Uso de marcadores bioquímicos y moleculares en estudios de diversidad genética (página 2)

I. MARCADORES BIOQUÍMICOS.

a) Proteínas de reserva en semilla.

En la actualidad existen diversos métodos analíticos para el estudio de las proteínas de reserva tales como: centrifugación, cromatografía, análisis de amino ácidos y electroforesis. A su vez, la electroforesis ha sido desarrollada en geles de almidón de una dimensión, en geles de poliacrilamida con o sin Sodium Dodecil Sulfate (PAGE), punto isoeléctrico (IEF) y poliacrilamida de dos dimensiones. Entre estas formas, la de mayor uso en estudios de diversidad ha sido la electroforesis en poliacrilamida vertical (PAGE- SDS) por presentar una buena resolución de las proteínas.

El uso de proteínas de almacenamiento en sistemática y diversidad genética se basa en el hecho que las proteínas de diferentes individuos, poblaciones y especies son homólogas, y que al separarse en un gel producirán bandas similares o diferentes. Debido a que las proteínas de reserva carecen de actividad enzimática, ellas son detectadas en el gel por medio de técnicas generales de teñido.

Estudios genéticos han demostrado que los patrones de bandas de las proteínas de reserva son heredados como características discretas y en forma codominante, observándose en algunos casos un efecto maternal (Leonard et al., 1988). El número de genes que controlan estas características es reducido y varía de acuerdo a la especie (Gepts, 1990). Como marcador bioquímico las proteínas de reserva tienen una baja influencia ambiental, aunque se han reportado algunas excepciones (Gayler y Sykes, 1985) además, permite un análisis rápido de decenas de muestras por ser un método simple y de bajo costo comparado con otras técnicas.

Sin embargo, los distintos patrones electroforéticos detectados pueden tener una base molecular compleja que puede incluir sustituciones, inserciones y pérdidas nucleotídicas. También las diferencias pueden ser causadas por modificaciones pre y post transcripción y/o traducción. Hasta ahora ha sido difícil relacionar los cambios fenotípicos de los patrones de bandas con el tipo de cambio a nivel molecular. Por otro lado, la cantidad de diversidad genética mediante polimorfismo proteico puede ser subestimada por la no detección de mutaciones silenciosas.

El polimorfismo de las proteínas de reserva en semillas ha sido utilizado para identificar y distinguir genotipos cultivados y silvestres en numerosas especies, tales como: frejoles (Phaseolus vulgaris) (Gepts y Bliss, 1986), trigo (Triticum aestivum) (Meachman et al, 1978), cebada (Hordeum vulgare) (Nebo et al, 1983), arveja (Pisum sativum)(Casey et al, 1986) y maíz (Zea mays) (Wilson, 1985). En algunas especies, como es el caso del frejol, esta técnica fue tan eficaz que mediante el estudio de un locus fue posible determinar por primera vez la organización de la diversidad genética de la especie (Gepts, 1990), situación que ha sido comprobada más tarde con el uso de isoenzimas y Fragmentos de Restricción polimórficos (RFLP) (Koenig y Gepts, 1989; Becerrra y Gepts, 1994).

b) Isoenzimas.

Con el avance tecnológico ocurrido en los años 70, el uso de geles de almidón y la tinción histoquímica de las proteínas, se demostró dentro de un organismo la existencia de las isoenzimas, formas moleculares múltiples dentro de un organismo que catalizan una misma reacción. El efecto de una modificación alélica puede ser detectado con certeza, debido a un cambio de movilidad electroforética. Esta sensibilidad electroforética hizo que la técnica haya revolucionado los estudios de diversidad genética en diversas especies.

Para estos estudios se han utilizado varias estructuras de la planta, tales como hojas, raíces o botones florales, de las cuales se obtiene un extracto crudo proteico. La técnica consiste en la separación de las enzimas del extracto crudo, en un soporte permeable (almidón, PAGE) bajo la acción de un campo eléctrico y seguido de un teñido histoquímico. La separación se realiza mediante la carga eléctrica neta, peso molecular, punto isoeléctrico y/o combinación de estos criterios (separación multidimensional). De este modo se separan enzimas codificadas por genes diferentes o productos de diferentes alelos de un mismo gen.

