Técnicas histológicas
Enviado por Maximo Contreras
- Equipos y materiales de un laboratorio general de técnicas histológicas
- Toma de muestra. Fijación
- Métodos de deshidratación, aclaración e inclusión en parafina
- Microtomia o corte de los tejidos
- Método de Golgi
- Técnica del ácido peryódico de Schiff (técnica de pas)
- Coloraciones tricrómicas
- Observación e interpretación de los preparados histológicos
- Referencias documentales consultadas
SESIÓN I
Equipos y materiales de un laboratorio general de técnicas histológicas
Prof. Elizabeth de Zambrano
AMBIENTE:
– Salón con paredes de bloque o concreto
Ventilación adecuada o aire acondicionado
Iluminación suficiente
Fregaderos
Mesones
CUARTO DE ALMACENAMIENTO DE SUSTANCIAS:
Extractor
Ventilador
Estantes de metal
Organización de las sustancias de acuerdo al Manual de Almacenamiento Seguro de Productos Químicos del Departamento de Higiene y Seguridad de la U.L.A
EQUIPOS:
Balanzas analíticas
pH metro
Neveras, freezer
Estufas
Micrótomos
Criostato
Microscopio
Lupa estereoscópica
Hornilla eléctrica
Planchas de calentamiento
Agitador magnético
Baño de María
Archivadores para bloques de parafina y portaobjetos
Destilador de agua
Campana extractora
MATERIALES:
Reactivos (alcoholes, formaldehído, ácidos, bases, sales, aclarantes)
Anestésicos: éter, pentotal
Colorantes (hematoxilina, eosina, resorcina, fucsina, azul de anilina, carmín, escarlata de Biebrich, verde luz, azul de toluidina)
Soluciones adherentes: albúmina, gelatina, resinas
Medios de inclusión: parafina, celoidina, resinas
Medios de montaje: bálsamo de Canadá, Martex
Matraces y balones pyrex (volúmenes variables)
Probetas graduadas (calibres variables)
Pipetas serológicas y pasteur
Tubos de ensayo
Embudos
Varillas de vidrio para agitar
Vasos de precipitado (capacidades variables)
Capsulas de petri pyrex
Láminas portaobjetos y cubreobjetos
Jarra de coplin
Cubetas y cestas de vidrio
Pailas con mango de porcelana
Guantes, bata de laboratorio
Equipo de disección: mangos de bisturí, pinzas anatómicas y hemostáticas con y sin diente, gubias, tijeras punta recta y curva, pinzas, hojillas
Inyectadoras, cánulas, agujas
Algodón, gasas
Papel parafilm y de filtro (watman44)
Pinzas (sujetador de láminas)
Pinceles
Espátulas metálicas
Perillas y succionadores de caucho
Frascos transparentes y ámbar
Soporte universal y plexiglass
Moldes para la confección de los bloques de parafina
Cepillos para lavar cristalería
SESIÓN II
Toma de muestra. Fijación
Prof. Mario Salas Méndez
Toma de muestra.
Todos los pasos de la técnica histológica son muy importantes para la obtención de resultados finales satisfactorios, pero de este primer paso, depende que se puedan apreciar los detalles de las estructuras a estudiar.
El punto más importante, tiene que ver con el corte y el tamaño de la muestra a utilizar, ya que de ello depende el éxito del resto de los pasos del proceso.
"A menor tamaño de la muestra, mejores resultados en las fases siguientes"
Se dice que el tamaño de la muestra para microscopía fotónica, debe ser no mayor de un centímetro cúbico (1 cm3 ), para que la fijación sea adecuada y facilite los pasos siguientes de la técnica.
