuerpos policlonales antiinmunoglobulinas de salmón: Herramientas potenciales para diagnóstico (página 2)

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Aunque en los mamíferos hay cinco clases o isotipos de Igs, en los peces teleósteos sólo se ha demostrado la existencia de una. Se trata de una macroglobulina similar a la IgM, tetramérica, compuesta de una estructura básica de dos cadenas H y dos L. Dependiendo de las especies de peces, su masa molecular varía entre 600 y 800 kDa (Clem, 1971).

Para la purificación de las Igs de peces se ha descrito una variedad de técnicas, dentro de las que destacan la precipitación con sulfato de amonio saturado, separación por cromatografía de exclusión por tamaño molecular y por intercambio iónico (Acton y col., 1971; Havarstein y col., 1988). En este trabajo, para la purificación de las Igs de salmón, se usó una combinación de las dos primeras.

En la figura 1A se muestra el perfil de separación, para las Igs de salmón, obtenido al pasar el producto fraccionado con sulfato de amonio al 50% de saturación a través de una columna de exclusión por tamaño molecular de Sephacryl S-300. De los dos picos resueltos, el primero contiene a las Igs y, el segundo, a otros componentes proteicos y remanentes de albúmina sérica. Esto se deduce al seguir la purificación mediante SDS-PAGE seguida de tinción con azul de Coomassie, para las distintas fracciones colectadas (fig. 1B) y al comparar sus masas moleculares relativas con la de los estándares. Las Igs fueron colectadas, principalmente, entre las fracciones 29 y 31 (fig. 1B, carriles 29-31), observándose también su presencia en las fracciones 27, 28, 32 y 33. Las cadenas H y L (fig. 1B, carriles 20-32) alcanzaron una migración electroforética aproximada, correspondiente a los 70 y 25 kDa, respectivamente, valores descritos para esta Ig (Havarstein y col., 1988). En las fracciones más enriquecidas de Igs de salmón (29-31), éstas representan más del 80% de las proteínas totales.

En la figura 2 se muestra el grado de purificación alcanzado con la precipitación con sulfato de amonio (carril 2) y luego al usar cromatografía de exclusión por tamaño molecular (carril 3). El sulfato de amonio eliminó la mayor parte de la albúmina sérica, y la separación cromatográfica generó un producto adecuado para obtención de un anticuerpo policlonal.

Los anticuerpos anti-Igs de salmón fueron aislados desde el suero completo del conejo inmune mediante cromatografía de afinidad, utilizando proteína G, la cual tiene afinidad por el dominio Cg2 de la IgG (Coligan y col., 1995). En la figura 3 se puede apreciar la pureza de estos anticuerpos, antes (carril 1) y después (carril 2) de la separación cromatográfica. Se distingue claramente la cadena H, alrededor de los 50 kDa, mientras la cadena L se visualiza débilmente, debido a una baja captación del colorante, derivado del alto grado de glicosilación de esta cadena. La presencia de una ligera banda alrededor de los 66 kDa (carril 2) representa un pequeño porcentaje (no más de 10%) de albúmina sérica de conejo que permaneció adsorbida a la proteína G. En un solo paso se logró obtener más de un 90% de pureza.

El anticuerpo purificado mantuvo su capacidad de combinarse con el antígeno (Igs de salmón), verificado mediante ensayo inmunorradiométrico (IRMA) en diluciones de por lo menos 1/100.000 (fig. 4).

Mediante inmunoelectrotransferencia, tanto contra suero completo como contra Igs purificadas, provenientes de salmón del Atlántico, el anticuerpo reaccionó predominantemente con las cadenas pesadas y livianas de las Igs. En el primer caso, la intensidad del reconocimiento fue más débil, lo cual se explica por la menor concentración relativa de las Igs en el suero completo de salmón (resultados no mostrados)

Adicionalmente, mediante IRMA, este anticuerpo demostró buena reactividad cruzada con las Igs de salmón coho y trucha arco iris. Desde el punto de vista diagnóstico esto es ventajoso, dado que la utilización de un solo reactivo permitiría detectar infecciones en diversas especies de salmónidos. La técnica de IRMA es equivalente a la de ELISA ya que sólo cambia la naturaleza de la inmunosonda (radiactiva versus enzimática).

