No se debe confundir la viscosidad dinámica con la viscosidad cinemática que es la relación entre la viscosidad dinámica y la densidad del fluído (m2 / seg). Para fluídos Newtonianos, la viscosidad es independiente de la velocidad de corte. Para fluídos no Newtonianos es una función de la velocidad de corte. El agua y muchos caldos de fermentación se pueden considerar como fluídos Newtonianos. En cambio las fermentaciones de hongos filamentosos ó donde se excretan polímeros, tienen un comportamiento no Newtoniano.
Comportamiento no Newtoniano El más importante es cuando la velocidad de corte depende de la viscosidad. Un fluído cuya viscosidad disminuye cuando aumenta la velocidad de corte se llama pseudoplástico. Lo opuesto, es decir aumenta la viscosidad cuando disminuye la velocidad de corte se llama dilatante. Las soluciones de polímeros y soluciones que contienen hongos filamentosos son a menudo pseudoplásticos. Ciertos materiales no fluyen hasta que se excede tres veces el esfuerzo de corte, estos materiales se llaman plásticos de Bingham. Una relación típica entre la velocidad de corte y viscosidad es el Modelo de OSTWALD ó power law model. ? = K ? n-1 K es el índice de consistencia n es el índice de la ley de potencia. Si n > 1, el fluído es dilatante, si n < 1 es pseudoplástico, y si es n = 1 es un fluído Newtoniano. Un medio que contiene microorganismos es normalmente Newtoniano, y la viscosidad es cercana a la del agua pura (excepto cuando tengo [biomasa] muy altas. Si el microorganismo produce polisacáridos extracelulares, hay un efecto significativo sobre la reología, pero el efecto sobre las células es despreciable.
En fermentaciones de hongos, el medio se vuelve muy viscoso. Las propiedades reológicas van a depender si tengo micelio libre ó aglomerado de hifas, de la forma de los pellets. Generalmente el esfuerzo de corte y la viscosidad en un medio con micelio es > que en un medio con pellets a la misma [biomasa]. Cambio de Escala en la Práctica Es imposible mantener las mismas condiciones de una escala laboratorio ó planta piloto a una escala >. En la Tabla 1 se mantuvieron constantes 4 parámetros, potencia de entrada específica, velocidad de agitación (que es equivalente a mantener el tiempo de mezclado), la velocidad de punta (que da aproximadamente la misma velocidad de corte, y el nº de Re, el resto de los parámetros se modifican con el cambio
de escala. Hay cuatro aproximaciones diferentes para un cambio de escala: Método Fundamental Métodos semi fundamentales Análisis dimensional Reglas de Thumb El método fundamental se basa en la solución de ecuaciones que gobiernan el flujo combinadas con la cinética de la reacción. En un sentido estricto, esto no es posible ya que la cinética microbiana no es del todo conocida, se deben hacer suposiciones. En el método semi fundamental se aplican modelos de flujo más simples. Cuando un modelo se combina con un modelo cinético apropiado, se puede describir con precisión el proceso. Por ej: un modelo estructurado. Análisis dimensional se basa en la comparación de los tiempos característicos de mecanismos diferentes involucrados en un proceso de fermentación. Para un proceso que se modela como de primer orden, el tiempo se define como la recíproca de la velocidad constante. Para procesos que no son de primer orden, el tiempo se calcula como la relación entre la capacidad y el flujo (contenido volumétrico de la especie considerada vs velocidad volumétrica de la especie consumida).
Analizando los tiempos característicos se pueden identificar problemas como limitación de oxígeno en un proceso en gran escala. e: hold up del gas (m3 de gas / m3 de la dispersión del gas en el líquido) vg : flujo de gas (m3 / hr) qs: velocidad volumétrica de sustrato (kg / m3 hr) vf: líquido de alimentación del reactor (m3 / hr) sf: [S] en la alimentación (kg / m3)
Pasos principales en un cambio de escala Reglas de thumb En la Tabla 1 se puede mantener constante un parámetro durante el cambio de escala, lo más usado es potencia de entrada del agitados y el valor de kla. En la práctica no es así porque los valores pueden cambiar, inclusive puedo diseñar un reactor completamente diferente. Si se sigue los pasos esquematizados para un cambio de escala puedo evitar fallas asociadas con el mismo.