Recomendaciones para tomar las muestras:
1- La muestra debe ser tratada en forma cuidadosa con el instrumental, para evitar lesiones traumáticas de los tejidos (el instrumental, es el kit conocido como equipo de disección)
2- Las muestras deben ser pequeñas para facilitar el proceso de fijación
3- El corte de la muestra debe ser realizado con hojillas de bisturí, o en su defecto, hojillas de afeitar en perfectas condiciones, para que los bordes de la muestra sean los adecuados, evitando así áreas con cortes irregulares
4- Luego de tomada la muestra, esta debe ser introducida de inmediato en el recipiente con fijador (fijación por inmersión)
La forma en que se tome la muestra, va a depender del tipo de fijación a utilizar, de acuerdo a la técnica seleccionada:
Si la fijación es por inmersión, la muestra debe ser colocada inmediatamente después de ser tomada en el recipiente con fijador, que siempre debe estar listo para tal fin.
Si la fijación es por perfusión, este proceso de fijación es previo a la toma de la muestra. Luego de tomada debe ser colocada de igual forma en recipiente con fijador.
Fijación.
Es el procedimiento de la técnica histológica, que tiene como finalidad, conservar de manera permanente, una estructura lo más semejante al estado que tenia in vivo
"Existe una innumerable variedad de fluidos fijadores que han sido desarrollados para este propósito; pero solo un pequeño número de ellos tienen un uso rutinario"
Objetivos de la fijación
1- Preservación de la estructura lo más semejante al estado viviente
2- Penetración y acción rápida sobre los tejidos
3- Evitar los cambios post-mortem
4- Preparar los tejidos para los tratamientos subsiguientes
5- Impedir la formación de artefactos
6- Impedir la desaparición de sustancias solubles, durante y después de la fijación
7- Evitar la retracción de los tejidos
"No existe el fijador ideal; todos tienen sus fortalezas y debilidades"
Consideraciones para elegir un fijador
1- Preservación de los detalles celulares
2- Tasa de penetración
3- Cantidad del daño ocasionado
4- Técnica de coloración o marcaje
"El objeto del estudio es quien determina el tipo de fijador a ser utilizado"
Métodos de fijación.
Inmersión:
Es el método más utilizado y simple desde el punto de vista técnico. Utiliza recipientes con tapa de cierre hermético que evita la evaporación del fijador que contiene. Como norma se dice que la cantidad de fijador a utilizar, está en una proporción de 10:1. Esto quiere decir, que la cantidad de fijador debe ser 10 veces mayor al tamaño de la muestra a fijar.
Este tipo de fijación tiene como limitación, que extrae con frecuencia sustancias intracelulares, por lo que su uso depende del objetivo final de la técnica
Evaporación:
Utilizado para fijar células aisladas y membranas. Este método impide la extracción de sustancias intracelulares.
La fijación es más rápida, ya que los gases tienen una alta tasa de penetración en los tejidos. Ejemplos: Gases de Tetraóxido de Osmio (OsO4), vapor de Formalina (poca calidad)
Este tipo de fijación, plantea varias dificultades técnicas para su realización y tiene un uso limitado.
Perfusión:
En el método de mayor utilización en animales de experimentación, ya que el líquido fijador es inoculado en el sistema circulatorio del espécimen, por lo tanto, fija en principio de adentro, hacia fuera de los órganos a estudiar, lo que da excelentes resultados cuando la técnica es realizada con éxito.
Hay dos tipos de fijación por perfusión: De gran circuito y de pequeño circuito. El primero, se realiza inoculando el fijador a partir del corazón (ventrículo izquierdo) por lo que la fijación ocurre en todos los órganos del espécimen; en la de pequeño circuito, el fijador se inyecta solo en una porción del animal, fijando solo la parte de interés para el investigador. Ej. Se inocula la arteria renal si lo que se requiere es solo el riñón.
Tipos de fijadores
-De acuerdo a su acción sobre las proteínas (Coagulantes y No coagulantes)
-De acuerdo a su origen general (Físicos y Químicos)
Ambas clasificaciones utilizan las mismas sustancias, la diferencia está en que la primera explica el mecanismo de acción del fijador (que será ampliada durante la sesión teórica del tema). La segunda clasificación es la más utilizada desde el punto de vista práctico, por lo que es la que será tratada en esta recopilación.
Fijadores Físicos.
