Dos Hongos Antagónicos (Trichoderma harzianum y Trichoderma viride) (página 2)

METODOLOGÍA

El trabajo comprendió dos fases: la Fase de campo; se realizó en una parcela del INIEA en el anexo Campo Verde del Km.44 (carretera Pucallpa – Lima). A una altitud de 270 msnm. Y la Fase de laboratorio; se llevó acabo en el laboratorio de Fitopatología de la Universidad Nacional de Ucayali. El trabajo se realizó entre los meses de diciembre 2004 a octubre del 2005. Para la evaluación se seleccionó el clon paund 7 y los tratamientos se distribuyeron en cuatro bloques y tres Tratamientos por bloque y cada tratamiento con nueve plantas; los tratamientos son los siguientes: Tratamiento 0 (T0); Testigo (sin inoculación de hongos antagónicos.), Tratamiento 1 (T1): Inoculación con Trichoderma harzianum. (Tha), Tratamiento 2 (T2): Inoculación con Trichoderma viride. (Tvi)

Características climáticas y edáficas de los sectores considerados para el estudio.

El lugar donde se ejecutó el trabajo de tesis pertenece al ecosistema mayor de Bosque Tropical semi siempre verde estacional (Cochrane, 1 982); La temperatura máxima promedio anual es de 31°C, la mínima de 19,3°C y la media de 25,2°C; la precipitación pluvial es de 1 560 mm/año; la humedad relativa es de 83,8%; la radiación solar oscila entre 4 – 7 horas de sol diaria y los vientos predominan del Norte a Sur con una velocidad de 1,7 m/s. (promedio de 16 años, de la Estación Meteorológica de la UNU), que incluye un periodo seco y otro lluvioso.

El terreno del área experimental está conformado por una terraza ligeramente ondulado, muestra un color pardo rojizo, ácidos (pH 4.5), altos en Al cambiables y bajos en NPK y materia orgánica, son descritos en términos de taxonómia de suelos como inseptisol, siendo su principal características la baja fertilidad natural y es medianamente drenado hasta los 20 cm. de profundidad.

Variables evaluadas. Al inicio se efectuó una evaluación de la incidencia y severidad, para determinar en que condición se encontraba el campo, luego de esta evaluación se eliminó los frutos enfermos con M. roreri, esto con la finalidad de comparar entre los tratamientos el progreso de la enfermedad. La evaluación del porcentaje de incidencia se realizó a los 60 días después de haber realizado la primera evaluación, continuándose cada 14 días hasta completar 10 evaluaciones. La incidencia de M. roreri se calculó de acuerdo la siguiente fórmula:

La severidad se calificó de acuerdo a la escala dada en grados de severidad establecido por Cárdenas y Giraldo (1 986). Determinándose posteriormente la severidad de acuerdo a la siguiente fórmula:

% de daño Grado

0 – Normal (sano) 1

1- 25 Protuberancia 2

26 – 50 Inicio de mancha 3

51 – 75 Mancha 4

76 – 100 Esporulación 5

Después de calcular la incidencia y la severidad estos datos fueron transformados a Arc.sen y respectivamente (Calzada Benza, 1 981).

Los hongos antagónicos, fueron comprados al Programa Nacional De Control Biológico Del Servicio Nacional De Sanidad Agraria (SENASA) en bolsas de 1 Kg, desarrollado en un sustrato de arroz, la dosis que se utilizó fue de 0.5 kg del sustrato en 15 litros de agua, la preparación del biopreprado consistió en una suspensión de esporas agregándole 50 ml de aceite agrícola de origen vegetal (93% aceite de maíz y 7% de emulsificante), este se diluyó en 15 litros de agua para su posterior inoculación en los tratamientos. Antes de cada inoculación se tomó una muestra para estimar cuantas unidades formadoras de colonia (UFC) se están aplicando lo cual se realizó en el laboratorio con la cámara de Neu bauer. Durante la investigación se han realizado 10 inoculaciones con intervalos de 14 días.

