Estudio comparativo de un PCR anidado, ELISA y AGID en la detección del virus de la leucosis bovina en muestras de suero, sangre y leche

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SUMMARY: Different methods available for the detection of bovine leukaemia virus (BLV) infection were evaluated. The methods evaluated were AGID in serum, ELISA in serum and milk, and PCR in blood lymphocytes. The AGID test identified a smaller number of positive animals (75/126) compared to PCR and ELISA tests (100/126). Three positive animals by AGID were negative by PCR and 28 of the 51 negative samples by AGID were positive by PCR. The sensitivity of PCR with respect to AGID was 96%, whereas the specificity was 45% (kappa 0.45). All positive animals by AGID were also positive by ELISA in serum and milk samples, whereas 25 negative animals by AGID were considered positive by the ELISA test, in both biological samples. Thus, sensitivity of the ELISA with respect to AGID was 100%, whereas specificity was 51% (kappa 0.55). The smaller sensitivity of AGID is not due to false positive reactions of ELISA and PCR tests, but rather to a greater sensitivity of these, which suggests a revision of AGID in those countries in which it is still used as the official method in the erradication programs of leukaemia.

Key words: cattle, leukaemia, ELISA, PCR.

RESUMEN: Se evaluaron distintos métodos actualmente disponibles para el diagnóstico de la infección por el virus de la leucosis bovina (VLB). Los métodos empleados fueron AGID en suero, ELISA en muestras de suero y leche y PCR en linfocitos sanguíneos. De un total de 126 animales analizados, AGID identificó un menor número de animales positivos (75) comparado con las pruebas PCR y ELISA aplicadas en muestras de suero y leche (100). Tres animales positivos a AGID fueron negativos a PCR y 28 de las 51 muestras negativas a AGID fueron positivas mediante PCR. La sensibilidad diagnóstica de PCR con respecto a AGID fue de 96%, mientras que la especificidad fue de 45% (kappa 0,45). Todos los animales positivos a AGID fueron también positivos a ELISA aplicado tanto en suero como en leche, mientras que 25 animales negativos a AGID fueron consignados como positivos a ELISA, en ambas muestras biológicas. De esta forma, la sensibilidad diagnóstica de ELISA respecto a AGID fue de un 100%, mientras que la especificidad fue de 51% (kappa 0,55). La menor sensibilidad observada de AGID no es debido a reacciones falso positivas de ELISA y PCR, sino más bien a una mayor sensibilidad de estas últimas, lo que sugiere reconsiderar la utilización del método AGID en aquellos países en que aún se utiliza como método oficial en los programas de erradicación de leucosis.

Palabras clave: ganado, leucosis, ELISA, PCR.

INTRODUCCIÓN

La leucosis enzoótica bovina es una enfermedad infecciosa del ganado, causada por el virus de la leucosis bovina (VLB), un retrovirus de la familia Retroviridae (Van Regenmortel y col 2000). El VLB infecta principalmente a los linfocitos B (Ballagi-Pordani y col 1992), pero también posee la capacidad de infectar otras células, tales como linfocitos T (Stott y col 1991, Schwartz y col 1994) y monocitos (Domenech y col 2000). Una de las características de esta enfermedad es una respuesta humoral que dura toda la vida del animal (Burny y col 1988). La enfermedad se manifiesta con curso clínico lento, desarrollando un período de incubación de 1 a 5 años, por lo que afecta fundamentalmente a los animales mayores de 2 años de edad (Johnson y col 1985). El ganado infectado puede permanecer clínicamente asintomático durante toda su vida. Sin embargo, solo un 30-70% desarrolla linfocitosis persistente (LP), la que se caracteriza por una expansión policlonal de linfocitos B infectados. A su vez, un porcentaje incluso menor de animales (0,1-10%) eventualmente desarrolla tumores linfoides, que es la forma clínica fatal de esta enfermedad (Burny y col 1985).

La infección por VLB estimula una fuerte reacción inmune humoral en contra de las principales proteínas virales gp51 y p24 que constituyen la base para la detección mediante pruebas serológicas (Portetelle y col 1989). Dentro de éstas, la inmunodifusión en gel de agar (AGID) ha sido la prueba oficial en muchos países para la detección de anticuerpos contra VLB. Recientemente, se ha desarrollado y evaluado una serie de métodos enzimoinmunoensayos (ELISA), algunos de los cuales son actualmente reconocidos como métodos oficiales en EE.UU., Canadá y otros países (Simard y col 2000). Sin embargo, independiente del método serológico empleado, la principal desventaja de estas pruebas es su incapacidad para discriminar anticuerpos maternales pasivos de una infección activa, los que pueden persistir durante los primeros 6 meses de vida del animal (Burridge y col 1982). Además, estos métodos no proporcionan evidencia de la infección en su etapa temprana, esto es, antes de la seroconversión, que para esta enfermedad en particular puede tardar hasta 14 semanas en presentarse (Dinter 1989). En cambio, las pruebas de detección directa, como la reacción de la polimerasa en cadena (PCR), permiten un diagnóstico confiable en las etapas iniciales de la enfermedad y se pueden aplicar a la detección del virus en animales menores de 6 meses, evitando así reacciones falso positivas, causadas por la transferencia pasiva de inmunoglobulinas a través del calostro. Otra ventaja radica en la capacidad para detectar el virus en animales inmunotolerantes, los que no desarrollan una respuesta inmune normal (Fechner y col 1996).

Aunque con algunas discrepancias, diversos autores han demostrado una menor sensibilidad de AGID respecto de las pruebas diagnósticas ELISA y PCR (Eaves y col 1994, Fechner y col 1996, Trono y col 2001). Dado que diversos factores pueden afectar la concordancia entre estas pruebas, como la secuencia elegida como blanco para la amplificación y el método para purificar ADN en la PCR, el antígeno utilizado en los métodos serológicos o las características de la población animal en estudio, entre otros; el objetivo de este estudio fue comparar el método AGID que se utiliza en Chile frente a un ELISA indirecto comercial en muestras de suero y leche, y una prueba PCR anidado en linfocitos sanguíneos para la detección de la infección por el VLB.