Las principales características de las isoenzimas incluyen la simplicidad, mínima cantidad del material en estudio, bajo costo y una cobertura del genoma de 10-20 loci por especie, ausencia de epistasis e influencias ambientales. La expresión alélica es de tipo codominante, lo que permite establecer comparaciones entre especies, poblaciones de una misma especie, y detectar la presencia de híbridos e introgresión de genes (Paredes y Gepts, 1995).

Entre sus desventajas se incluye un nivel bajo de polimorfismo al presentar pocos alelos por locus, especialmente cuando la base genética es estrecha. Por ejemplo, en lechuga (Lactuca sp) el número de polimorfismos fue tan bajo que no permitió diferenciar entre cultivares (Kesseli et al., 1991). Otro aspecto a considerar es que las proteínas, siendo un producto del ADN, pueden ser afectadas cualitativa y cuantitativamente en su nivel de expresión por factores ambientales. Para aumentar la eficiencia de la técnica ante este factor, deben ser identificados los estados de desarrollo de la planta durante los cuales la proteína es estable. Además, al igual que con las proteínas de reserva, las isoenzimas pueden o no reflejar los cambios genéticos que ocurren en el ADN, además sólo un set de genes estructurales están representados en estas proteínas, vale decir, sólo parte del genoma se puede evaluar.

Las isoenzimas han sido a menudo usadas para investigar problemas de sistemática, evolución o para medir los niveles de variación genética entre y dentro de las poblaciones (Paredes y Gepts, 1995), en la identificación de cultivares (Arulsekar et al., 1985). Varios estudios de diversidad genética se han realizado en diferentes especies de cultivos anuales y perennes, tales como lentejas (Lens culinaris) (Rodríguez et al., 1999), frejoles (P. vulgaris) (Paredes y Gepts, 1995), nogal (Junglans regia) (Arulzekar et al., 1985) y vid (Vitis sp.) (Arulsekar y Parfitt, 1986).

II. MARCADORES MOLECULARES

El polimorfismo basado en proteínas ha sido de gran utilidad en las investigaciones realizadas en plantas, pero con el desarrollo de las tecnologías basadas en ADN, la investigación en esta área se ha visto favorecida con la disponibilidad de una mayor cantidad de marcadores, aquellos basados en Fragmentos de Restricción Polimórficos (RFLP) y en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Ambas técnicas han derivado en múltiples técnicas como son la Amplificación de ADN al Azar (RAPD), Fragmentos Polimórficos de ADN Amplificados (AFLP), minisatélites (VNTR) y microsatélites (SSR), entre otros.

a) Fragmentos de Restricción Polimórficos (RFLP)

Los RFLPs permiten estudiar el genoma con una mayor cobertura al incluir secuencias codificadoras y no-codificadoras del ADN (exones e intrones). Esto permite detectar con mayor eficiencia cambios genéticos puntuales, comparado con las proteínas (Wang et al., 1992). Las principales ventajas de los RFLPs radican en la presencia de un número ilimitado de ellos, no son afectados por el medio ambiente, no presentan efectos pleiotrópicos y pueden ser evaluados en cualquier etapa de desarrollo de la planta.

La técnica está basada en la digestión del ADN total de un individuo con diferentes enzimas de restricción. Esta restricción produce cantidades equimolares de fragmentos para una molécula de ADN dada. Los fragmentos resultantes son separados por electroforesis en geles de agarosa y transferidos por capilaridad a una membrana de nylon (Southern Blot). Esta membrana es hibridada con una sonda (radioactiva o no). El producto de la hibridación es visualizado por medio de una autoradiografía de rayos-X, de acuerdo al peso molecular de la banda.

Básicamente, los RFLPs son causados por rearreglos del ADN, tales como pérdidas, inserciones o sustituciones de secuencias o nucleótidos únicos, lo que significa la ganancia o pérdida de sitios de restricción. Esto es detectado a través de diferencias en el peso molecular de los fragmentos homólogos de restricción del ADN genómico al hibridar con la sonda seleccionada.

Los RFLPs se heredan en forma Mendeliana simple, y si la sonda empleada representa una copia única, ella es considerada como un locus y las variaciones en patrones son analizados como alelos (bialélicos o multialélicos) (Doebley y Wendel, 1989). La expresión de estos marcadores es codominante, vale decir, todas las formas alélicas del gen son distinguibles, permitiendo detectar los híbridos y estudiar el flujo de genes entre poblaciones. El nivel de polimorfismo que esta técnica puede detectar depende en gran medida de la naturaleza de las sondas empleadas, enzimas de restricción utilizadas y de la complejidad en cuanto al tamaño del genoma de la especie en estudio.