Tasa de progreso de la enfermedad y área bajo la curva de progreso de la enfermedad (ABCPE). Para obtener una mejor descripción del progreso de la enfermedad, los datos de intensidad de la enfermedad (incidencia y severidad) por unidad experimental fueron ajustados a la forma linearizada de los siguientes modelos epidémicos: monomolecular, logistico y gompertz. Para decidir el modelo de mejor ajuste, se eligió aquel que presento el coeficiente de determinación más alto (R²) los cuales se obtuvieron mediante el procedimiento de regresión lineal simple. Una vez seleccionado el modelo se procedió a comparar las tasas de incremento de la enfermedad en cada uno de los tratamientos.

Para comparar el efecto de los tratamientos, se empleo el área bajo la curva del progreso de la enfermedad (ABCPE) aplicando la ecuación propuesta por campell y madden

donde:

Yi= Proporción de la enfermedad en la enésima observación.

Xi= tiempo (días) en la enésima observación.

n = número de observaciones

Metodología De La Fase De Laboratorio.

Se aisló In vitro M. roreri y los hongos antagónicos, en placas Petri con medio de cultivo papa dextrosa agar (PDA), e incubados a 29 °C. La prueba de cámara húmeda se realizó tres veces en los tres tratamientos, la primera en la cuarta inoculación, la segunda en la novena y la tercera a los 45 días después de la última inoculación. También se evaluó la velocidad de crecimiento de los hongos en estudio que consistió en colocar en el centro de placas petri con PDA una rodaja de agar con el hongo de diámetro conocido (0.5 cm), luego se midió cada 24 horas hasta que el hongo llene la placa. Para este ensayo se utilizaron tres repeticiones por hongo. El efecto antagónico in Vitro consistió en cultivar M. roreri previamente en 12 placas petri con PDA; cuando este alcanzó un desarrollo del 60% en la placa (30 días después de la siembra) se colocaron dos discos en cada placa de agar de 0.5 cm. de diámetro con micelio de Tha (6 placas) y Tvi (6 placas), tomado de cultivos de 4 días después de la siembra e incubándose a 29 ºC. Para evaluar el antagonismo se consideró dos formas de control; la primera por competencia del sustrato donde un 100% de crecimiento de M. roreri en la placa Petri, significaba 0% de inhibición. La segunda por micoparacitación y producción de antibióticos; cuando existe parasitación por parte de los hongos antagónicos se observa micelios muertos y estos esporulan sobre M. roreri

Análisis Estadístico.

Los datos obtenidos tanto de incidencia y severidad, se procesaron utilizando el análisis de variancia bajo el diseño de bloques completamente al azar con tres tratamientos. Las diferencias estadísticas se discriminaron haciendo uso de la prueba de significación estadística de Duncan (p=0.05); éstos análisis estadísticos se realizaron a través del software SAS (1 997).

RESULTADOS

De la fase de campo.

Incidencia de moniliasis En el cuadro 01 se observa que la incidencia al inicio fue mayor del 90 por ciento en los tres tratamientos. La primera evaluación se realizó 60 días después de la limpieza del campo, donde la incidencia en el Testigo (T0) fue de 44.15 por ciento, en el T1: 47.04 por ciento y en el T2 47.25 por ciento. Después de 133 días de evaluación la incidencia en el T0 fue de 51.50 por ciento incrementándose en un 7.35 por ciento, mientras que en el T1. 25.54 por ciento y T2. 27.89 por ciento, reduciéndose la incidencia en estos dos últimos tratamientos en un 21.50 y 19.36 por ciento respectivamente por el efecto de los hongos antagónicos. Se observa que este resultado presenta diferencias significativas; el T0 con el T1 y T2; mientras que entre T1 y T2 no muestran diferencias significativas. Así mismo el T0 presento 13.9627 ABCPE que fue mayor en relación al T1 y T2 con 7.5290 y 7.966 ABCPE respectivamente.

Cuadro 1. Porcentaje de Incidencia de moniliasis en los tratamientos

I.I.T; Incidencia al inicio del trabajo.