Calor: Tiene utilidad en Microbiología y Bacteriología donde tiene excelentes resultados. No es de uso rutinario en Histología
Frío: Es muy utilizado cuando se requiere mantener en buenas condiciones y en su lugar, las diversas sustancias intracelulares, especialmente para técnicas de histoquímica o inmunohistoquímica. Las diversas formas de fijación por frío serán tratadas en la sesión teórica del tema
Fijadores Químicos.
Simples: Son sustancias químicas de estructura no compleja, que se mezclan con agua destilada para lograr la proporción adecuada. Ejemplos:
•Ac. Acético
•Alcohol etílico C2H5OH
•Formaldehido H-CHO
•Ac. Pícrico
•Ac. Crómico
•Dicromato de potasio K2Cr2O7
•Bicloruro de Mercurio HgCl2
•Tetraóxido de osmio OsO4
•Glutaraldehido
•Permanganato de potasio KMnO4
Compuestos o Mezclas fijadoras: Se originan por la combinación de varios de los fijadores químicos simples, y tienen usos particulares para los cuales fueron creados. Ejemplos:
•Formol tamponado
•Formol calcio
•Líquido de Zenker
•Líquido de Bouin
•Líquido de Helly
•Fijador de Carnoy
•Líquido de Flemming
•Zenker-formalina
ANEXOS:
A. Preparación del fijador Formol tamponado al 10%.
Utiliza Formol puro, el cual va a ser disuelto al 10% en Buffer Fosfato. Esto le da mejores resultados a la fijación, ya que acerca el pH del fijador al de los tejidos.
Preparación del Buffer Fosfato (0.1M, pH 6,3):
1. Se preparan dos soluciones denominadas A y B
Solución A:
Fosfato monobásico de sodio (NaHPO4) ————————— 13,8 gr.
Agua destilada ——————————————————— 1000 cc
Solución B:
Fosfato monobásico de sodio (Na2HPO4) ————————— 35,8 gr.
Agua destilada ——————————————————— 1000 cc
2. Para preparar 100 cc del Buffer fosfato, se mezclan:
22.5 cc de la solución A, y
77.5 cc de la solución B
3. Finalmente, se mezclan 10 cc de formol puro con 90 cc del buffer fosfato para la obtención de 100 cc de formol tamponado.
Proceso de fijación por perfusión cardíaca de rata:
Materiales a utilizar
1.Dos recipientes de suero, uno con fijador, y el otro con solución fisiológica
2.Dos equipos de infusión con su soporte
3.Equipo de disección
4.Cánula para perfusión
5.Soporte de madera e hilo pabilo para la inmovilización
6.Papel absorbente, inyectadoras, anestésicos, guantes
Procedimiento:
1.Anestesia del espécimen con pentotal sódico (40mg./Kg.) o Ketamina (100mg./Kg.) por vía intraperitoneal. También puede ser utilizado éter o cloroformo por inhalación en campana de vidrio
2.Fijar el espécimen a un soporte que sostenga todas sus extremidades
3.Hacer incisión medial de la piel para exponer la caja toráxica
4.Realizar dos incisiones a la parrilla costal en las líneas axilares anteriores y levantar la parrilla costal
5.Exponer el corazón y localizar el ventrículo izquierdo
6.Hacer una pequeña incisión con el bisturí en dicho ventrículo e introducir la cánula hasta llegar a la arteria aorta ascendente. Ligar la cánula a la aorta en forma cuidadosa
7.Comenzar a pasar la solución fisiológica (isotérmica al espécimen) a través de la cánula para extraer por completo la sangre del animal, esto con la finalidad de evitar vasoconstricción. Simultaneo a este paso, se debe hacer una pequeña incisión en el ventrículo derecho del animal, para que drene el liquido que está siendo introducido
8.Cuando se observe que la solución fisiológica ya está drenando por el ventrículo derecho, es el momento de iniciar la perfusión con el líquido fijador, en este caso, formol tamponado al 10% durante 30-40 minutos aproximadamente
9.En el momento en que el fijador penetra en el torrente circulatorio, se observa que el animal comienza a presentar fibrilaciones musculares, lo que indica que el fijador esta pasando en forma adecuada.