Fermentación en estado sólido (FES)
Antecedentes
Los procesos de FES existen de manera natural desde el comienzo de la vida en el planeta y fueron empleados de forma artesanal en los países del Sudeste Asiático, África y América Central desde hace siglos para la elaboración de alimentos a partir de cereales, yuca, entre otros.
El objetivo fundamental con estas fermentaciones ha sido no solo aumentar el contenido proteico de estos alimentos, sino mejorar las posibilidades de conservación, cambiar las características físicas, el color, el olor o el sabor de los mismos.
Ejemplos de estos productos lo constituyen el Koji, que se obtiene por el cultivo del hongo Aspergillus oryzae sobre cereales cocidos, el Shoyu, el Miso y el Ontjom (Hesseltine, 1972).
La producción del queso Roquefort a partir de leche de oveja, data de alrededor de 1000 años; sin embargo, no es hasta aproximadamente 1930 que se conoce el papel de los hongos en la elaboración de ese alimento, cuando se demostró que todos los hongos desarrollados en este tipo de queso eran del mismo organismo Penicillium roqueforti.
No es hasta finales de la década de los 70 que se promueve con fuerza el estudio científico, con vistas a aprovechar las ventajas económicas de este tipo de
fermentación (Doelle y col., 1992).
Definición
Hesseltine (1972) empleó el término de fermentación en estado sólido a todas las fermentaciones donde el sustrato no es líquido.
Posteriormente, Raimbault (1980) propuso un término más preciso: "Las fermentaciones en las cuales el sustrato no está ni disuelto ni en suspensión en un gran volumen de agua".
No obstante, Moo-Young y col. (1983), propusieron un término a todos los procesos que utilizan materiales insolubles en agua para el crecimiento de microorganismos en ausencia de agua libre.
Aautores como Mudgett (1986) y Durand. y col. (1988), han planteado una definición más general: "Es un método de cultivo de microorganismos sobre y/o dentro de partículas sólidas". El líquido ligado a las partículas sólidas debe estar en una cantidad que asegure la actividad del agua adecuada para el crecimiento y el metabolismo de los microorganismos, pero sin exceder el máximo poder de retención de este líquido en la matriz sólida.
La definición más general y reciente fue formulada por Viniegra-González (1997), donde se plantea que "es un proceso microbiológico que ocurre comúnmente en la superficie de materiales sólidos que tienen la propiedad de absorber y contener agua, con o sin nutrientes solubles".
Esta definición abarca a procesos donde el soporte sólido es inerte y los sustratos que utiliza el microorganismo pueden ser sustancias solubles en agua, como el proceso de bioconversión de etanol y el crecimiento de Candida utilis sobre amberlita (Christen y col., 1993).
Ventajas y desventajas de la fermentación en estado sólido comparada con el cultivo sumergido en líquido
Doelle y col. (1992) consideran como ventajas los siguientes aspectos:
Los medios de cultivo son simples, generalmente subproductos agrícolas que presentan un alto contenido de los nutrientes necesarios.
La baja actividad del agua es de gran ayuda para evitar las contaminaciones, especialmente de bacterias y levaduras.
La concentración natural del sustrato permite utilizar reactores más pequeños en comparación con los utilizados en otro tipo de fermentación. Tienen mayor productividad volumétrica.
La aireación forzada es facilitada por la porosidad del soporte, lo que permite una alta transferencia de oxígeno al microorganismo.
Pueden emplearse, frecuentemente conidios como inóculo en los procesos de crecimiento de hongos, lo cual disminuye los costos y las manipulaciones en la preparación del inóculo.
Los conidios de los hongos que se producen son mucho más resistentes y tienen mejor adaptabilidad a las condiciones en las que se aplican como agente de biocontrol.
El proceso de recobrado es simplificado. Algunos productos son utilizados integralmente, como alimento animal, productos para el control biológico, etc.
Los procesos se consideran generalmente como tecnologías limpias.
Entre las principales desventajas se encuentran:
Su aplicación se limita a microorganismos que crecen en bajos contenidos de humedad.
