La precisión, exactitud, simplicidad y todas las demás características del RIA, no pudieron ser igualadas por otras técnicas que se intentaron en el año 1959.El principio del RIA era inmediatamente aplicable a las hormonas peptídicas y no peptídicas existiendo una gran sensibilidad y resultados reproducibles. El RIA es aplicado ampliamente en el campo de la endocrinología clínica para medir las hormonas con mucha precisión.
La luminiscencia ha sido conocida aproximadamente desde 1667, la existencia de la bioluminiscencia fue reconocida por Boyle en Alemania, la describió como luz caliente. En 1887, Rad Ziszewki descubrió algunos componentes químicos que tienen propiedades luminiscentes.
En 1928, Abrech descubrió las propiedades del luminol un componente el cual cuando se oxida por medio de peróxido de hidrógeno emite luz como fotones individuales. Mientras es recordado que los soldados japoneses en la segunda guerra mundial hicieron uso de esto, mezclando bioluminiscencia de crustáceos, amasados con saliva como fuente cruda de la luz para leer mapas en la noche.
El potencial para aplicaciones analíticas no fue reconocido hasta 1947 cuando apareció la luciferasa y en 1952 Etrehler y Totter publicaron una aplicación analítica específica de la luciferasa en un ensayo para adenosin trifosfato (ATP).
El primer ensayo de quimioluminiscencia fue descrito en 1976 con un reporte de Schroeder et. al.; reportaron el desarrollo de un ensayo quimioluminiscente, este ensayo utilizó como indicador el isoluminol, éste requiere la adición de un catalizador para que la reacción de emisión de luz ocurra.
Considerable interés se creó en otras moléculas quimioluminiscentes con los reportes de Mc. Capra, Woodhead, Weeks, Schroeder y otros. En 1978 se hicieron reportes de muchas publicaciones sobre el uso de otro indicador quimioluminiscente llamado éster de acridina que ha causado incremento en el interés y aplicación de esta metodología.
El éster de acrinina, no requiere la adición de un catalizador para que ocurra la reacción de emisión de luz, en contraste con la base del sistema de luminol, en donde una amplia variedad de especies químicas pueden influenciar la reacción.
Las reacciones químicas que emiten luz y las reacciones biológicas tienen un diverso rango de aplicaciones pero muchas no han sido adoptadas para la rutina de los laboratorios clínicos. Las ventajas de la quimioluminiscencia en los ensayos incluyen sensibilidad (límites de detección de moles, nanogramos, picogramos) y velocidad (señal generada en unos pocos segundos y en algunos casos estable por varias horas), sin residuos peligrosos, y procedimientos simples. La mayoría de las aplicaciones son en inmunoensayos, marcaje de proteínas, ensayos en moléculas de DNA. Las moléculas quimioluminiscentes investigadas marcadas incluyen el luminol, isoluminol, ésteres de acridina, tioesteres y sulfaminas, y ésteres de fenantreno. En bioluminiscencia, una reacción química mediada por enzimas es responsable por la excitación, y esta reacción es siempre emparentando a organismos vivos.
En 1976, una tecnología semiautomatizada para ensayos de captación fue descrita al usar isoluminol como el indicador con el requerimiento de la adición de un catalizador para que la emisión de luz ocurra. Con este método semiautomatizado esta compañía ofrece los inmunoensayos utilizando la tecnología de quimioluminiscencia. Aquí la oxidación de éster de acridina ocurre rápidamente, con un pico de emisión de luz en un segundo.
Desde 1983, los métodos de Quimoluminiscencia y Bioluminiscencia han sido desarrollados con varios marcadores de enzimas tales como fosfatasa alcalina, glucosa 6 fosfato deshidrogenasa, peroxidasa del rábano, la luciferasa de la renilla, y la xantina oxidasa. En estos últimos años se introdujeron al mercado de la comunidad científica inmunoensayos, los cuales consistían en una fase sólida como método de separación. Éste grupo de ensayos usan partículas paramagnéticas (PMP) como fase sólida. La separación es perfeccionada al colocar los tubos en una banda magnética. Ambas fracciones ligadas se agregan en el área magnética y la fracción libre es decantada, eliminando la necesidad de centrifugación.
