Suplementación con selenio en vaquillas: Efecto sobre la respuesta inmune a las vacunas Brucella abortus cepa RB51 y toxoide tetánico (página 2)

MATERIAL Y MÉTODOS

Animales. Se utilizaron 32 vaquillas Frisón Negro, preencaste, entre 18 y 24 meses de edad, de 300 a 350 kg de peso vivo y provenientes de un predio libre de tuberculosis, leucosis y brucelosis. Los animales se asignaron al azar en dos grupos de 16 vaquillas cada uno, un grupo suplementado con Se (Se-S) y otro control no suplementado (No-S). Todos los animales habían recibido la vacuna antibrucelosis RB51 entre los 6 y 8 meses de edad, como parte del programa de vacunación del predio. Los animales fueron mantenidos durante 9 meses (abril a enero), en pradera natural con un contenido de Se en la pradera de 0,04 µg/g base materia seca (determinado en el Hill Laboratories. Hamilton, NZ) en muestras de forraje obtenidas antes y después del periodo experimental.

Suplementación con selenio.El grupo Se-S fue suplementado con 1 mg de Se/ kg/pv en forma de selenato de bario1 en dosis única de 1 ml/50 kg/pv. subcutáneo. De cada vaquilla se tomaron simultáneamente dos muestras de sangre (con y sin heparina), por venopunción coccígea previo a la suplementación (día 0), y luego cada 15 días durante 270 días. El suero obtenido fue guardado a -20 ºC hasta su posterior análisis.

Evaluación de la actividad sanguínea de glutatión peroxidasa (GSH-Px). El balance nutricional de Se se evaluó en ambos grupos de animales mediante la actividad sanguínea de GSH-Px en un hemolizado de las muestras de sangre con heparina, empleando reactivos comerciales2, basados en una técnica cinética compuesta NADPH-dependiente, según la modificación del método descrito por Paglia y Valentine en 1967 (Ceballos y col 1998). Las lecturas se realizaron en un espectrofotómetro Hitachi 40203.

La actividad de GSH-Px fue expresada en U/g Hb e interpretada según Ceballos y Wittwer (1996), quienes señalan que valores menores a 60 U/g Hb son considerados deficientes y sobre 130 U/g Hb son considerados apropiados.

Inmunización con la vacuna RB51. Con la finalidad de evaluar la respuesta inmune humoral y celular a la vacuna Brucella abortus cepa RB514, todos los animales fueron inmunizados con una dosis completa (1-3,4 x 1010), 60 días posteriores a la administración de Se.

Preparación antigénica del extracto total de RB51. Brucella abortus cepa RB51 se cultivó en caldo TSB5 a 37 °C bajo agitación continua por 5 días hasta obtener un cultivo saturado con bacterias. Se centrifugó a 12.000 r.p.m. por 10 minutos y se eliminó el sobrenadante. El pellet de bacterias se suspendió en agua destilada en un volumen equivalente a 10% del volumen original del caldo saturado y se incubó bajo agitación continua en baño María a 65 °C por 30 minutos. Luego se le agregó SDS6 para alcanzar una concentración final de 0,5% y se incubó en un baño hirviendo por 10 minutos. La preparación se centrifugó nuevamente y el sobrenadante se utilizó como antígeno. La concentración de proteína se determinó por el método de Bradford7.

Determinación de la respuesta inmune a la vacuna RB51. La respuesta humoral se determinó por el método de ELISA indirecto en muestras de suero (1: 2000) cada 15 días durante 90 días. En resumen, la placa de poliestireno se sensibilizó con 0,5 µg de proteína del extracto total de RB51 por pocillo y fue incubada con el suero a 4 °C durante 18 horas. Para detectar los anticuerpos específicos se utilizaron anticuerpos anti IgG de bovino unidos a peroxidasa8. La reacción fue revelada con o-Phenylenediamine9 y peróxido de hidrógeno como sustrato.