I.I.I.; Incidencia al inicio de la inoculación de los hongos antagónicos (60 días después de instalado)

I.F.E; Incidencia al final de las evaluaciones.

1/ Datos transformados a Arc. Sende los I.F.E.

2 /Promedio seguido por la misma letra en cada columna no difieren significativamente entre si; por la prueba de Duncan (P= 0.05)

3/ Estimada utilizando el promedio de Logit. ABCPE: área bajo la curva del progreso de la enfermedad.

En el Gráfico 01 y 02 se observa que la incidencia en el testigo se incrementa en forma lenta y presenta progreso de la enfermedad positivo por que tiende a incrementarse, mientras que en el T1 y T2 la incidencia se redujo y se observa una tendencia a seguir disminuyendo y debido a esto la curva de progreso de la enfermedad es negativo.

Severidad de moniliasis. En el cuadro 3 se observa que los tratamientos T0, T1 y T2 antes de realizar la limpieza del campo fue de, 84.44, 88.53 y 86.49 por ciento respectivamente; mientras que al inicio de las inoculaciones de los hongos antagónicos (60 días después de la limpieza del campo), la severidad en los tratamientos T0, T1 y T2 fue de 32.60, 32.17 y 32.19 por ciento respectivamente y la severidad al final de las evaluaciones fue de 37.20, 26.40 y 27.00 por ciento en los tratamientos T0, T1 y T2 respectivamente. Donde la severidad en el testigo aumentó 4.6 por ciento, mientras que en el T1, T2 se redujo los porcentajes en un 5.77 y 5.19 por ciento respectivamente. Además se observa que los tratamientos en estudio, difieren estadísticamente en cuanto al porcentaje de severidad, donde el T1 y el T2 bajo un nivel de significación p=0.05, se comportaron estadísticamente diferentes al testigo. En cuanto ABCPE el T0 presento 13.8495, mientras en el T1 y T2 presento un ABCPE de 10.2128, 10.4480 respectivamente. En el ABCPE se observa que el T1 y T2 no difieren estadísticamente, observándose que ambos presentan diferencias significativas con el testigo.

Cuadro 03: Porcentaje de Severidad de moniliasis en los tratamientos. Pucallpa, Perú, 2 005.

S.I.T; Severidad al inicio del trabajo.

S.I.I.; Severidad al inicio de la inoculación de los hongos antagónicos (60 días después de instalado).

S.F.E; Severidad al final de las evaluaciones.

1/ Datos transformados a Arc. Sende los D.F.E

2/ Promedio seguido por la misma letra en cada columna no difieren significativamente entre si; por la prueba de Duncan (P= 0.05)

3/ Estimada utilizando el promedio de Logit. ABCPE: área bajo la curva del progreso de la enfermedad.

En el gráfico 2;A y B se muestra los valores del porcentaje de severidad cuantificado semanalmente a partir de la inoculación de los hongos antagónicos en cada uno de los tratamientos fueron graficados a través del tiempo, obteniéndose la curva del comportamiento de cada tratamiento.. En el gráfico 02.B Se observa que el T0 presenta un progreso de la enfermedad positivo por que tiende aumentar la enfermedad en el tiempo, mientras en el T1 y T2 la curva del progreso de la enfermedad es negativo por que disminuye el %Severidad.

Fase de laboratorio.

Del conteo de UFC, el producto comprado presentó un promedio 34.3 x 107 UFC por gramo y la concentración promedio utilizado en cada inoculación fue 2.3 x 107 UFC por ml. En la prueba de cámara húmeda se han observado los siguientes resultados: primero; frutos con síntomas M. roreri esporulan normal (ver figura 01. A1), segundo; los frutos con síntomas de M. roreri, solamente presentan el estado de mancha y posteriormente entra a un estado de descomposición y no esporulan (ver figura 01. A2). Y tercero; los frutos con síntomas de M. roreri esporulan normal y luego de dos a tres días se observa a T. hazianum parasitando (ver Figura 01. A3).