Ciba Corning fue el primero en ofrecer inmunoensayos utilizando esta tecnología quimioluminiscente con el equipo Magic Lite semiautomatizado. La compañía abbot crea el Axsyn totalmente automatizado, la compañía Sanofi Pasteur crea el sistema Access, totalmente automatizado también. La compañía Ciba corning (ahora llamada Bayer) no se queda atrás y crea el sistema ACS 180 totalmente automatizado, de ahí el ACS plus con capacidad de más pruebas después crea el Centauro otro equipo también automatizado pero con mayor capacidad y velocidad. Todos ellos utilizando la tecnología de quimioluminiscencia.
El RIA es un sistema que está relacionado con la cuantificación in vitro de trazas de sustancias no hormonales y hormonales existentes en la sangre y otros líquidos corporales.
El RIA aprovecha la respuesta inmunitaria para obtener anticuerpo específico y sensible por lo que se puede usarse en la determinación de cualquier compuesto capaz de actuar como inmunógeno que induzca la producción de anticuerpos en animales.
El RIA es una técnica analítica de referencia con calidad incomparable, además son un sin número de pruebas y aplicaciones que se pueden realizar mediante este.
El procedimiento del RIA funciona de esta manera: a una sustancia X marcada radioactivamente (X+) que es el antígeno, que reacciona con el anticuerpo específico fijándose aproximadamente un 70% de X+. Diversas cantidades conocidas de X no marcada son añadidas a la mezcla X+ anti-X, estableciéndose una competición por la unión del antígeno con el anticuerpo que va a ser regido por la ley de acción de masas. Después de una incubación, X+ que se encuentra fijada al anticuerpo, es separada de X+ libre. De la cantidad de X+ fijada a diferentes concentraciones se hace una curva que permite encontrar cualquier concentración de X que sea desconocia.
El isótopo más utilizado para marcar hormonas es el I125, I131. Son usados en el marcaje de hormonas esteroides y drogas. La vida media es de 60 días y de 8 días respectivamente.
Los medios de separación que utiliza el RIA son: separación cromoelectroforética, cromatografía, difusión en gel, electroforesis en el papel o acetato de celulosa, absorción, proteína A-estafilococcica. Estos medios separan de la hormona libre y del complejo, eliminando la presencia de sustancias no específicas y no alterando el equilibrio antígeno anticuerpo conseguido en la incubación, son rápidos, cómodos y baratos. Las automatizaciones han disminuido el error inherente de las técnicas manuales como lo era la influencia de la temperatura, medio ambiente iónico, el pH, la presencia de varios contaminantes que pueden interferir o degradar una molécula o su porción radiactiva del componente del componente final del sistema RIA será la separación de la fracción marcada ligada al complejo y la fracción que se encuentra libre, seguida por la cuantificación de la actividad de ambas fracciones ya sin interferencia por la automatización.
El RIA es una técnica de análisis en el que una pequeña cantidad de sustancia marcada radioactivamente, es desplazada de su unión específica por otra similar no marcada que va a competir con la sustancia marcada radioactivamente
Al sistema de fijación elegido se le agrega una cantidad x de antígeno marcado, posteriormente se le agrega una cantidad x de antígeno sin marcar o sea el suero problema, así se establece la competencia por los sitios de unión del anticuerpo, sigue la incubación a 37 grados Celsius, procediendo a los lavados mediante los cuales se realiza la separación del antígeno unido y del libre, de la cantidad de antígeno marcado fijado a diferentes concentraciones se hace una curva que permite encontrar cualquier concentración de antígeno no marcado que sea desconocido.
Reactivos de análisis.