La respuesta inmune celular se evaluó mediante pruebas de intradermorreacción en los dos grupos de animales previamente sensibilizados con la vacuna RB51. La determinación de la respuesta se obtuvo mediante inyección intradérmica del extracto de Brucella abortus RB51 en dosis de 16 µg, 175 días después de la vacunación y la lectura se realizó a las 72 horas postinoculación. Como control de la reacción en los mismos animales se utilizó tuberculina (PPD) y, como control del antígeno, la prueba intradérmica se les aplicó a terneras no inmunizadas con RB51.

Inmunización con toxoide tetánico. Con el fin de inducir y evaluar la respuesta inmune humoral, tanto primaria como secundaria, todos los animales recibieron una doble inmunización con toxoide tetánico adsorbido con hidróxido de aluminio10 en dosis de 2,5 ml vía s.c. (300 Lf/ml). La primera inmunización se realizó 120 días post- suplementación con Se y la segunda inmunización, 30 días después.

Determinación de la respuesta inmune a la vacuna Toxoide tetánico.La respuesta humoral se determinó por el método de ELISA indirecto en muestras de suero (1:4000) cada 15 días durante 75 días, utilizando el mismo protocolo que para determinar la respuesta a la vacuna RB51. En este caso las placas fueron sensibilizadas con 1 µg de toxoide tetánico por pocillo, cuya concentración fue determinada por espectrofotometría, mediante un kit comercial de proteínas totales11.

Análisis estadístico. Establecida la normalidad de la distribución de los datos, mediante la prueba de Kolmogorov y Smirnov, se calcularon los promedios y desviación estándar para cada grupo y día de muestreo. La significancia de las diferencias dentro del grupo se evaluó mediante análisis de varianza y cuando éstas fueron significativas se identificaron con la prueba de comparación múltiple de Tukey. Las diferencias entre los grupos se evaluaron mediante la prueba "t" de Student (Zar 1996). Los análisis se realizaron con el programa Graph-Pad-Prism (versión 3) usándose un valor de significancia de P < 0,05.

RESULTADOS

Al comienzo del estudio, previo a la suplementación, los animales de ambos grupos se encontraban con niveles adecuados de GSH-Px. El grupo No-S presentó una leve disminución (P > 0,05) en la actividad de GSH-Px, pero manteniéndose sobre los valores considerados como deficientes durante todo el estudio (figura 1). La suplementación con Se aumentó (P < 0,05) la actividad GSH-Px desde los 30 días a valores que fluctuaron entre 192 y 579 U/g Hb para llegar al final del periodo experimental con 389 U/g Hb (figura 1).

Figura 1. Actividad sanguínea de GSH-Px (promedio ± DE) en vaquillas suplementadas (Se-S, n = 16) y no suplementadas (No-S, n = 16) con selenato de bario.

La cinética de la respuesta inmune humoral a la doble administración de toxoide tetánico fue similar en ambos grupos (figura 2). La respuesta humoral primaria produjo un incremento (P < 0,05) en la concentración sérica de anticuerpos entre el día 0 y 15, la segunda inmunización (día 30) elevó (P > 0,05) levemente los títulos del día 15 en ambos grupos. No se observaron diferencias (P > 0,05) entre los animales Se-S y No-S.

Figura 2. Cinética de la producción de anticuerpos (promedio ± DE) contra toxoide tetánico, en vaquillas suplementadas con selenato de bario (Se-S) y no suplementadas (No-S) y vacunadas 120 y 150 días postsuplementación con selenio.

Kinetics (mean ± SD) of the production of antibodies against tetanus toxoid antigen in heifers supplemented (Se-S) and not supplemented (No-S) with barium selenate, vaccinated 120 and 150 days after the supplementation.

La administración de la vacuna RB51 desarrolló similar cinética de producción de anticuerpos en ambos grupos de animales, observándose un aumento (P < 0,05) entre el día 0 y 15 postinmunización (figura 3). No se observaron diferencias (P>0,05) en la producción de anticuerpos entre los animales Se-S y No-S.