Dentro de las principales desventajas de los RFLP están la clonación de las sondas, detección de RFLP en las membranas y el uso de radioactividad; tareas consideradas laboriosas, lentas y caras. Aunque últimamente, el desarrollo de la técnica no-radioactiva ha simplificado esta metodología (Foolad et al., 1995).

El uso de los RFLP en plantas representa una buena alternativa para realizar diversos estudios relacionados con los tres genomas que existen en ellas, el nuclear (ADNn), mitocondrial (ADNmt) y el de cloroplasto (ADNcp). La aplicación de esta técnica ha sido de gran utilidad en estudios filogenéticos, diversidad genética (Becerra y Gepts, 1994) e identificación de cultivares con propósitos de protección varietal.

El uso de uno u otro genoma dependerá de los propósitos del estudio. El ADN nuclear ha sido mayormente usado para estudios de diversidad genética de individuos emparentados por su mayor tasa de mutación en comparación al ADN mitocondrial y el de cloroplasto.

Es así como el ADNmt ha sido usado mayormente en estudios de filogenia en animales. En plantas, el uso de este genoma en estudios filogenéticos es discutido debido a la presencia de rearreglos del ADN y a la detección de ADN foráneo dentro de sus secuencias nucleotídicas (Palmer, 1992). Sin embargo, en maíz este ADN ha sido usado, detectándose una variabilidad considerable (Weissinger et al., 1983). Debido a su alta tasa de rearreglos este organelo pareciera ser más útil que el uso del cloroplasto para estudiar diversidad en las especies.

Por otro lado, se ha detectado diversidad de ADNcp entre especies, por lo que el uso de este organelo es importante en estudios de filogenia (Palmer et al., 1983). Durante la evolución del cloroplasto han ocurrido considerables sustituciones de bases, lo que ha producido cambios en los sitios de restricción, en lugar de rearreglos dentro del genoma como ha ocurrido con las mitocondrias. Dentro de las especies el ADNcp ha sido usado principalmente para comparar entre genotipos cultivados y silvestres. En algunos casos, el uso de este ADN ha sido bastante exitoso, como es el caso de la cebada (Hordeum vulgare) (Clegg et al., 1984), maíz (Zea mays) (Doebley, 1992) y cebolla (Allium sativum) (Havey, 1991). Sin embargo, en otras especies no ha sido eficiente, como es en el caso del sorgo (Sorghum sp.).

b) Fragmentos polimórficos de ADN Amplificados al Azar (RAPD).

Recientemente, se ha desarrollado una serie de técnicas basadas en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) (White et al., 1989). El principio de esta técnica se basa en la amplificación al azar de fragmentos de ADN usando un partidor, ADN genómico molde, nucleótidos, cloruro de magnesio y Taq ADN polimerasa. Esta reacción es sometida a diferentes condiciones cíclicas de temperatura, lo que permite la amplificación in vitro de múltiples fragmentos de ADN a partir de una cadena molde. Estos productos son polimorficos cuando se ha producido una pérdida, inserción o cambio de un solo nucleótido en la cadena molde (ADN genómico).

A partir del PCR se han generado una serie de técnicas, tales como la de Fragmentos Polimórficos de ADN Amplificado al Azar (RAPD). Esta técnica usa partidores aleatorios de 10 mers (Williams et al., 1990) para amplificar el ADN. Los productos de la amplificación son separados mediante electroforesis y las bandas visualizadas, de diferente peso molecular representan diferentes loci. En algunas especies, la técnica da la opción de usar dos o más partidores dentro de la misma reacción para aumentar el número de bandas, logrando una mayor cantidad de información por reacción.

Los productos de la reacción dependerán del genoma en estudio, del partidor y de las condiciones de la reacción. Los resultados de RAPD obtenidos en plantas indican su herencia dominante, su habilidad para detectar regiones de ADN altamente variables (5-10 loci por partidor), su tremenda potencialidad en el mapeo de genes, identificación de razas, estudios de hibridación inter e intraespecífica y en el estudio de la variación genética en poblaciones altamente emparentadas.