La extracción del calor metabólico puede ser un problema, sobre todo cuando se trabaja a gran escala y no se controla el proceso.
La naturaleza sólida del sustrato trae problemas al medir los parámetros de la fermentación tales como el pH, la temperatura, el contenido de humedad y la concentración de sustrato y productos.
Los procesos de transferencia de masa son limitados por la difusión.
Muchos aspectos ingenieriles como el diseño de reactores y el escalado están muy poco caracterizados.
El tiempo de fermentación es mayor debido a que generalmente se utilizan microorganismos que presentan bajas velocidades específicas de crecimiento.
Es bueno recalcar que algunas de estas desventajas son relativas, por ejemplo, el tiempo de fermentación ya que actualmente se están empleando bacterias en los procesos de FES.
Autores (Ballio y col. 1964 y Richard-Molard y col. 1985) , demostraron que durante el desarrollo del cultivo de un hongo, la variación de la actividad del agua (aH2O) en el medio, puede influir sobre el crecimiento micelial ó en la germinación de las esporas y esto es útil para optimizar la producción de conidios en fermentadores con sustrato sólido, donde la suplementación de oxígeno y la cosecha de conidios, resulta más fácil que en fermentaciones líquidas.
Influencia de factores ambientales en la fermentación en estado sólido
Las condiciones ambientales tales como la humedad, la actividad del agua, el pH, la temperatura, la concentración y disponibilidad del sustrato, la aireación, el tamaño de partículas y la forma de inoculación afectan significativamente tanto el crecimiento como la formación de productos.
En el cultivo líquido agitado el control de las condiciones ambientales es relativamente simple, ya que estos sistemas son homogéneos desde el punto de vista de la concentración celular, nutrientes y productos.
Sin embargo se presentan problemas serios en los sistemas sólidos con el mezclado, la transferencia de oxígeno, el intercambio de calor y el control de la humedad y el pH, debido, principalmente, a la heterogeneidad y la consistencia del sistema (Doelle y col., 1992).
La Humedad y la actividad del agua (aH2O)
El porcentaje de humedad en la fermentación sólida puede variar entre 30 y 80% (Oriol y col., 1988), dependiendo del sólido utilizado, el microorganismo y el objetivo del proceso (formación de producto, crecimiento de la biomasa).
Aunque el porcentaje de humedad es una de las variables que comúnmente se optimiza en los sistemas de fermentación sólida, (Kim y col., 1985, Rodríguez y col., 1986), hoy se reconoce que no es solo la cantidad de agua presente en el sistema la que ejerce su influencia sobre la eficiencia del proceso, sino el carácter de las interacciones entre el agua y el medio sólido.
La actividad del agua (aH2O) es el parámetro que se ha utilizado para caracterizar cuantitativamente esas interacciones físicas y/o químicas del agua en el sistema.
La actividad del agua se define como la humedad relativa de la atmósfera gaseosa en equilibrio con el sustrato (Oriol E. y col., 1988).
La humedad relativa de un sistema gas – vapor de agua se determina por %H. R. = (p H2O / p°H2O) 100, de manera que la actividad del agua es igual a la relación
entre la presión parcial del vapor de agua en la solución gaseosa (p H2O ) en el estado de equilibrio con el agua adsorbida en el sólido y la presión de vapor del agua pura (p°H2O ) a esa misma temperatura .
Se demostró que la actividad del agua no sólo ejerce influencia sobre el crecimiento, sino también sobre la formación de productos y, en muchos casos, el valor mínimo requerido de aH2O para la formación del producto difiere del necesario para el crecimiento (Troller, 1980, Gervais y col., 1988).
El pH
El pH es otra variable que afecta el desarrollo de los procesos de fermentación en estado sólido, al igual que lo hace en los cultivos sumergidos. Sin embargo, en el caso de la fermentación sólida, su control es prácticamente imposible, debido a la ausencia de instrumentos capaces de medir el pH en la capa de líquido que rodea el sólido (Mitchell y col., 2002).
Por otra parte, el mezclado de sólidos es un proceso complejo por lo cual se dificulta también el control de esta variable durante el desarrollo de la fermentación.