Es necesario contar con una forma muy purificada del antígeno en cuestión para el marcaje. Las formas menos purificadas de antígeno no pueden servir perfectamente para usar como inmunógeno y estándar. Los requerimientos de pureza del material a marcar son muy estrictos, porque en última instancia lo que se mide es la radioactividad. Si ésta última se asocia en grado significativo con especies moleculares ajenas a la que va a medirse, en ese grado el análisis será no específico y quizás inútil. Por otra parte, siempre que el antígeno sea inmunógeno puede estar contenido en una mezcla relativamente muy impura, pues la especificidad de la inhibición de unión observada depende exquisitamente de la pureza de la especie marcada con ligando presente. El requerimiento más crítico del ligando a usar como estándar es un análisis es que se comporte en el sistema de análisis en forma idéntica al comportamiento del ligando de interés en el líquido biológico analizado. También un agente de unión con características apropiadas es indispensable para un buen análisis. Para sustancias de peso molecular bajo, especialmente aquellas en las que puede introducirse tritio por vías biosintéticas en niveles muy altos de actividad específica, este isótopo puede ser apropiado para usar en análisis de unión competitiva, aunque el marcador de elección es el I125, la vida media es de alrededor de 60 días y permite gran actividad específica pero no requiere uso inmediato de análisis. Para la elección del agente de unión se tiene que tomar en cuenta diversos factores. Si el ligando en cuestión es un inmunógeno potente, la producción de antisuero puede no ser difícil y éste puede ser el método de elección. Si hay interés especial en medir la porción biológicamente activa de un grupo heterogéneo pero estrechamente relacionado de moléculas, un análisis radiorreceptor que emplea un receptor tisular puede ser el método de elección. Casi todos los análisis de unión competitiva son satisfactorios con valores de pH aproximados de 7.0 a 8.6 pero hay excepciones, y cuando se emprende un análisis es conveniente hacer por lo menos un experimento de dependencia del pH para asegurarse de que no habrá pérdida de tiempo experimental siguiente. También
se necesitan diversas sustancias recolectoras o limpiadoras que se emplean para saturar y limpiar sitios de absorción física y minimizar las pérdidas de reactivos críticos en plástico o vidrio. También se debe incluir los inhibidores de proteasa para eliminar la susceptibilidad de glucagón y ACTH a las proteólisis por enzimas normalmente presentes en el plasma.
En los servicios de medicina nuclear se han realizado técnicas de RIA desde su instauración, ya que en ellos ha existido la instrumentación necesaria, los especialistas calificados y, además, acreditan la condición de instalación radiactiva como imperativo legal imprescindible para la utilización de isótopos radiactivos.
Los especialistas en medicina nuclear y la acreditación docente para los hospitales que pueden impartirla exige la existencia de laboratorios en los servicios de esta especialidad médica, en los que se deben realizar técnicas de RIA.
La luminiscencia es definida como la emisión de luz asociada con la disipación de energía con una sustancia electrónicamente excitada.
Si los electrones de un componente luminiscente son estimulados por una luz en estado normal, estos dan energía en forma de luz cuando ellos regresan al estado.
Tipos de luminiscencia.
Hay diferentes formas de luminiscencia, distinguiéndose por el mecanismo que causa la
En fotoluminiscencia también conocida como fluorescente la sustancia es estimulada por fotones de luz, la emisión de la luz con un trazador fluorescente es diferente.
En bioluminiscencia, una reacción química medida por enzimas es responsable por la excitación, y esta reacción está siempre emparentada a organismos vivos.
En quimioluminiscencia, la emisión de luz es causada por los productos de una reacción específica química, en la cual se involucran las siguientes sustancias según el sistema automatizado que sea utilizado: éster de acridina, peróxido-ácido, hidróxido de sodio, fosfatasa alcalina. En el caso de esta reacción el agente quimioluminiscente es el éster de acridina que es oxidado por el peróxido-ácido y el hidróxido de sodio.