Las principales ventajas de esta técnica son la rapidez en la obtención de resultados, el costo, el no uso de radioactividad, menor inversión en equipos y la cantidad reducida de ADN requerida. Sin embargo como desventaja aparece la inconsistencia de los datos. Diferentes condiciones de laboratorios con pequeñas alteraciones en los parámetros de amplificación, pueden dar origen a resultados diferentes. Esta desventaja se puede reducir logrando un alto grado de estandarización de las condiciones de reacción y de amplificación, usando un control interno para asegurar la reproducibilidad de los productos de la amplificación, además del registro de las bandas nítidas y consistentes.

La técnica del PCR también ha sido ampliamente usada para estudiar diversidad genética de cultivares y su relación con sus ancestros silvestres (Demeke et al., 1992; Vierling y Nguyen, 1992; Sharma et al., 1995).

c) Fragmentos Polimórficos de ADN Amplificados (AFLP)

Recientemente otra técnica basada en el método de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) ha sido desarrollada (Vos et al., 1995). En esta técnica se combinan los principios de los RFLP y PCR, donde una submuestra de fragmentos producidos por la restricción del ADN bajo estudio son amplificados selectivamente en cascada. Los AFLPs usan como partidores oligonucleótidos complementarios a las secuencias que han sido ligadas a cada extremo del ADN digerido. El polimorfismo es detectado por la presencia o ausencia de fragmentos y son normalmente, al igual que RAPD, de herencia dominante.

Con esta técnica se puede detectar una variación considerable del genoma, lo cual se refleja en el número de productos amplificados con una sola combinación de partidores. La eficiencia en detectar polimorfismo puede ser varias veces mayor que la obtenida con RAPD y RFLP. Esta metodología ha sido ampliamente usada en diversas especies para medir diversidad genética, tales como: lechuga (Lactuca sativa) (Hill et al., 1996) y lenteja (Lens culinaris) (Sharma et al., 1996) entre otras. En el futuro esta técnica tendrá una gran utilización en la saturación de mapas genómicos y en la identificación de fragmentos ligados a genes de interés comercial (Colwin et al., 1995).

El procedimiento comienza con la digestión del ADN genómico de los individuos con enzimas de restricción que reconocen 4 y 6 bases de reconocimiento, lo cual genera fragmentos de tamaño preferentemente pequeño. Luego se ligan adaptadores de secuencia conocida a cada extremo y para el proceso de amplificación se usan partidores complementarios a estos adaptadores, manteniendo el sitio de restricción más un cierto número de nucleótidos (3 generalmente) que deben agregarse al extremo 3’. Finalmente, el proceso implica dos alternativas de detección de las bandas, la primera es la marcación radioactiva de los productos amplificados en la última etapa de amplificación, su separación en geles de poliacrilamida, secado del gel y su visualización en autoradiografías. La segunda alternativa usa la tinción directa del gel con nitrato de plata. Los resultados entre ambas alternativas son comparables, siendo esta última de menor costo y fácil aplicación. Una de las mayores ventajas de esta técnica es que en una sola reacción se puede identificar alrededor de 50 loci en un tiempo corto (Tohme et al., 1996).

Se han realizado comparaciones de los diversos marcadores utilizados a medida que se han ido desarrollando. Por ejemplo: al comparar resultados de este marcador con RFLPs y otros marcadores en lechuga (Lactuca sativa) (Hill et al., 1996) los genotipos fueron agrupados en forma similar. En soya (Glycine max) los AFLPs detectaron alrededor de 12 veces el número de loci polimórficos (Voguel et al., 1994) comparados con RAPDs. Es así como en el caso puntual de estudios de diversidad genética del frejol, la técnica de AFLP detectó una diversidad de 0,31 (1= igualdad genética) entre genotipos silvestres y cultivados (Tohme et al., 1996), mayor a la detectada por isoenzimas en los mismos genotipos (Singh et al., 1991). Sin embargo, los resultados de diversidad genética obtenidos fueron similares con los AFLP y RFLP.