El pH cambia por diferentes razones; normalmente disminuye por la secreción de ácidos orgánicos como acético y láctico durante el proceso. No obstante, la fuente de nitrógeno utilizada influye mucho en la tendencia que sigue el pH (Domenech, 2000).
La temperatura
El crecimiento y la formación de productos son resultados de complejas reacciones químicas, y al igual que cualquier otra reacción, están afectados por la temperatura, la que ejerce una acción determinante en el conjunto de actividades celulares.
La temperatura es la variable cuyo control, en una fermentación sólida, se considera lo más crítico debido a la alta concentración de sustrato por unidad de volumen y a la baja conductividad térmica del sistema heterogéneo sólido – líquido – gas, lo que favorece la acumulación del calor metabólico en el sistema y un aumento de la temperatura del cultivo.
El aumento de la temperatura favorece tres aspectos negativos:
La actividad microbiana se desacelera o se detiene.
Se deshidrata el medio sólido.
El metabolismo se desvía como un mecanismo de defensa ante el calor o ante la deshidratación (Gutiérrez y col., 1995).
El control de la temperatura se ha tratado a través de métodos convencionales de extracción de calor y de métodos no convencionales.
Los métodos convencionales incluyen el intercambio de calor por los mecanismos
de conducción y convección forzada. Se demostró que los primeros no son tan efectivos como los segundos (Saucedo – Castañeda y col., 1990).
Los métodos de extracción de calor por convección, para ser efectivos, requieren de elevadas tasas de aireación que con frecuencia deshidratan al medio.
Los métodos no convencionales se refieren a la utilización del calor latente de vaporización del agua para eliminar el calor metabólico de manera rápida y efectiva (Sargantanis y col., 1993).
Existe un compromiso entre las soluciones drásticas y efectivas (métodos no convencionales) versus las menos efectivas (métodos convencionales) pero que respeten la integridad del sistema biológico en su conjunto.
Resulta también claro que los sistemas de control de las FES deberán tomar en cuenta, simultáneamente, la humedad del medio, la humedad relativa del aire y la temperatura.
También el tipo de reactor utilizado (con o sin agitación) juega un papel fundamental en la eficiencia del control de la temperatura.
La concentración y disponibilidad del sustrato
El medio de cultivo debe tener todos los nutrientes necesarios de forma balanceada para favorecer el crecimiento del microorganismo.
Las relaciones entre algunos de sus elementos son de particular importancia, por ejemplo, carbono-nitrógeno y fósforo-oxígeno, esta última de manera relevante en lo referido a la eficiencia de conversión energética y a la respiración (Cannel y Moo Young, 1980).
La formulación tiene que ver con los aspectos cuantitativos de los medios, es decir, debe establecer las concentraciones a ser utilizada de cada componente.
Una primera aproximación con respecto a las cantidades a utilizar de las diversas lo da el conocimiento de la composición de la biomasa del microorganismo empleado (Ertola y col., 1994).
Mediante el conocimiento de los coeficientes de rendimiento para la formación de biomasa y producto, y los valores de la energía de mantenimiento será posible establecer también los requerimientos de las fuentes de carbono necesarios para formular un medio (Ertola y col., 1994).
Al igual que en los cultivos sumergidos, la concentración de sustrato ejerce una influencia sobre el desarrollo del microorganismo. Hasta el momento, tal influencia no está caracterizada en términos de limitación o inhibición como en los cultivos sumergidos; pero se piensa que los efectos de limitación sean mayores en las fermentaciones sólidas, debido a la baja velocidad de difusión de los nutrientes en la fase líquida (Moo-Young y col., 1983).
Si se ha encontrado que la relación carbono a nitrógeno tiene una gran
importancia y su valor óptimo puede variar en el intervalo de 10 a 100 en dependencia del proceso de fermentación.
La aireación
En la mayoría de los procesos de fermentación en estado sólido participan microorganismos aerobios, y resulta la aireación un factor fundamental para el desarrollo del proceso.
La aireación se utiliza para suministrar el oxígeno necesario, para extraer el CO2 formado, así como para extraer el calor metabólico evolucionado, de manera que el flujo óptimo de aire debe tomar en consideración la naturaleza del microorganismo utilizado, los requerimientos de oxígeno para el crecimiento y/o la formación del producto deseado, la velocidad de generación de calor metabólico, la concentración crítica del dióxido de carbono y otros metabolitos volátiles, el espesor de la masa de sólido, entre otros.