Es la cuantificación de una sustancia, utilizando una reacción antígeno anticuerpo, un marcador como indicador de la reacción que puede se el éste de acrinina u otro. Que en combinación con los reactivos: peróxido-ácido e hidróxido de sodio, en contacto con la muestra y el analizador proporcionan la reacción quimioluminiscente. El peróxido-ácido provee el agente oxidante para el éster de acridina. El hidróxido de sodio, proporciona el cambio de pH necesario para que la reacción de oxidación ocurra.
La emisión de luz es causada por los productos de una reacción química específica, involucran. Los ensayos de separación y no separación que han sido proyectados, han sido basados en la con la marcación de éster de acridina. La combinación de las propiedades de aplicación de una enzima y una reacción de detección usando quimiluminiscencia o bioluminiscencia proporciona una alta sensibilidad analítica.
Los sistemas que la llevan a cabo esta reacción fueron especialmente diseñados para realizar inmunoensayos de una automatizada con tecnología de vanguardia como lo es la quimilumiscencia, método de lectura con mayor sensibilidad en la actualidad la cual se basa en el principio de emisión de energía luminosa a través de una reacción química (Enzima – Sustrato). La gama de pruebas que conforman su menú permite realizar diferentes perfiles de casi todas las áreas del laboratorio clínico, empleando reactivos de alta calidad que permiten obtener resultados muy confiables.
En la luminiscencia, el antígeno en la muestra del paciente compite covalentemente unido a las partículas paramagnéticas para limitar los sitios sobre al anticuerpo marcado con éster de acridina. Una relación inversa existe entre la concentración del anticuerpo unido marcado al antígeno, y el antígeno en la muestra del paciente.
El ensayo CLIA es de tipo sándwich, el cual el antígeno en la muestra del paciente es sometido en la reacción sándwich, el anticuerpo covalentemente unido a las partículas paramagnéticas y el anticuerpo marcado con éster de acridina. Una relación directa existe entre la concentración de antígeno en el muestra del paciente y la cantidad de luz emitida durante la oxidación de el éster de acridina en la cubeta.
Para cuantificar el antígeno en la muestra, el sistema inyecta automatizado un reactivo 1 y después el reactivo 2 en las cubetas conteniendo la mezcla de reacción. Esto dispara la reacción que resulta en la emisión de fotones de luz. El fotomultiplicador (PMT), un fotodetector, detecta los fotones de luz emitida y los convierte en pulsos eléctricos. Los sistemas cuentan estos pulsos eléctricos, leen y los resultados comparando con una curva maestra definida para cada ensayo, calculando la concentración.
A continuación se mencionan algunas características y beneficios generales de estos sistemas:
- Los inmunoensayos por quimioluminiscencia evitan los desechos tóxicos y los resultados que se obtienen son equiparables con Radioinmunoanálisis.
- Estos sistemas cuentan con refrigeración integrada (menos el ACS 180 plus de Bayer) conservando los reactivos en buen estado con el mínimo de manipulación por parte del operador, evita la necesidad de reinicializar el equipo para las pruebas con lo que se puede disponer del equipo en cualquier momento.
- También pueden trabajar directamente con tubo primario en el cual se recolecta la sangre sin necesidad de copas especiales.
- Cuenta con lector de código de barras para identificar muestras y reactivos permitiendo un mejor control de los mismos evitando confusiones y disminuyendo el tiempo de programación.
- Estos equipos trabajan al menos 5 perfiles de pruebas a una misma muestra sin necesidad de medir o de montar 5 veces la misma muestra lo que disminuye considerablemente el tiempo de trabajo de rutina en el laboratorio.
- Capacidad para trabajar de urgencia sin interrumpir el trabajo ya programado en proceso obteniéndose el resultado de la urgencia en el mínimo de tiempo independientemente de las otras muestras programadas.
- Cuentan con acceso continuo de muestras y reactivos necesarios en forma constante sin necesidad de interrumpir el trabajo que se está realizando y así, disminuye y optimiza el tiempo de trabajo de rutina.
- Tienen capacidad en el refrigerador para 24 reactivos diferentes permitiendo realizar 24 pruebas de manera simultánea a una sola muestra.