10.Luego de agotado el tiempo, se desmonta el espécimen y se aprecia que tiene la apariencia de piel tipo suela, lo que indica una fijación satisfactoria en principio
11.Se hace la disección de los órganos a utilizar, se hacen los cortes en piezas del tamaño respectivo, y se colocan de inmediato en líquido fijador (por inmersión) para seguir luego con los siguientes pasos de la técnica.
Fotografía de la fijación por perfusión cardíaca
SESIÓN III
Métodos de deshidratación, aclaración e inclusión en parafina
1.-MÉTODOS DE DESHIDRATACIÓN
Prof. Belkys Chacín
La deshidratación es el proceso que tiene por finalidad la remoción o eliminación completa del agua de los tejidos o muestra tisular para que se pueda embeber adecuadamente en un medio de inclusión no hidrosoluble, para que se solidifique y así permitir el corte de los tejidos.
La deshidratación podrá realizarse utilizando cualquier reactivo capaz de absorber el agua de los tejidos, mediante el empleo de agentes químicos deshidratantes, entre los cuales se encuentran los alcoholes, o por procedimientos físico-químicos como la criodesecación y la criosustitución.
Un buen agente deshidratante debe cumplir con las siguientes condiciones:
No debe alterar las estructuras titulares.
Debe poder mezclarse con el reactivo intermediario o agente aclarante.
Debe ser rápido.
Reducir a un mínimo necesario el endurecimiento que provoca en los tejidos
Baja toxicidad o peligrosidad (por contacto, ingestión, inhalación y evaporación de gases tóxicos.
Mínimos riesgos de incendio/explosión.
Para el proceso de deshidratación se prefiere utilizar los alcoholes isopropílico o etílico, debiéndose cumplir con los siguientes parámetros:
1) Graduación de los alcoholes: Empleando una serie de alcoholes de gradación ascendente (70%,80%,95% y 100%), se evitaría la marcada retracción del tejido por la acción brusca que produciría someterlo a una elevada gradación de este agente deshidratante.
2) Volumen y número de baños de deshidratación: El volumen de baño debe por lo menos 10 veces superior al volumen de la muestra que se vea a deshidratar. Se recomienda realizar el mayor número de baños para ayudar a un estado de equilibrio entre el estado de hidratación del tejido y el alcohol.
3) Duración de la deshidratación: Se halla en función del volumen de los fragmentos titulares y de su contenido de agua. Debe ser completa y evitar exposiciones prolongadas para no provocar endurecimiento de los tejidos.
4) Empleo de agentes accesorios: Como el Sulfato de cobre anhidro, óxido de calcio, resinas humectantes, etc., porque eliminan el exceso de agua en el propio agente deshidratante consiguiendo un efecto deshidratante más uniforme.
Principales agentes deshidratantes:
Alcohol etílico
Alcohol metílico
Acetona
Alcohol butílico
Dióxido de etileno
Alcohol isopropílico
Tetrahidrofurano
ESQUEMA CORTO DE DESHIDRATACIÓN PARA BIOPSIAS
Y FRAGMENTOS PEQUEÑOS DE TEJIDOS
Tiempo total de procesamiento 3 – 4 horas
Enjuague muy brevemente la muestra de tejido en agua corriente.
Colocar la muestra de tejido en alcohol al 80%.
Someter la muestra de tejido a alcohol al 95% realizándose 3 cambios de 15 minutos cada uno.
Someter la muestra de tejido a alcohol absoluto, se realizarán 3 cambios de 15 minutos cada uno.
Colocación de la muestra a partes iguales de alcohol absoluto y xilol 15 minutos.
Colocación de la muestra en Xilol realizando 2 cambios de 15 minutos cada uno.
Colocación en parafina realizándose 3 cambios de 15 minutos cada uno.