Una de las desventajas para la interpretación de los datos es el tiempo necesario para el análisis cuando se realiza en forma no automatizada (visual). Por otro lado, los loci de AFLP son tan reproducibles como los RFLPs, pues son prácticamente insensibles a las condiciones de la reacción (Tohme et al., 1996), aunque ambas técnicas requieren de una buena calidad de ADN para el proceso de digestión con enzimas de restricción. Comparativamente, estas dos técnicas son de mayor precisión que los RAPDs, susceptibles a una falta de estandarización del proceso de amplificación.

d) Minisatélites y Microsatélites.

Las secuencias de ADN de mini (VNTR) y microsatélites (SSR) son dos categorías de secuencias repetidas que se presentan en eucariontes. Ellas se encuentran repetidas en tandem y dispersas a través del genoma representando muchos loci. Cada locus tiene distinto número de repeticiones variable, asociándose de esta manera a alelos específicos de alta variabilidad. A través del uso de estos marcadores se han obtenido patrones complejos de ADN en animales, plantas, y microorganismos.

Dentro de la primera categoría, los minisatélites son usados como sondas de secuencias simples repetidas. Las secuencias repetidas de estos minisatélites son monómeros que generalmente tienen 15-35 pares de bases, y han sido aislados de mamíferos, plantas y del genoma del bacteriófago M13. Una combinación de una enzima de restricción con la sonda de M13 puede generar un alto número de bandas, lo cual produce una gran información, comparada con los RFLPs. Al igual que éstos, la técnica es de alta reproducibilidad, aunque requiere de un proceso de clonación previo de la sonda hipervariable, además de un ADN de alta calidad para el proceso de restricción y transferencia (Southern blot), e hibridación con la sonda, generalmente marcada radioactivamente, y finalmente de la exposición a una película de rayos-X. Actualmente este polimorfismo puede ser detectado mediante PCR, mediante el uso de partidores que reconocen secuencias externas que rodean a las secuencias repetidas (Heat et al., 1993). Este polimorfismo identifica un locus que resulta ser multialélico debido a un elevado número de unidades repetidas, que corresponden a muchos alelos.

Los minisatélites han sido usados para estudiar diversidad genética y realizar la identificación de individuos ("fingerprinting") en diversas especies (Stockton et al., 1990; Ramakrishna et al., 1995).

La segunda categoría de secuencias repetidas son los microsatélites, ellos son secuencias de 1 a 5 nucleótidos repetidas en tandem y existen en forma abundante en plantas (Condit y Hubbell, 1991). Mediante los microsatélites se puede medir la diversidad entre genotipos amplificando mediante PCR la región del ADN genómico que contiene estas secuencias repetidas. El uso de microsatélites ha ido aumentando mediante la producción de bibliotecas de partidores y la secuenciación automática fluorescente que permiten el diseño de los partidores que rodean los microsatélites (Brondani et al., 1998). Los fragmentos generados son separados en geles denaturantes de poliacrilamida y visualizados radioactivamente o por tinción con nitrato de plata.

Los microsatélites son muy atractivos para los genetistas pues combinan varias ventajas como son su codominancia, multialelismo y su alta heterocigosidad. El alto nivel de polimorfismo que detecta permite una discriminación precisa entre individuos altamente emparentados. Además de ser altamente polimórficos, los microsatélites usan cantidades mínimas de ADN, equivalentes a las que se usan en RAPD. Las condiciones de amplificación y de reacción son especie-específicos y la variación en el largo de los productos amplificados mediante PCR es función del número de unidades repetidas.

En general, la amplificación de microsatélites ha demostrado que éstos son más variables que isoenzimas, RFLP, AFLP y RAPD. Por ejemplo, en Cucumis 29 isoenzimas no mostraron polimorfismo entre dos genotipos comerciales (Perl-Treves et al., 1985). Dentro del mismo género RAPD detectó un 38% de polimorfismo, mientras que los microsatélites detectaron un 71%, e incluso detectaron diferencias genéticas entre cultivares altamente emparentados que mediante otras técnicas no habían podido ser distinguidos (Katzir et al., 1996). Es así como se ha comprobado, en diversas especies, la complementariedad de todas las técnicas mencionadas anteriormente en el estudio global de la organización genética del germoplasma.

Una de las desventajas de los microsatélites es el tiempo y costo involucrado en el proceso del diseño de cada partidor, sin embargo existe la posibilidad de usar los mismos partidores en más de una especie. Esto es debido, a que existe un grado de conservación de los microsatélites entre genomas de especies tan distantes como son algunos mamíferos, plantas anuales y perennes. Esto no es generalizado en todas las especies, puesto que al comparar entre cereales de grano pequeño como trigo, cebada y centeno, se ha detectado una limitada conservación de las secuencias microsatelitales.