La generación de anticuerpos de esta naturaleza no parece trivial. La etapa de purificación de las Igs de salmónidos es un paso previo ineludible. El reactivo generado puede ser útil en el análisis diagnóstico e investigación. Así, podría facilitar la detección de anticuerpos dirigidos contra un patógeno, ya sea viral, bacteriano, e incluso parasitario, mediante técnicas de inmunofluorescencia, ensayos inmunométricos, inmunodot e inmunoelectrotransferencia. También podría permitir adquirir información relacionada con la inmunidad humoral en peces salmónidos, frente al desafío con patógenos definidos.

El enfoque experimental sería usar el anticuerpo de conejo anti-Igs de salmón como inmunosonda de detección de estas últimas, revelando con otro anticuerpo dirigido contra el isotipo de la especie (conejo) en que fue generado. Otro enfoque sería usar directamente el anticuerpo, purificado por afinidad por el antígeno, como inmunosonda de detección de las Igs de salmón, unidas al antígeno del patógeno adsorbido a una fase sólida como PVC.

Alternativamente, la unión de la IgG de conejo a las Igs de salmón podría detectarse con proteína A o IgG de cabra anti-IgG de conejo, ambas transformadas en inmunosondas enzimáticas o radiactivas.

Figura 1-A. Purificación de inmunoglobulinas (Igs) de salmón mediante cromatografía por tamaño molecular, utilizando Sephacryl S-300. Las Igs, previamente precipitadas con sulfato de amonio al 50% de saturación, eluyeron en el primer pico (fig. 1B, fracciones 29-31). 1B. Análisis electroforético de las fracciones de Igs de salmón purificadas por tamaño molecular. Las fracciones cromatográficas (26-35, 37, 44 y 46) fueron separadas mediante SDS-PAGE, seguida de tinción con azul de Coomassie. Las Igs eluyeron principalmente entre las fracciones 29 y 31. En el gel se cargaron 30 µl de cada una de las fracciones en estudio. Los números de la izquierda representan estándares de masa molecular.

1A. Purification of salmon immunoglobulins (Igs) by molecular sieving chromatography using Sephacryl S-300. Igs, previously precipitated with 50% saturated ammonium sulphate, eluted in the first peak (Figure 1B, fractions 29-31). 1B. Electrophoretic analysis of the purified salmon Ig fractions by molecular sieving. Chromatographic fractions (26-35, 37, 44 and 46) were separated by SDS-PAGE and stained with Coomassie blue. Igs eluted mainly in fractions 29 and 31. 30 µl of each fraction were run in the gel. Numbers to the left represent molecular mass standards.  

Finalmente, debe destacarse que comercialmente sólo se dispone de un anticuerpo policlonal contra Igs de trucha (generado en cabra por Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., U.S.A.). Consultada la literatura no hemos detectado publicaciones que describan el procedimiento empleado para generar este reactivo. Además, su accesibilidad a los productores nacionales es limitada al no existir representante regional para adquirir el producto. Por otra parte, la compañía BIOS Chile. I.G.S.A. generó en ratones un anticuerpo policlonal contra Igs de salmón, sin embargo, actualmente no se encuentra disponible. Por último, el uso de anticuerpos monoclonales murinos está restringido al anticuerpo 4C10, contra salmón del Atlántico. Este no se produce comercialmente, sólo se puede obtener por donación del Instituto de Aquacultura de la Universidad de Stirling, Escocia, por lo cual su uso se restringe a algunos laboratorios de investigación.

Los hechos anteriores señalan, entonces, la conveniencia de contar con un procedimiento simple para generar el reactivo en un país cuya producción de salmónidos es de las mayores a nivel mundial.

 Figura 4. Titulación de IgG de conejo anti-Igs de salmón mediante IRMA. Diluciones, por triplicado, de la IgG anti-Ig de salmón se hicieron reaccionar con Ig de salmón adsorbida a pocillos de cloruro de polivinilo. Se reveló con IgG de cabra anti-IgG de conejo, purificada por afinidad y radiomarcada. Rabbit anti-salmon Igs IgG titration by IRMA. Dilutions, in triplicates, of nti-salmon Igs IgG were tested with salmon Igs adsorbed to wells of polyvinyl chloride microtitration plates. Detection was with goat IgG anti-rabbit IgG, affinity purified and radiolabelled.

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