Incluir la muestra de tejido.
PROCESO MANUAL PARA DESHIDRATAR ESPECÍMENES GENERALES
Enjuague brevemente la muestra en agua corriente.
Se realizarán 5 cambios de alcohol de 45 minutos cada uno. Si el espécimen o muestra de tejido es grande 60 minutos cada uno. 80%, 90%, 95% y 99%.
1 cambio de xilol-alcohol de 45 minutos. Si la muestra es grande 60 minutos.
2 cambios de xilol de 45 minutos cada uno. Si es grande el espécimen 60 minutos cada uno.
3 cambios de parafina de 45 minutos cada uno. Si es grande la muestra 60 minutos cada uno.
2.-INCLUSIÓN, GENERALIDADES:
Prof. Dunia González G.
Es el procedimiento mas utilizado que se realiza para poder cortar los tejidos tratados, en secciones suficientemente delgadas que permitan el paso de la luz, de modo que los detalles finos puedan ser observados con distintos microscopios en sus diversas capas. Aunque los tejidos adquieren cierta consistencia al ser sometidos a la fijación, por lo general continúan siendo demasiado blandos para poder cortarlos en láminas delgadas (para Microscopía óptica) o ultrafinas (para microscopia electrónica de transmisión); por lo tanto es necesario que la porción de tejido a estudiar infiltre y englobe dentro de sí una sustancia líquida o semilíquida, de modo que una vez solidificada adquiera la suficiente dureza para formar bloques que puedan cortarse.
Los materiales empleados con esta finalidad, por lo general son sustancias como la parafina, celoidina o gelatina (para Microscopía óptica) y resinas epóxicas o plásticas (maraglas, metacrilatos), para microscopia electrónica de transmisión. También pueden utilizarse como medios de inclusión, procedimientos físicos como la congelación con CO2 comprimido o freon a – 150º C; éste tipo de procedimiento se utiliza con tejidos frescos (recién tomada la muestra). Se requiere del uso de microtomos de congelación, criostato y de personal experto, pues es necesaria la destreza y mayor rapidez en la ejecución, ya que el tejido al congelarse si no es cortado rápidamente, se le forman cristales de agua que ocasionan deterioro de la nuestra. Se utiliza este tipo de inclusión para el estudio de biopsias y de histoquímica celular (ejem: lípidos, enzimas). Otra modalidad de inclusión es el encastrado, en este se utilizan bloques previamente confeccionados en parafina, a los cuales se les orada (perfora) para colocar la muestra y se le va agregando parafina fundida hasta cubrirla totalmente. Al solidificar se realizan los cortes; esta modalidad de inclusión es utilizada generalmente para tejido nervioso.
INCLUSIÓN EN PARAFINA:
La parafina es un hidrocarburo saturado de cadena lineal, es un residuo del petróleo obtenido por destilación del crudo; de color blanquecino, insoluble en agua, soluble en cloroformo, xilol, toluol, benzol. Es muy estable químicamente. A temperatura ambiente se solidifica y funde a temperaturas comprendidas entre 33 y 60ºC, se emplea para elaborar productos farmacéuticos, cosméticos, de laboratorio, fabricación de aislantes e impermeabilizantes. Tiene amplias aplicaciones industriales, se puede mezclar con otros materiales que le proporcionan una gama de funciones deseables. Se presenta en el comercio de forma granular o en panelas.
Para la inclusión en parafina deben cumplirse los siguientes pasos:
La parafina sólida, se hace líquida, fundiéndola sobre una platina (plancha metálica, eléctrica con temperatura regulable), introducida en recipientes de porcelana, resistentes al calor.
Se lleva la muestra al recipiente que contiene parafina líquida (se debe mantener la temperatura constante entre 50º a 56ºC, por un tiempo de 24 horas en la estufa), para iniciar así la fase de infiltración.
La muestra se debe pasar por 3 baños de parafina líquida, en recipientes separados (cada 2 horas, en uno), en las condiciones previamente descritas, para que ésta penetre profundamente.
