Estudio comparativo de un PCR anidado, ELISA y AGID en la detección del virus de la leucosis bovina en muestras de suero, sangre y leche (página 2)

MATERIAL Y MÉTODOS

Obtención de las muestras biológicas y procesamiento. Muestras de leche, sangre y suero fueron recolectadas desde 126 animales de un predio de la Comuna de Freire, Temuco. Las muestras de leche (60 ml) se obtuvieron por ordeña manual en frascos conteniendo dicromato de potasio (0,1% p/v) como preservante. Las muestras de sangre se recolectaron en tubos Vacutainer de 7 ml usando EDTA-potásico (1,5 mg/ml de sangre) como anticoagulante, mientras que las muestras de suero se recolectaron en tubos Vacutainer de 10 ml sin anticoagulante. Las muestras de leche se descremaron mediante centrifugación por 10 minutos a 3.500 r.p.m. y la fracción clarificada se conservó a –20°C para su posterior análisis en nuestro laboratorio mediante ELISA, mientras que la fracción de células somáticas se utilizó para la extracción de ADN.

Aislamiento de ADN. El pellet de células somáticas correspondiente a 60 ml de leche se utilizó para la extracción de ADN de acuerdo a un protocolo estándar que consistió en una lisis celular (Tris-HCl, 10 mM pH 8,0; EDTA 1 mM, Proteinasa K 1 mg/ml y SDS 1%) e incubación a 55°C durante toda la noche. Los restos celulares se precipitaron y separaron mediante la adición de NaCl 6 M y centrifugación a máxima velocidad por 10 minutos. El ADN se recuperó finalmente de la fase acuosa mediante precipitación con etanol y se resuspendió en tampón T.E. Para las muestras de sangre se utilizó un procedimiento similar adicionando una etapa preliminar de hemólisis de los eritrocitos con una solución de NH4Cl al 0,85%.

Diagnóstico serológico. La detección de anticuerpos al VLB en las muestras de leche y suero se realizó mediante la técnica de enzimoinmunoensayo indirecto (ELISAi) empleando un kit comercial (SVANOVA, Suecia) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las lecturas espectrofotométricas se realizaron en un lector ELISA (Labsystems, Multiskan EX) a 450 nm y utilizando para la interpretación de los resultados una relación de densidad óptica corregida (DO muestra/DO control positivo) igual o superior a 6% para las muestras de leche y 10% para las muestras de suero. Una alícuota de las muestras de suero fueron enviadas al Laboratorio del Complejo de Lo Aguirre del SAG, para su análisis mediante el método oficial de AGID.

Diagnóstico viral mediante PCR. El virus se detectó directamente desde ADN purificado de la fracción de leucocitos de leche y sangre mediante un PCR anidado empleando dos pares de partidores correspondientes a una región altamente conservada del gen env viral (Beier y col 2001).

La primera reacción se realizó en un volumen final de 30 ml conteniendo 20-100 ng de ADN, 0,2 mM de cada partidor (F-TCTGTGCCAAGTCTCCCAGATA y R-AACAACAACCTCTGGGGAGGGT), 75 mM dNTP, 3 ml de tampón PCR 10X, (Promega), 1,5 mM MgCl2 y 0,75 U de Taq DNA Polimerasa.

En la segunda reacción se utilizó como templado 3 ml del producto de la primera amplificación y los partidores F-CCCACAAGGGCGGCGCCGGTTT y R-GCGAGGCCGGGTCCAGAGCTG G. Las amplificaciones se realizaron en un termociclador GeneAmp 9700 (Perkin Elmer) y los perfiles térmicos incluyeron una etapa de denaturación inicial a 94°C/5 minutos, seguido por 40 ciclos de 94°C/30 segundos, 57°C/30 segundos y 72°C/1 minuto, para terminar con una extensión final a 72°C/5 minutos. En la segunda reacción las condiciones fueron las mismas, excepto que la temperatura de annealing se aumentó a 68°C.

Análisis estadístico. Para determinar los parámetros de sensibilidad, especificidad y concordancia (valor kappa) se utilizaron tablas de contingencia (2×2) empleando el programa computacional Win Episcope 2.0. Todos los análisis se realizaron con un nivel de confianza de 95%.