Los microsatélites han sido también utilizados para medir diversidad genética de diversas especies anuales como: soya (Glycine max) (Akkaya et al., 1992), arroz (Oryza sativa) (Wu y Tanskley, 1993), maíz (Zea mays) (Senior y Heum, 1995), cebada (Hordeum vulgare) (Becker y Heun, 1995), trigo (Triticum aestivum) (Röder et al., 1995) y raps (Brassica sp.) (Lagercrantz et al., 1993).

Hasta ahora también se han desarrollado microsatélites en especies perennes, aunque el número de ellos ha sido escaso (Brondani et al., 1998). En el caso de Eucaliptus los microsatélites han sido transferidos entre poblaciones y especies del mismo género. En forma adicional, la estimación de heterocigosidad que este marcador pueden entregar presenta una gran ventaja en el mapeo de características cuantitativas (QTLs), comparación de mapas que incluyen QTL y estudios de flujo genético en árboles.

Aunque el uso de marcadores bioquímicos y moleculares en estudios de germoplasma y diversidad genética es limitado por el costo de los reactivos, y en algunos casos por el elevado costo de los equipos, los avances técnicos que estas tecnologías han alcanzado en los últimos años, los hacen más accesibles a los genetistas y a los programas de mejoramiento. Ambos tipos de análisis son complementarios en la caracterización morfológica y agronómica del germoplasma y en el entendimiento de la diversidad y estructura genética de las poblaciones, especies y taxas.

La elección del marcador a usar dependerá de los objetivos del estudio, del costo y de las características que cada uno de ellos presentan (Cuadro 1).

Cuadro 1. Características generales de los marcadores genéticos. Table 1. General characteristics of genetic markers.

RFLP : Fragmentos de restricción polimórficos RAPD : Amplificación de ADN al azar VNTR : Número variable de repeticiones en tandem AFLP : Amplificación de fragmentos polimórficos SSR : Secuencias simples repetidas

LITERATURA CITADA

Akkaya, M.S.; Bhagwat, A.A. And Cregan, P.B. 1992. Length polymorphisms of simple sequence repeat DNA in soybean. Genetics 132:1131-1139         [ ]

Arulsekar, S.; Parfitt, D.E. and Mcgranahan, G. 1985. Isozyme gene markers in Junglans species: Inheritance of GPI and AAT in J. regia and J. hindsii. The Journal of Heredity 76:103-106

Arulsekar, S. and Parfitt, D.E. 1986. Isozyme analysis procedures for stone fruits, almond, grape, pistachio and fig. HortScience 21 :928-933

Becerra, V. and Gepts, P. 1994. RFLP diversity of common bean (Phaseolus vulgaris L.) in its centres of origin. Genome 37: 253-263

Becker, J. and Heun, M. 1995. Barley microsatellites: allele variation and mapping. Plant Mol. Biol. 27 :835-845

Brondani, R.; Brondani, C.; Tarchini, R. and Grattapaglia, D. 1998. Development, characterization and mapping of microsatellite markers in Eucalyptus grandis and E. urophylla. Theor. Appl. Genet. 97:816-827

Casey, R.; Domoney, C. and Ellis, N. 1986. Legume storage proteins and their genes. Oxford Surveys Plant Mol. Cell Biol. 3 :1-95

Clegg, M.T.; Brown, A.H.D. and Whitfield, P.R. 1984. Chloroplast DNA diversity in wild and cultivated barley : Implications for genetic conservation. Genet. Res. 43 :339-343

Colwin, T.; Vos, P.; Zabeau, M.; Jones, D.; Norcott, K.; Chadwick, B. and Jones, J. 1995. Identification of amplified restriction fragment polymorphism (AFLP) markers tightly linked to the tomato Cf-9 gene for resistance to Cladosporium fulvum. The Plant Journal 8:785-794

Condit, R. and Hubbell, S.P. 1991. Abundance and DNA sequence of two-base repeat regions in tropical tree genome. Genome 34:66-71         [ Medline ]

Demeke, T.; Adams, R.P. and Chibbar, R. 1992. Potential taxonomic use of random amplified polymorphic DNA (RAPD): a case study in Brassica. Theor Appl Genet. 84 :990-994