Porción de tejido así tratada (fin de la fase de infiltración), se retira de la última parafina líquida (la mas pura) y se lleva al recipiente formador del bloque, constituido por ejemplo por una base de cobre y 2 barras de acero (de Leukart), para realizar la inclusión definitiva. Pueden utilizarse además cajitas especiales confeccionadas en cartón o cartulina o cajas plásticas especiales (de reciente aparición en el mercado) o metálicas.
La muestra se sumerge en parafina, bien orientada, centrada y se identifica; se le va colocando parafina líquida hasta llenar la caja formada por las barras de Leukart y la base de cobre; o con los otros tipos de cajas; se deja solidificar por varias horas.
Se desmolda el material solidificado y se lleva al microtomo el bloque así formado y previamente tallado en forma de pirámide truncada, para ajustarlo al portabloque y se procede al siguiente paso de la técnica histológica: los cortes
SESIÓN IV
Microtomia o corte de los tejidos
Sr. Edgar Laguna Campos
¿Que es la microtomía?
Es el proceso que tiene como finalidad la obtención de cortes muy delgados del tejido o espécimen que se encuentra incluido en la parafina. Esta se realiza por medio de un instrumento llamado micrótomo
Existen diversos tipos de micrótomo, siendo algunos adaptados para un trabajo especial. Generalmente se consideran cinco clases de micrótomo: Rotación, Deslizamiento, Balanceo, Congelación y para cortes ultra delgados.
Micrótomo de Rotación.
Es el micrótomo mas empleado. La cuchilla es relativamente pequeña permaneciendo en una posición muy peligrosa (con el filo hacia arriba). No conviene para cortar bloques grandes.
Micrótomo de Deslizamiento.
Es el instrumento de mayor preferencia. Tiene un sujetador de cuchilla ajustable tanto para el ángulo de deslizamiento horizontal como angular. Permite obtener grandes cortes y se puede emplear cuchillas mayores que los que usan los de rotación.
Micrótomo de Balanceo.
Probablemente es el micrótomo más simple que existe. El bloque del tejido se monta en el extremo de un brazo móvil y la cuchilla se mantiene rígida en posición horizontal con el filo hacia arriba.
Micrótomo por Congelación.
Se define de muchos maneras, pero en general, poseen una cremallera central sobre la cual se coloca el congelador del bloque el cual es perforado y unido por un tubo a un cilindro que contiene Bióxido de Carbono.
Cuchillas para Micrótomo.
1) Cuchillas convencionales: Las cuchillas convencionales son grandes y pesadas. Su tamaño varia entre 110mm y 250mm. Sus perfiles están designados para aplicaciones especificas.
2) Cuchillas desechables: Proveen excelente filo para cortar parafina. Estas son de diferente tamaño y grosor.
Porta cuchillas o Jolder: Es de acero inoxidable para cuchillas desechables.
PASOS A SEGUIR PARA OBTENER CORTES EN PARAFINA:
1- Antes de cortar un bloque hay que examinarlo y saber como va a ser orientado en el portabloque.
2- Remover el exceso de parafina de los lados.
3- Colocar el bloque en el porta bloque.
4- Ajuste preciso con los tornillos del porta bloque.
5- Orientar y ajustar con los tornillos de direccionamiento (laterales y vertical) hasta que el bloque quede completamente paralelo al porta cuchilla.
6- Colocar la cuchilla.
7- Proceder a tomar rebanadas gruesas hasta visualizar por completo el tejido (10 a 15 micras).
8- Una vez que la superficie tisular entera este expuesta reajustar las micras (el numero de estas es de acuerdo al tipo de tejido que estemos trabajando).
9- Tomar el corte con agujas histológicas y colocarlas en el baño de flotación o bien sea en plancha de calentamiento hasta que los cortes queden completamente estirados y sin burbujas.
