Construcción y expresión de una proteína recombinante de la envoltura del virus linfotrópico humano tipo I (HTLV-I)

• Summary
• Materiales y métodos
• Resultados
• Discusión
• Agradecimientos
• Referencias

RESUMEN

El virus linfotrópico humano tipo I de las células T (HTLV-I) es un oncorretrovirus asociado con la leucemia de células T adultas (ATL) y la Paraparesia Espástica Tropical (PET). El gen env del virus codifica la glicoproteína precursora gp62, que mediante procesamiento produce la gp21 (transmembranal) y la gp46 (superficie). Se ha demostrado la alta inmunorreactividad de la gp46 en sueros de individuos infectados. Con el propósito de obtener una proteína recombinante útil en diagnóstico y en una potencial vacuna, se clonó en el vector de expresión de Baculovirus "bácmido" pBlueBac4.5His el segmento de 144bp obtenido mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores que amplifican la región 5622-5765 nt. El construido pBlueBacRENV fue transfectado en células del insecto Mamestrae brassicae (clon MB 8003) recuperándose la proteína recombinante. La proteína RENV reaccionó específicamente con suero de personas infectadas con HTLV-I. Los resultados obtenidos mostraron que la proteína RENV puede ser utilizada para el diagnóstico serológico de la infección por HTLV-I y en la evaluación de nuevas vacunas.

Palabras clave: ADN recombinante. Retrovirus. gp46. HTLV-I. Clonación. Baculovirus.

SUMMARY

Human T-Cell Lymphotropic Virus Type I (HTLV-I) is an oncoretrovirus associated with Adult T-Cell Leukemia/Lymphoma (ATL) and Tropical Spastic Paraparesis (TSP). The viral env gen encodes gp62 glycoprotein precursor that is cleavage to produce the gp21 (transmembrane) and gp46 (surface). Previous reports showed that gp46 is highly immunoreactive in sera from infected individuals. With the purpose to obtain a recombinant protein to be used for diagnosis and potential vaccine, we cloned into Baculovirus expression vector pBluebac4.5His bacmids, the 144bp segment obtained by PCR with primers for 5622-5765 nt region. The construct pBlueBacRENV was transfected into insect cells of Mamestrae brassicae (MB 8003) and the recombinant protein was recovered. The protein showed cross reactions with sera of HTLV-I infected people exclusively. These results enabled us to propose this protein can be used in serologic diagnosis for HTLV-I infection and as a candidate for a vaccine.

Key word: Recombinant DNA. Retroviruses. gp46. HTLV-I. Cloning. Baculoviruses.

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El virus linfotrópico humano tipo I de las células T (HTLV-I) presenta una elevada seroprevalencia en el suroccidente colombiano, es el agente etiológico asociado con la leucemia de células T del adulto (ATL) y con una enfermedad neurodegenerativa denominada paraparesia espástica tropical/mielopatía asociada con el HTLV-I (PET/HAM)1. La PET/HAM y la ATL son dos enfermedades completamente diferentes a pesar de estar asociadas con el HTLV-I2,3.

El genoma del HTLV-I posee tres regiones genéticas que codifican los precursores de la nucleocápside (gag) del complejo transcriptasa reversa-polimerasa-integrasa (pol) y de las glicoproteínas de la envoltura viral (env). Además posee dos regiones de repetición largas en sus extremos denominadas LTRs. El producto del gen env del HTLV-I es la glicoproteína precursora gp62, que es procesada para producir las dos proteínas maduras de la envoltura del virión: la glicoproteína gp46 de superficie y la transmembranal gp21. La gp46 es esencial en las etapas tempranas de la infección viral y es la proteína más inmunogénica de todos los antígenos virales. Inicialmente Palker4, demostró que la proteína gp46 de la envoltura del HTLV-I es el antígeno viral predominante reconocido por anticuerpos circulantes en el suero de pacientes infectados con HTLV-I. También se ha demostrado que en otras infecciones retrovirales como en el caso del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1), la mayoría de los anticuerpos neutralizantes son dirigidos contra proteínas de envoltura2.

Estudios previos realizados por Palker4, revelaron variaciones en la reactividad de diferentes regiones de la proteína de envoltura del HTLV-I. Estos autores ensayaron tres péptidos sintéticos que cubrían diferentes dominios de la proteína gp62 y encontraron que la región más inmunoreactiva es la parte media que corresponde al dominio de superficie SU de la gp46. La información sobre los niveles de reactividad de anticuerpos humanos a regiones específicas de la gp62 es de gran utilidad en los procedimientos de diagnóstico clínico, tamizaje y en el desarrollo de una posible vacuna contra el HTLV-I5.

Uno de los objetivos más importantes de la biotecnología molecular es lograr la expresión de la información genética en sistemas heterólogos. Uno de los sistemas más utilizados para expresar proteínas de genes clonados es el sistema de Baculovirus. Este virus posee un promotor de expresión fuerte, derivado del promotor de polihedrina, el cual se ha insertado en plásmidos bacterianos para proveer un sistema de clonación de genes eucarióticos que pueden expresarse en células de insecto. Una de las ventajas de este sistema es poder expresar proteínas virales de otros organismos en un sistema seguro como son las células de insecto. En este trabajo se construyó el vector recombinante pBlueBacRENV y se expresó en células del insecto Mamestrae brassicae (MB8003) una proteína recombinante del epítope B (161-206 a.a.) de la gp46 de la superficie del HTLV-I. El producto obtenido mostró reactividad inmunológica con el suero de pacientes infectados con el HTLV-I. Los resultados obtenidos demostraron que esta proteína recombinante puede ser potencialmente útil para el desarrollo de pruebas de detección de anticuerpos específicos para el virus. Además, se considera que esta proteína podría ser utilizada como inmunoprotectora en un potencial desarrollo de una vacuna efectiva que controle la infección por el HTLV-I.