Doebley, J. 1992. Molecular systematics and crop evolution. In : Soltis, P.; Soltis, D. ; Doyle, J. (Eds.) Molecular systematic of plants. New York, U.S.A. Chapman and Hall p. 202-222

Doebley, J. and Wendel, J.D. 1989. Application of RFLPs to plant systematics. In : Helentjarus, T.; Barr, B. (Eds.) Development and application of molecular markers to problems in plant genetics. New York, U.S.A. Cold Spring Harbor Laboratories. p.57-67

Foolad, M.R.; Arulsekar, S.; Becerra, V. and Bliss, F.A. 1995. A genetic map of Prunus based on an interspecific cross between peach and almond. Theor. Appl. Genet. 91 :262-269

Gayler, K.R. and Sykes, G.E. 1985. Effect of nutritional stress on the storage proteins of soybeans. Plant Physiol. 78 :582-585

Gepts, P. 1990. Genetic diversity of seed storage proteins in plants. In : Brown, H.D.; Clegg, M.T.; Kahler, A.L. and Weir, B.S. (Eds.) Plant population genetics, breeding and genetic resources. Sunderland, Massachusetts, U.S.A. p:64-82

Gepts, P. and Bliss, F.A. 1986. Phaseolin variability among wild and cultivated common beans (Phaseolus vulgaris) from Colombia. Econ. Bot. 40 :469-478

Havey, M.J. 1991. Phylogenetic relationships among cultivated Allium species from restriction enzyme analysis of the chloroplast genome. Theor. Appl. Genet. 81 :752-757

Heat, D.D.; Iwama, G.K. and Devlin, R.H. 1993. PCR primed with VNTR core sequences yields species specific patterns and hypervariable probes. Nucleic Acids Res. 21: 5782-5785

Hill, M.; Witsenboer, H.; Zabeau, M.; Vos, P.; Kesseli, R. and Michelmore, R. 1996. PCR-based fingerprinting using AFLPs as a tool for studying genetic relationships in Lactuca spp. Theor. Appl. Genet. 93 :1202-1210

Katzir, N.; Danin-Poleg, Y.; Tzuri, G.; Karchi, Z.; Lavi, U. and Cregan, P. 1996. Length polymorphism and homologies of microsatellites in several Cucurbitaceae species. Theor. Appl. Genet. 93 :1282-1290

Kesseli, R.; Ochoa, O. and Michelmore, R. 1991. Variation at RFLP in Lactuca spp. and origin of cultivated lettuce (L. sativa). Genome 34:430-436

Koenig, R. and Gepts, P. 1989. Allozyme diversity in wild Phaseolus vulgaris : further evidence for two major centers of genetic diversity. Theor. Appl. Genet. 78 :809-817

Lagercrantz, U.; Ellegren, H. and Anderson, L. 1993. The abundance of various polymorphic microsatellite motifs differs between plants and vertebrates. Nucleic Acids Res. 21 :1111-1115         [ Medline ]

Leonard, A.; Damerval, C. and De Vienne, D. 1988. Organ-specific variability and inheritance of maize proteins revealed by two dimentional electrophoresis. Genet. Res. 52 :97-103

Meachman, D.K.; Kasarda, D.D. and Qualset, C.O. 1978. Genetic aspects of wheat gliadin proteins. Biochem. Genet. 16 :813-853

Nebo, E.; Beiles, A.; Storch, N.; Doll, H. and Andersen, B. 1983. Microgeographic edaphic differentiation in hordein polymorphisms of wild barley. Theor. Appl. Genet. 64 :123-132

Palmer, J.D. 1992. Mitochondrial DNA in plant systematics : applications and limitations. In : Soltis, P. ; Soltis, D.  and Doyle, J. (Eds) Molecular systematic of plants. New York, U.S.A. Chapman and Hall. p. 36-49

Palmer, J.D.; Shield, C.D.; Cohen, D.B. and Orton, T.J. 1983. Chloroplast DNA evolution and the origin of amphidiploid Brassica species. Theor. Appl. Genet. 109 :195-213

Paredes, M. and Gepts, P. 1995. Extensive introgression of Middle American germplasm into Chilean common bean. Gen. Res. and Crop Evo. 42 :29-41