RESULTADOS

La prueba AGID identificó un menor número de animales positivos que las pruebas de PCR en sangre, ELISA en suero y ELISA en leche (figura 1). De 126 animales analizados, AGID detectó 75 animales positivos, lo que equivale al 60% del total. Por otro lado, PCR detectó un 25% más de positivos que AGID (100/126). Tres animales positivos a AGID fueron negativos, según la prueba PCR en sangre, y 28 de las 51 muestras negativas a AGID fueron positivas a PCR (cuadro 1). La concordancia obtenida entre ambas pruebas fue de 75% mientras que el valor estadístico kappa fue de 0,45, considerándose moderado. La sensibilidad diagnóstica de PCR con respecto a AGID fue de 96% mientras que la especificidad fue de 45%.

 El método ELISA, aplicado tanto en suero como en leche, permitió detectar un total de 100 animales positivos (79%), lo que equivale a un 25% más de animales positivos que la prueba AGID (cuadro 2). Todos los animales positivos a AGID fueron también positivos a ELISA aplicado tanto en suero como en leche, mientras que 25 animales negativos a AGID fueron consignados como positivos a ELISA, en ambas muestras biológicas. De esta forma, la concordancia entre ambas pruebas fue de 79% con un valor kappa de 0,55 y los parámetros de sensibilidad y especificidad fueron 100 y 51%, respectivamente.

El mismo análisis se realizó considerando a la prueba PCR en sangre como el método de referencia y comparando a los métodos AGID, ELISA en suero y ELISA en leche (cuadro 3). En este caso, el valor kappa de 0,85 indica una concordancia casi perfecta, tanto en suero como en leche, entre las pruebas de PCR y ELISA (Landis y Koch 1977), manteniéndose la concordancia descrita en el Cuadro 1 para PCR y AGID.

DISCUSIÓN

En este estudio se evaluó el uso de un método de PCR anidado como prueba directa y los métodos AGID y ELISA como pruebas indirectas para la detección del VLB en un rebaño lechero con alta prevalencia de la infección. De acuerdo a nuestros resultados, el PCR en sangre y el ELISA en suero y leche detectaron un mayor número de animales positivos (25%) que AGID. Todas las muestras negativas a ELISA, tanto en suero como en leche, fueron también negativas a AGID. Sin embargo, tres muestras negativas a PCR fueron positivas a AGID y ELISA, situación que se podría explicar por la ausencia del VLB en linfocitos sanguíneos (Eaves y col 1994), una infección restringida a órganos linfoides (Klintevall y col 1994) o las variaciones de la secuencia nucleotídica de algunos aislados del virus, que podrían inducir a errores en la hibridación de los oligonucleótidos utilizados como cebadores, disminuyendo consecuentemente la sensibilidad del PCR (Marsolais y col 1994, Fechner y col 1997). Finalmente, no podemos descartar que, a pesar de haber utilizado una etapa de hemólisis y lavado de eritrocitos, persistan trazas de inhibidores que afecten la sensibilidad del PCR (Panaccio y Lew 1991).

En forma interesante, la prueba de PCR en sangre identificó tres muestras positivas, que, sin embargo, fueron negativas en las pruebas serológicas empleadas, sugiriendo la presencia de animales inmunotolerantes o con baja respuesta inmunológica al VLB en el rebaño analizado. Para clarificar esta situación, se re-muestrearon estos animales al año siguiente y se repitieron los análisis con las pruebas de ELISA en suero y PCR en sangre. Lamentablemente, uno de los animales había sido eliminado del predio; sin embargo, los otros dos aún permanecían por lo que fue posible repetir el análisis. El resultado de ambas muestras (datos no mostrados) fue similar al obtenido durante el primer análisis, es decir, ELISA confirmó el valor negativo obtenido anteriormente mientras que PCR confirmó el resultado positivo en ambos animales. Este resultado confirma los hallazgos realizados previamente por algunos autores (Fechner y col 1997), quienes habían sugerido la presencia de animales inmunotolerantes al VLB, observación que es siempre cuestionada al argumentarse que se debería a una mayor sensibilidad del PCR, lo que permitiría detectar animales infectados antes de que estos desarrollen una respuesta inmunológica, animales con una baja carga de exposición del virus (Kaaden y col 1982), animales cursando un período prolongado de latencia o a coinfecciones con otro virus (Jacobs y col 1992). De esta forma, estos resultados resaltan la importancia de incorporar en los programas de control y erradicación del VLB un diagnóstico complementario del virus con alguna técnica directa como puede ser PCR.