Los resultados observados en las cámaras húmedas, también se presentaron en el campo, como frutos que no esporulaban y que solo presentaban el estado de mancha de M. roreri y también se ha observado parasitismo (ver figura 02. B). y algunos frutos que presentaban el estado esporulación de M. roreri, empezaron a reducir el área de esporulación hasta quedar completamente sin área de esporulación y descompuesto (Ver figura 02. B1, B2, B3). En cuanto a la Velocidad de crecimiento, Tha y Tvi presenta mayor velocidad de crecimiento, llenando las placas Petri en 4 días de incubación, mientras M. roreri a los 4 días de incubación presentó un radio de crecimiento de 3.7 mm y con esta velocidad de crecimiento llenó la placa Petri en aproximadamente 50 días de incubación.

En el efecto Antagónico in vitro se pudo comprobar la agresividad de Tha, que resultó notablemente superior pues no solo mostró inhibir el crecimiento al 100% de M. roreri sino además, luego de producirse el contacto entre ambos hongos, colonizó el micelio del patógeno creciendo en toda la zona ocupada por él y esporulando en forma abundante.

En la figura 3, se observa el cultivo dual entre M. roreri y Tha, donde este crece por encima del micelio de M. roreri hasta llenar la placa Petri en 72 horas, sin esporulación alguna sobre él y que a simple vista no se observa el parasitismo, pero al realizar las observaciones de las placas en el microscopio estereoscopico se notó que Tha había colonizado por completo a M. roreri. Después de 7 días de haber empezado la colonización de Tha, esté empezó a esporular sobre él (ver figura 4). Y al cabo de 28 días de evaluación los micelios M. roreri estaban completamente secos y muertos.

Con el fin de complementar las observaciones macroscópicas antes descritas, en este ensayo también se realizaron observaciones microscópicas de los cultivos duales, el examen microscópico de las hifas de Tha en la zona de la interacción reveló que existen interacciones hifales, lo que estaría demostrando un comportamiento parasítico de esta cepa de Tha sobre M. roreri. Se observó que normalmente las hifas de Tha crecieron en forma paralela a las de M. roreri y que cada cierto intervalo se conectaban a ellas con pequeñas ramas semejantes a apresorios (figura 5A, B). También se visualizó un crecimiento de tipo envolvente de las hifas de Tha sobre las de M. roreri (figura 5 C), enrollándose en ellas indistintamente en forma suelta o apretada.

En la figura 06 se observa el cultivo dual de T. viride y M. roreri Donde Tvi inhibió el crecimiento de M. roreri en un 99% y se formó una línea de contacto notorio entre los micelios, rodeando al hongo en la mitad de la placa Petri, no se observó parasitismo hacia M. roreri, al final de las evaluaciones este murió por inanición.

DISCUSIÓN

De Fase de campo.

Incidencia y Severidad de moniliasis

Como se observa en los gráficos 1 y 3 la curva presenta un decline en los tres tratamientos a los 49 días de haberse iniciado las evaluaciones (cuarta inoculación de los hongos antagónicos), esto debido a que se observaron mazorcas con síntomas de moniliasis pero con ciertas características peculiares que estos no llegaban a la fase de esporulación y que no lo registrábamos como frutos enfermos por que solamente presentaban manchas oscuras limitadas, ligeramente hundidas que son característicos de M. roreri las cuales según Hernández y Ríos (1 991) estas manchas en menos de 15 días y de acuerdo a las condiciones de humedad y temperatura, se cubren de micelio y conidias de color blanco, pero sin embargo en este caso las mazorcas después de quince días no se cubren de micelio y sigue en el estado de mancha hasta descomponerse. Lo que posiblemente haya sucedido es que M. roreri se quedó sin sustrato para colonizar ya que Trichoderma puede desarrollarse en un amplia gama de sustratos y un rápido crecimiento y desarrollo, aparte de esto produce una gran cantidad de enzima inducibles con la presencia de hongos fitopatógenos (Tronsmo, 1 998).