Perl-Treves, R.; Zamir, R.; Navot, D. and Galun, E. 1985. Phylogeny of Cucumis based on isozyme variability and its comparison with plastome phylogeny. Theor. Appl. Genet. 71 :430-436

Ramakrishna, W; Chowdari, K.; Lagu, M.; Gupta, V. and Ranjekar, P. 1995. DNA fingerprinting to detect genetic variation in rice using hypervariable DNA sequences. Theor. Appl. Genet. 90 :1000-1006

Röder, M.S.; Plaschke, J.; Köning, S.V.; Börner, A.; Sorrels, M.E.; Tanskley, S.D. and Ganal, M.W. 1995. Abundance , variability and chromosomal location of microsatellites in wheat. Mol. Gen. Genet. 246 :327-333

Rodriguez, M.; Paredes, M. and Becerra, V. 1999. Diversidad isoenzimática en el germoplasma de lentejas (Lens culinaris Medick) naturalizado en Chile. Agricultura Técnica (Chile) 59:186-195.

Senior, M.M. and Heum, M. 1995. Mapping maize microsatellites and polymerase chain reaction confirmation of the targeted repeats using a ct primer. Genome 36 :884-889

Sharma, S.K.; Dawson, J.K. and Waugh, R. 1995. Relationships among cultivated and wild lentils revealed by RAPD analysis. Theor. Appl. Genet. 91 :647-654

Sharma, S.K.; Knox, M.R. and Ellis, T.H. 1996. AFLP analysis of the diversity and phylogeny of lens and its comparison with RAPD analysis. Theor. Appl. Genet. 93 :751-758

Singh, S.; Nodari, R. and Gepts, P. 1991. Genetic diversity in cultivated common bean : I. Allozymes. Crop Science 31:19-29

Stockton, T.; Sonnante, G. and Gepts, P. 1990. Detection of minisatellite sequences in Phaseolus vulgaris. Plant Mol. Bio. Reporter 10:47-59

Tohme,J. ; González, O. ; Beebe, S. and Duque, M. 1996. AFLP analysis of gene pools of a wild bean core collection. Crop Science 36 :1375-1384

Vierling, R.A. and Nguyen, H.T. 1992. Use of RAPD markers to determine the genetic diversity of diploid wheat genotypes. Theor. Appl. Genet. 84 :835-838

Voguel, J.M.; Powell, W.; Rafalski, A.; Morgante, M.; Tudo, J.D.; Taramino, G.; Biddle, P.; Hanafey, M. and Tingley, S.V. 1994. Application of genetic diagnosis to plant genome analysis : comparison of marker systems. Appl. Biotechnol. Tree Cult. 1 :119-124

Vos, P.; Hogers, R.; Bleeker, M.; Reijans, M.; Van De Lee, T.; Hornes, M.; Frijters, A.; Pot, J.; Peleman, J.; Kuiper, M. and Zabeau, M. 1995. AFLP : a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Res. 23 :4407-4414         [ Medline ]

Wang, Z.Y.; Second, G. and Tanskley, S.D. 1992. Polymorphism and phylogenetic relationships among species in the genus Oryza as determined by analysis of nuclear RFLPs. Theor. Appl. Genet. 83 :565-581

Weissinger, A.K.; Timothy, D.H.; Levings, C.S. and Goodman, M.M. 1983. Patterns of mitochondrial DNA variation in indigenous maize races of Latin America. Genetics 104:365-379

White, T.J.; Arnheim, N. and ERLICH, H. 1989. The polymerase chain reaction. Trends in Genetics 5:185-188         [ Medline ]

Williams, K.G.; Kubelik, A.R.; Livak, K.J.; Rafalsky, J.A. and Tingey, S.V. 1990. DNA polymorphism amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acid Res. 18:6531-6533

Wilson, C.M.  1985. Mapping of zein polypeptides after isoelectric focusing on agarose gels. Biochem. Genet. 23 :115-124         [ Medline ]

Wu, K.S.  and Tanskley, S.D. 1993. Abundance, polymorphism and genetic mapping of microsatellites in rice. Mol. Gen. Genet. 241 :225-235

Viviana Becerra V. 2 y Mario Paredes C. 2 2. Instituto de investigaciones Agropecuarias, Centro Regional de Investigación Quilamapu, Casilla 426, Chillán, Chile.