- Todas las pruebas se realizan bajo el mismo principio facilitando con lo cual no importa el orden o tipo de prueba que se le programe a las muestras.
- El rango de tiempo para la obtención de los resultados de los perfiles va de 15 a 50 minutos, por ejemplo: un perfil tiroideo se obtiene en 20 o 40 min., perfil ginecológico igual, un VIH en 20 minutos, una GCH en 17 minutos, etc.
- La estabilidad de las calibraciones es de 28 días optimizando el costo por prueba (no en todas las pruebas por ejemplo ácido fólico en el sistema ACS 180 la calibración dura sólo 24 horas). Así mismo la estabilidad de los reactivos va de 8 a 12 meses.
- Tiene capacidad para procesar 60 muestras simultáneamente con opción a seguir programando por medio del software del sistema, el cual reporta los horarios exactos para la obtención de los resultados.
- tienen disponibilidad de procesar 294 pruebas sin intervención del operador e incubar 60 pruebas al mismo tiempo creando horarios exactos para cada prueba. Por lo tanto optimizan los tiempos de rutina.
- Los sistemas cuentan con detección ultrasónica para las muestras y reactivos facilitando la planeación del trabajo y requerimientos.
- Asimismo, los equipos monitorean la cantidad de reactivos disponibles a bordo del sistema suministrando datos importantes para la estadística interna del laboratorio.
- El sistema reporta los resultados tanto de muestra impresa como en pantalla y se puede consultar momento aunque se encuentre trabajando. Se puede obtener de la memoria resultados de días anteriores ya que posee una memoria para 100 resultados.
- Las curvas de calibración pueden ser consultadas en cualquier momento y obtener su reporte impreso, lo que constituye un soporte para la confiabilidad de los resultados.
Los sistemas cuentan además con una función especial para el control de calidad de todas y cada una de las pruebas que realiza con la posibilidad de obtener un reporte impreso diario, semanal, mensual, por lotes de reactivos de manera específica, etc., así como la curva de levey-Jennins y datos estadísticos correspondientes.
Estas y otras características y ventajas más ofrecen estos sistemas para la realización de este tipo de ensayos dentro del laboratorio clínico.
MENÚ DE PRUEBAS PARA LOS SISTEMAS ANTES MENCIONADOS
El menú de pruebas para estos sistemas se encuentra en continuo crecimiento y las pruebas que se mencionan a continuación podrían variar de sistema a sistema:
Perfil Tiroideo Perfil ginecológico
TSH BHGC
T4 Total LH
T4 Libre FSH
TU uptake Prolactina
T3 Total Progesterona
T3 Libre Estradiol
Alergia Marcador metabólico
IgE Cortisol
Perfil de anemia Enfermedades infecciosas
Vitamina B12 Toxoplasma IgG e IgM
Ferritina Rubéola IgG e IgM
Folatos Chlamydea Ag
Virus sanguíneos Drogas terapéuticas
HIV 1+2 3ª generación Teofilina
HBs Ag Digoxina
HBs Ag confirmatoria
Diabetes Cardiovascular
Insulina CK-MB
Mioglobina
Troponina 1
Ante la posible y previsible tendencia a cierta unificación de laboratorios y sustitución de técnicas de RIA por otras de tipo alternativo como lo es la quimioluminiscencia, se requiere que se disponga de un documento que contemple algunas características del RIA y sus ventajas frente a otras técnicas analíticas.