Figura 3. Cinética de la producción de anticuerpos (promedio ± DE) contra proteína total de RB51, en vaquillas suplementadas con selenato de bario (Se-S) y no suplementadas (No-S) y vacunadas 60 días después de la suplementación con selenio.

Kinetics (mean ± SD) of the production of antibodies against total protein of strain RB51 antigen in heifers supplemented (Se-S) and not supplemented (No-S), with barium selenate vaccinated 120 and 150 days after the supplementation.

A las 72 horas de iniciada la prueba de intradermorreacción a las proteínas de Brucella abortus se observó aumento de volumen e induración local en ambos grupos de animales. El aumento de volumen entre la hora 0 y la hora 72 fue de 0,32 ± 0,26 cm para el grupo Se-S y de 0,64  ± 0,36 cm en el grupo No-S (P < 0,05). Las pruebas de intradermorreacción realizadas con tuberculina en los mismos animales y las realizadas con extracto de RB51 en terneras no vacunadas contra brucelosis fueron negativas.

DISCUSIÓN

La concentración de Se en el forraje utilizado para alimentar bovinos a pastoreo debe tener sobre 0,03 µg/g base materia seca, ya que dietas con concentraciones menores se asocian con alteraciones en la salud y la producción del ganado (Underwood y Suttle 1999). Aun cuando el predio en que se realizó el estudio tenía un contenido de Se en el forraje sólo levemente sobre dichos valores, los animales utilizados en la investigación mantenían una actividad de GSH-Px adecuada antes de la suplementación. Esta condición sugiere que se encontraban con un adecuado balance metabólico de Se, ya que la actividad de esta enzima es un buen indicador de su estatus en rumiantes (Stowe y Herdt 1992). Si bien es cierto que factores estacionales determinan fluctuaciones en la actividad de GSH-Px sanguínea (Ceballos y col 1998), es importante señalar que coincidente con el descenso en la actividad de GSH-Px el día 270 postsuplementación, las vaquillas se encontraban en el primer tercio de la gestación, condición que guarda relación con mayores requerimientos de nutrientes y minerales (NRC 2001).

La suplementación con selenato de bario tiene la ventaja que una dosis es capaz de mantener los niveles de Se durante varios meses (Lee y col 1999) y ha sido utilizada exitosamente en bovinos a pastoreo del sur de Chile (Wittwer y col 2002). En nuestro estudio, la administración de selenato de bario provocó un aumento de la actividad de GSH-Px desde el día 30, alcanzando valores entre 339 a 579 U/g Hb durante el período de estudio de la respuesta inmune. Bajo estas condiciones, la ausencia de diferencias en la respuesta inmune humoral al toxoide tetánico contrasta con lo señalado por Larsen y col (1988a), quienes describen aumento de la respuesta inmune humoral en ovinos suplementados con Se.

Por otra parte, el aumento observado en los títulos de anticuerpos contra RB51 entre el día 0 y 15, en ambos grupos de animales, corresponde a la respuesta secundaria, ya que las vaquillas habían sido vacunadas con RB51 entre los 6 y 8 meses edad, de acuerdo al programa nacional de control de brucelosis. La ausencia de diferencias entre ambos grupos a lo largo del período de estudio sugiere que la concentración de anticuerpos no se ve afectada por la suplementación con Se, similar a lo señalado por Nemec y col (1990) en un estudio realizado en vaquillas suplementadas con Se vía oral y estimuladas con la vacuna antibrucelosis Cepa 19. En este mismo sentido, diversos autores, utilizando estímulos antigénicos distintos a los de Brucella abortus, señalan que la suplementación con Se en animales Se-deficientes no produce efecto sobre la respuesta mediada por anticuerpos (Finch y Turner 1986; Blodgett y col 1986; McDonald y col 1989; Nicholson y col 1993). No obstante, bajo distintas condiciones experimentales, también se ha señalado que la deficiencia de Se en terneros en algunos casos no afecta (Reffet y col 1986) y en otros disminuye la respuesta inmune humoral (Reffet y col 1988).