Cuando las pruebas de ELISA en suero, ELISA en leche y PCR en sangre fueron comparadas con respecto a AGID, el método oficial en Chile para el diagnóstico serológico del VLB, la especificidad diagnóstica obtenida fue baja (51, 51 y 45%, respectivamente). Sin embargo, esta situación no se debe a reacciones falso positivas de estas pruebas, sino más probablemente a la mayor sensibilidad de las mismas respecto a AGID (Eaves y col 1994). De la misma forma, la concordancia de las distintas pruebas empleadas, medida por el valor kappa, se puede considerar como moderado cuando AGID se utilizó como referencia. Estos resultados contrastan cuando se utiliza el PCR como método de referencia, ya que, en este caso, se obtuvo una buena concordancia casi perfecta de esta técnica con ELISA, con un valor kappa entre ambas pruebas de 0,85.

Nuestros resultados se comparan favorablemente con los resultados obtenidos por Fechner y col (1996) y más recientemente Trono y col (2001), quienes detectaron un total de 17,7 y 24,8% más de animales positivos al comparar un método de PCR con AGID, respectivamente. Sin embargo, contrastan con lo obtenido por Nagy y col (2003), quienes determinaron una sensibilidad del PCR respecto a ELISA de sólo un 67%, a diferencia de nuestros resultados, donde PCR fue muy similar en su capacidad para detectar animales positivos que el ELISA empleado (sensibilidad de 97%). En nuestro caso, el mejor resultado que se obtuvo con PCR se debería fundamentalmente a la adición, durante el proceso de extracción de ADN, de una etapa de hemólisis de los eritrocitos con NH4Cl, ya que está descrito el efecto inhibidor de residuos de hemoglobina sobre la Taq polimerasa (Panaccio y Lew 1991). Además, el PCR desarrollado por nosotros correspondió a un PCR anidado, lo cual aumenta la sensibilidad y especificidad del método. Otro factor importante y que puede afectar la correlación de ambas técnicas tiene que ver con el recuento de linfocitos y la carga de linfocitos infectados de los animales, aunque este dato se desconoce en cada uno de los estudios realizados.

Una de las ventajas del PCR es su capacidad para detectar el virus en terneros infectados que recibieron calostro desde madres seropositivas. Además, mediante PCR se pueden determinar infecciones recientes, entre 2-4 semanas más temprano que mediante AGID (Naif y col 1992, Kelly y col 1993) y puede constituir, por tanto, un gran aporte en los programas de erradicación, especialmente en aquellos rebaños con una baja prevalencia de animales infectados.

La prueba AGID en suero o el ELISA en suero o leche han sido reconocidas por la Organización Internacional de Epizootias (OIE) para el diagnóstico del VLB (OIE 2001). Debido a la simplicidad y sus ventajas prácticas y económicas, la prueba AGID ha tenido una rápida incorporación como método de diagnóstico oficial en muchos países. Sin embargo, la baja sensibilidad demostrada por nosotros y otros autores, sumado a la aparición de mejores herramientas de diagnóstico de la enfermedad, que permiten alcanzar mayores niveles de sensibilidad y especificidad, debieran hacer reconsiderar la utilización de esta prueba como método de diagnóstico oficial.

En conclusión, aunque la decisión de qué prueba utilizar para el diagnóstico del VLB va a depender finalmente de factores tanto técnicos como económicos, la principal conclusión es que el uso de ELISA o PCR en lugar de AGID permite detectar un mayor número de animales infectados por el VLB. Además, dada la probabilidad de encontrar animales inmunotolerantes, se recomienda utilizar una combinación de ELISA y PCR cuando el objetivo es erradicar la infección de un rebaño.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen el apoyo técnico brindado por Horacio Floody y agradecen además, la colaboración anónima y desinteresada del productor de la IX Región que facilitó el muestreo de sus animales.

REFERENCIAS

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