En la mayoría de los hospitales las técnicas de RIA están sólidamente establecidas desde hace muchos años. Recientemente en las direcciones de los mismos se observa una tendencia a plantearse la sustitución del RIA por otras técnicas de más reciente introducción. Estas pretenden como máximo objetivo igualar la calidad del RIA. Ofrecen como mayor aportación real, facilidad y velocidad en la obtención de resultados. Su argumentación la basan en la automatización de los equipos y en la información incorporada a los mimos. En esta situación los responsables de las direcciones hospitalarias, de forma aislada o dirigidas por decisiones superiores, parecen intentar el cambio del RIA por aquellas técnicas sin que se conozcan los criterios utilizados para justificarlo. Cabe la posibilidad de que no dispongan de una información completa sobre las ventajas e inconvenientes de cada una de ellas, de los distintos procedimientos y de su óptima utilización. Una de las causas que potencian la desviación de determinaciones analíticas hacia otras técnicas no RIA es la información errónea sobre la peligrosidad radiante y contaminante del RIA. Sin embargo, esta potencial peligrosidad está totalmente reglamentada y controlada, cosa que no sucede con los residuos biológicos y químicos de otras técnicas alternativas.
El RIA es una técnica analítica de referencia cuya calidad, en general, aún no ha sido superada por ninguna otra. Se puede decir que cualquier otra es comparada con los resultados obtenidos por el RIA. Posteriormente aquellas solamente se introducen en el mercado cuando sus parámetros de calidad se acercan a los determinados por RIA. El RIA es una técnica tradicional en la mayoría de nuestros hospitales, con una dotación completa de recursos materiales y humanos. Actualmente, en general, los costos del RIA son inferiores a los de otra técnicas alternativas en las que hay que considerar, además del precio del reactivo propiamente dicho, otros costos adicionales por materiales accesorios (calibradores, controles, cubetas, buffers, otros reactivos, etc.
En relación con técnicas automatizadas alternativas al RIA merecen destacarse los siguientes puntos:
- Sólo se pueden realizar un determinado tipo de técnicas.
- Son equipos cerrados, de tal forma que están diseñados para ser utilizados exclusivamente con reactivos de un único fabricante. Ello conlleva un compromiso entre institución y laboratorio suministrador cuyo período de tiempo puede ser muy dilatado e importante.
- La información está en la actualidad incorporada al RIA igual que cualquier otra técnica analítica. Ahora bien, esta incorporación se ha realizado como algo natural, sin que se haya planteado como negociable. Se trata sencillamente de un avance común que alcanza a todos los campos de la tecnología. Por tanto, en este sentido, el RIA se encuentra en la misma situación que otras técnicas alternativas. Además, la tarjeta de presentación del RIA es su mayor calidad y su menor costo, por lo que no es necesario recurrir a otras características para defender la necesidad y utilización de esta técnica.
- Los servicios deberían evaluar análisis detallados de los costos reales tanto en técnicas de RIA como en las alternativas, delimitando lo que son costos fijos de costos variables y que se modifican de forma importante en función del número de determinaciones realizadas.
- Aun cuando el RIA es altamente sensitivo, exacto, y preciso, hay algunas desventajas en este método, estas incluyen la vida media corta de los radioisótopos usados como marcadores, y los problemas relacionados con la exposición del usuario a los compuestos radioactivos.
- Por lo contrario en quimioluminiscencia el hecho de no utilizar material radioactivo. El costo para realizar inmunoensayos por método es más económico teóricamente.
- Debido que el método de quimioluminiscencia es un método automatizado el tiempo de elaboración de la prueba es mucho más corto y mucho menos tedioso. Disminuyendo así el riesgo de efectos operadores en las determinaciones inmunológicas.
- Se presenta como un alternativa este nuevo método, por que además de poseer las ventajas mencionadas anteriores, se pueden realizar muchas pruebas al igual que con el RIA y algunas otras más.
- Y no se necesita licencia especial para poder establecer un laboratorio de medicina nuclear las determinaciones sólo la persona con el permiso correspondiente.
- Con esto teóricamente puede decir que el CLIA es un método alternativo para aquellos laboratorios grandes y pequeños que deseen
- montar estos inmunoensayos sin mayor complicación como lo es el RIA.
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Palabras Clave: Quimioluminiscencia, Radioinmunoanálisis, Inmunoradiometría, Partículas paramagnéticas, Anticuerpos monoclonales, Ensayo tipo Sándwich, Ensayo tipo competitivo.
Q.F.B ARMANDO FORTUNY ARANO
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