En el cuadro 1 y 3 se observa que el testigo (To) al inicio presentó 44.15 y 32.6 por ciento de incidencia y severidad respectivamente y al final de la evaluación 51.23 y 36.40 por ciento de estos mismos parámetros; lo que indica un incremento de un 7.08 y 3.8 por ciento respectivamente en los 133 días de evaluación. Y según Munive (1 986), el ciclo biológico de M. roreri, desde que la conidia se posa en la mazorca, germina, penetra hasta la aparición de la necrosis externa y esporulación comprende de 45 – 90 días y considerando que estas plantas de cacao son clones muy susceptibles al ataque de moniliasis y que la condiciones climáticas fueron favorables como se observo en los gráficos 1 y 3, como para que la incidencia y severidad sea mayor del 80 por ciento en el testigo, y que al final solo presento una incidencia y severidad de 51.23 y 36.40 por ciento respectivamente. Este resultado solamente se puede explicar debido a la distribución de los tratamientos dentro de las parcelas, que estuvieron muy cerca uno del otro, donde las UFC fueron dispersadas a las hacia el To, esto quedo demostrado por que se han encontrado mazorcas con síntomas de control (antes descritas) y debido a este factor el progreso de la enfermedad en el To es baja. Esta dispersión de UFC no solo afectó al testigo sino también a los demás tratamientos, existiendo incluso una simbiosis mutualista de T. harzianum y T. viride para colonizar a M. roreri.

El Testigo presenta un mayor progreso de la enfermedad en relación al T1 y T2, así como el ABCPE, esto debido a que la enfermedad aumentó durante la evaluación, mientras que en el T1 Y T2 el ABCPE es menor en relación al testigo, este resultado se debe a la acción de los hongos antagónicos aplicados.

Fase de laboratorio.

Conteo de unidades formadoras de colonias. Según Tronsmo (1 998), los productos a base de este hongo deben aplicarse en un mínimo de 1.x 107 UFC por gramo o mililitro, en este trabajo se ha usado un producto sólido que supera 34 veces la concentración mínima que es 34.3 X 107 UFC por gramo. Según el Programa Nacional de Control Biológico del SENASA 2 004, la dosis para un ataque severo de una plaga es un 1 kilo de hongo antagónico diluido en 50 Lt de agua (1.38 x 107 UFC por ml). En este trabajo de investigación se ha utilizado una dosis de 1 kilo hongo antagónico diluido en 30 Lt de agua, lo que significa un promedio de 2.3 x 107 UFC por ml, con la finalidad de inundar las parcelas, para obtener algún efecto antagónico.

Prueba de cámara húmeda. De la figura 01 A2, Mont (2 002) menciona que Trichoderma sp tiene una alta capacidad de competencia por el sustrato, como consecuencia de ello, el organismo afectado tiende a entrar en un estado de latencia que podría ser por deficiencia de nutrientes o la presencia de cierto nivel de sustancias inhibitorias, lo cual impide que M. roreri llegue a esporular.

En la figura 01 A3, se observa la micoparasitación a M. roreri. Y Harman (2 001) reporta varios mecanismos antagónicos entre ellos menciona el micoparasitismo que es el fenómeno por el cual un hongo parásita a otro y cubren una gran cantidad de eventos en este tipo de interacción, donde Tha produce una gran cantidad enzimas capaces de hidrolizar paredes celulares de numerosos hongos, además Ezziyyani M. 2 004 menciona que presenta una gran adaptabilidad a diferentes temperaturas de medio ambiente pudiendo crecer y reproducirse normalmente hasta los 35 ºC. De la figura 02 B, el área de esporulación de M. roreri se reduce hasta quedar completamente descompuesto. Ezziyyani, (2 004); menciona que Tha tiene capacidad de reducción y destrucción de colonias de patógenos debido a que produce un tipo de enzima llamada β-1,3 glucanasa, que es una enzima hidrolνtico, que al aumento del nivel de está enzima juegan un importante papel en el micoparasitismo.