La mayoría de los estudios realizados, tanto in vivo como in vitro para determinar el efecto del Se sobre la inmunidad celular, se basan en el efecto de la suplementación con Se o la deficiencia de este mineral, generalmente midiendo la reacción a mitógenos o la producción de linfocinas (Finch y Turner 1996). Las distintas condiciones experimentales en que se realizaron estos estudios hacen que los resultados se presenten contradictorios y difícilmente comparables. Por una parte, se señala que la suplementación con Se no influye en la respuesta celular (Segerson y Spears 1985; Blodgett y col 1986; Turner y col 1985), que la suplementación mejora esta respuesta (Turner y col 1985; Stabel y col 1990) y también la disminuye (Larsen y col 1988b). Por otra parte, otros estudios señalan que la deficiencia de Se no afecta la inmunidad celular (Aziz y Klesius 1985; Wuryastuti y col 1993) y otros señalan que la disminuye (Turner y col 1984). En nuestro estudio, llama la atención el efecto negativo de la suplementación con Se sobre la respuesta inmune celular, medida a través de la reacción dérmica. Esta observación es de particular importancia, ya que la respuesta celular es responsable de la protección contra la infección natural por Brucella abortus (Oliveira y col 2002; Wyckoff 2002). Con relación a este paradojal efecto, en rumiantes se ha visto que bajas dosis de Se son efectivas para aumentar las respuestas linfocíticas in vitro, pero altas dosis del mismo inhiben estas respuestas e incluso pueden tener un efecto tóxico sobre las células (Finch y Turner 1989; Stabel y col 1990). Esto podría explicar en parte los resultados obtenidos en el presente trabajo, ya que la suplementación con Se se efectuó en animales con un balance normal del mineral.

La asociación entre la deficiencia de Se y diversas patologías se encuentra bien establecida y ampliamente documentada (López-Alonso y col 1997). Sin embargo, los efectos sobre la inmunidad son más difíciles de correlacionar e interpretar. Aun así, de acuerdo a la discusión previa es posible plantear como hipótesis que un exceso en el aporte de Se o una dosis adecuada administrada en animales con un balance normal de Se, podría afectar negativamente los mecanismos reguladores de la respuesta inmune celular. Resolver esta hipótesis es de importancia relevante en los animales domésticos, ya que la suplementación normalmente se realiza asociada a esquemas de vacunación, particularmente el usado para el control de la brucelosis bovina. Además, esta respuesta juega un rol significativo en la defensa contra la infección natural por patógenos intracelulares.

Los resultados obtenidos permiten concluir que la suplementación con Se en vaquillas en pastoreo y con niveles adecuados de este mineral en el organismo, no afecta la respuesta inmune humoral al toxoide tetánico ni a la vacuna RB51, sin embargo, disminuye la respuesta inmune celular a la vacuna RB51. Debido a las impliciones clínicas que podría tener este hecho, es aconsejable realizar nuevos estudios orientados a determinar el rango en el cual el aporte de Se modula la respuesta inmune.

NOTAS

# Financiado por Proyecto Fondecyt Nº 119-0993.

1. Deposel®, Young Animal Health Ltd., NZ.

2. RANSEL®. Laboratorios Randox, Crumlin, UK.

3. Roche Diagnostics GmbH, Mannheim.

4. Professional Biological Company, Denver, Co, USA.

5. Sigma, St. Louis, MO.

6. Sigma, St. Louis, MO.

7. Bio-Rad, Hercules CA.

8. Capel, ICN Pharmaceuticals, Inc. USA.

9. Sigma, USA.

10. Instituto de Salud Pública de Chile, Santiago, Chile.

11. Sentinel Diagnostics, Milano, Italy.

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 V. Leyán1, D. Pesutic1, G. Schurig2, F. Wittwer3, P. A. Contreras3, J. Kruze4 1 Instituto de Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad Austral de Chile. 2 Virginia-Maryland Regional College of Veterinary Medicine Virginia Tech, USA. 3 Instituto de Ciencias Clínicas Veterinarias, Universidad Austral de Chile. 4 Instituto de Microbiología, Universidad Austral de Chile.