La aireación en las FES es más fácil que las fermentaciones sumergidas, porque la superficie de contacto es mayor entre el aire y el líquido que está absorbido en las partículas (Viniegra y col., 2003).
El tamaño de partícula
El tamaño de partícula está muy ligado a la transferencia de masa en el sistema de fermentación en estado sólido, y para considerar este fenómeno se ha propuesto dividir el análisis en la transferencia de masa intrapartícula y la
interpartícula (Moo-Young y col., 1983).
En el primer caso, influye más el tamaño y la forma del poro de la partícula, así como la porosidad, aunque también influye el tamaño de la partícula (Huerta, S., 1984).
En el segundo caso, el espacio interpartícula es lo más importante y es afectado por el tamaño de la partícula, su forma y la humedad (Bernard y col., 1992).
Otro aspecto que influye en la transferencia de masa durante el proceso, es el cambio de estructura de las partículas de sustrato resultado de la acción de los microorganismos (Moo-Young y col., 1983).
El inóculo
Otro factor que influye en los procesos de FES lo representa el tipo de inóculo y la forma de inoculación. En la literatura se reconoce el uso de dos tipos fundamentales de inóculo en la producción de hongos, tanto a nivel de laboratorio como industrial: micelio o esporas (Domenech, 2000).
El uso de micelio está reportado por Moore y Prior (1993) y Jenkins y col. (1998), entre otros. Las principales ventajas del uso de micelio como inóculo son: una mejor competitividad del hongo, una reducción de la posible colonización del sustrato por microorganismos contaminantes y la colonización más rápida debido a que se reducen los tiempos de incubación (la fase de latencia o de adaptación principalmente).
Sin embargo, en diferentes trabajos se reporta el uso de suspensiones de esporas (Bosch y col., 1995, Dorta y col., 1996 y Booth y Shanks, 1998), destacándose su principal ventaja en la reducción de los costos en la etapa de propagación del microorganismo.
Cinética y actividad metabólica del cultivo batch
La cinética de un proceso; representa la variación de una o más variables de dicho proceso en el tiempo. En los procesos fermentativos las variables de mayor importancia y que más se han estudiado son: contenido de biomasa en el sistema, la naturaleza del sustrato, la síntesis de uno o varios metabolitos, el consumo de oxígeno y la producción de dióxido de carbono.
Dentro de estas variables, la síntesis de biomasa en el proceso y el consumo de sustrato han permitido establecer una serie de criterios y parámetros que caracterizan cualquier proceso fermentativo (Domenech, 2000).
Los estudios cinéticos permiten determinar aspectos tan importantes como:
La velocidad específica de crecimiento
El rendimiento del proceso.
La productividad del sistema.
El calor generado en el sistema.
La estrategia a seguir en cuanto a la producción de un metabolito específico.
Una de las principales dificultades encontradas en el estudio y desarrollo de los procesos de fermentación en estado sólido viene dada por las características intrínsecas de estos sistemas heterogéneos, la imposibilidad del muestreo durante la fermentación para determinar las concentraciones correspondientes de biomasa, sustrato y productos.
Este hecho se refleja de manera particularmente aguda cuando se tiene la necesidad de realizar estudios cinéticos del proceso. No obstante, existen diferentes alternativas que permiten desarrollar estos estudios de manera objetiva y satisfactoria.
La determinación de la biomasa por métodos indirectos se ha empleado por diferentes investigadores. Entre ellos, Sato y col. (1983), Rodríguez y col. (1988), Desgranges y col. (1991) han basado su metodología en el metabolismo respiratorio.
El O2 consumido y el CO2 producido son el resultado de los procesos metabólicos a través de los cuales los microorganismos aeróbicos obtienen la energía necesaria para su crecimiento.
Por tanto, estas actividades metabólicas están asociadas al crecimiento del microorganismo y pueden usarse para estimar la biomasa sintetizada.
Entonces es posible relacionar en términos diferenciales el O2 consumido (dO2/dt)
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