Prueba in Vitro del efecto antagónico En la figura 03 y 04 se observa la paracitación de Tha a M. roreri y en este proceso de destrucción según Harman, G.E. & Kubicek, C.P. (1 998) intervienen una gran cantidad de enzimas que son capaces de segregar sustancias antibióticas. Y Ordóñez, V.H. (2 000) menciona que Tha produce sustancias como Trichodermina, Dermadina, Sequisterpeno, Suzukacillina, Alamethicina, richotoxina y Acetaldehido, todas con propiedades antifungosas y antibacteriales; así como las enzimas β-1,3 glucanasa, quitinasa y celulasa los cuales facilitan la habilidad del antagonista para atacar un amplio rango de patógenos ejerciendo su efecto sobre las paredes celulares. En este proceso de micoparacitación se ha observado microscópicamente que existían interacciones hifales (ver figura 5), donde Tha crece en forma paralela a M. roreri y que cada cierto tiempo se conecta mediante ramas semejantes a apresorios, también se han visualizado un crecimiento tipo envolvente de las hifas de T. harzianum sobre las de M. roreri. Estas interacciones hifales observados también son mencionadas por otros autores como Montealegre (1 990) que hace mención sobre este tipo de contactos hifales entre T. harzianum y Sclerotium rolfsii Sacc. Ezziyyani M. (2004), ha observado hifas de T. harzianum enrollando a Phytophthora capsici impidiendo su crecimiento.

Trichoderma viride no tiene capacidad para parasitar a M. roreri como se observa en la figura 06, pero presenta una alta actividad competitiva frente al patógeno, lo que tiene importancia especialmente en la fase saprofita de M. roreri, al impedirle su desarrollo en el mismo sustrato. Mont (2 002) menciona que el éxito de los antagonistas en la planta puede también ser gobernada por su capacidad de colonizar y utilizar los sustratos en la superficie de la planta, permitiendo que compita efectivamente con los patógenos. Además Lieckfeldt, & Nirenberg, (1 999) mencionan que Trichoderma viride produce enzimas como viridin, trichodermin, exo y endogluconasas celobiasas, y quitinazas y el compuesto 6-pentyl-α – pyrone (6PAP) que es un antifϊngico, estos y otras enzimas tienen efecto fúngico y puede parasitar Rizoctonia solani, Sclerotium rolfsi, Pythium sp, Phytohpthora parasítica.

CONCLUSIONES

Se concluye que:

• Existe el efecto antagónico de Trichoderma harzianum y Trichoderma viride sobre Moniliophthora roreri causante de la pudrición acuosa de la mazorca del cacao.
• Trichoderma harzianum es una agresivo antagonista que tiene la capacidad de inhibir su crecimiento así como de micopárasitar a Moniliophthora roreri.
• Trichoderma viride presentó una alta capacidad de competencia por el sustrato, como consecuencia de ello, el organismo afectado tiende a iniciar un estado de latencia que podría ser por deficiencia de nutrientes o la presencia de cierto nivel de sustancias inhibitorias.
• La simbiosis de las cepas de Trichoderma utilizados han favorecido en, la reducción de la incidencia de moniliasis se reduzcan en el campo, esto debido por las características de control antes descritas.
• T. harzianum y T. viride presenta adaptabilidad al clima de la región.

RECOMENDACIONES

De los resultados de este trabajo se desprenden las siguientes recomendaciones:

1. Para obtener mejores resultados de control se recomienda inocular las mezclas de las cepas de Trichoderma utilizado (T. harzianum y T. viride), esto por que ambos tiene diferentes formas de control.
2. La inoculación de los hongos antagónicos en el campo, se debe realizar en las tardes para obtener mayor germinación de las UFC en las mazorcas con síntomas de M. roreri.
3. Realizar investigaciones de diferentes dosis y frecuencias de aplicación así como evaluar el control cultural (basado en el recojo de frutos enfermos) y los fungicidas frente a los hongos antagónicos
4. Que las tratamientos estén mas distanciados entre si para no tener problemas de que los hongos antagónicos afecten al testigo.

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Wagner G. Verde Bedoya

Tesista

Eliel Sanchez Marticorena

Asesor. Profesor principal de la Fac. Cs. Agropecuarias Universidad Nacional de Ucayali –Perú