10- Recoger con el porta objeto el corte y colocarlo en gradillas a la estufa de 37°
El paso de la plancha de calentamiento se realiza de la siguiente manera:
a) Tomar el porta objeto e impregnarlo con agua gelatinosa.
b) Colocar el corte sobre el porta objeto.
c) Colocarlo en la plancha de calentamiento que debe estar por debajo del punto de fusión de la parafina (30° a 35°).
d) Una vez estirados los cortes (tiempo aproximados de 5 a 10 seg.) colocarlos en una gradilla para el secado (en estufa de 37°).
NOTA: estas laminas en la estufa pueden permanecer hasta mas de 24hrs.
BAÑO DE FLOTACIÓN
El baño de flotación debe estar a una temperatura unos cuantos grados por debajo del punto de fusión de la parafina. El uso de agua destilada en el baño de agua ayuda a eliminar burbujas de aire. Puede usarse sin embargo, agua corriente.
La cinta se coloca suavemente en el baño de flotación para eliminar arrugas y aire atrapado debajo. Se separan luego las secciones individualmente y se colocan en las láminas limpias previamente marcadas. Las láminas se dejan escurrir verticalmente por varios minutos antes de colocarlas dentro de la estufa o microondas a una temperatura entre 37°C y 40°C por 5 o 10 minutos (en la estufa) o 2 minutos y 30 segundos en el microondas. Si las láminas no se dejan escurrir, habrá burbujas de aire bajo el tejido y la adhesión de la sección de tejido a la lámina va a disminuir.
SELLADO DE LOS BLOQUES
Una vez que la secciones deseadas se hallan cortado, remueva el bloque del portabloque y selle la superficie expuesta con parafina derretida. Esto hace que los tejidos no se sequen y que no se expongan duros y quebradizos, facilitando así la obtención de nuevas secciones semanas, meses, y aun años mas tarde.
ADHESIVOS PARA LAS SECCIONES
Se emplean las gelatinas y la polilisina. La gelatina se añade al baño de flotación (cantidad mínima) Y la polilisina se coloca una gota en la lamina y se frota con otra. Se deja secar al aire libre para su uso ulterior. Es recomendada en cortes muy finos por su gran adhesión a la lamina evitando que el tejido se desprenda durante la tinción.
Dilución: 90cc de agua destilada y 10cc de polilisina
SESIÓN V
DESPARAFINAJE
COLORACIÓN CON HEMATOXILINA Y EOSINA
MONTAJE
Prof. Carlos Mendoza Gaviria
DESPARAFINAJE
Antes de proceder a realizar la coloración, los cortes de tejidos se encuentran imbibidos en parafina solidificada, adosados a las láminas portaobjetos gracias a la utilización de gelatina, polilisina o albúmina de Mayer. Para que los colorantes Hematoxilina (disuelto en solución acuosa) y Eosina (disuelto en solución alcohólica) puedan penetrar en los tejidos, el corte deber ser desparafinado, para ello las láminas se someten al siguiente procedimiento:
Se introducen en la incubadora a 60 °C por 3 minutos.
3 baños rápidos en xilol (en 3 recipientes distintos con el solvente), el ultimo baño debe ser más prolongado (3-5 minutos), agitar suavemente.
COLORACIÓN
Principios generales de la coloración
En términos genéricos, los tejidos de origen animal son incoloros, la finalidad de utilizar coloraciones en los preparados histológicos es poder contrastar y diferenciar estructuras que por lo general no poseen color propio.
El fundamento de cualquier método de tinción radica en la propiedad que poseen todos los tejidos para incorporar y fijar de modo variable diversas sustancias coloreadas llamadas colorantes. Una agrupación atómica aromática incapaz de colorear cuando se une desde el punto de vista químico con un cromóforo se convierte en un cromógeno, que posee color propio y es capaz de transferir ese color a cualquier estructura celular que posea afinidad o atracción por esa sustancia colorante. Los principales grupos cromóforos conocidos son los radicales etileno (>C=CC=O), tiazólico (>C=S), imino (>C=N), azoico (–N=N–), nitroso (–N=O), nitro (–NO2) y en general cualquier anillo derivado de las quinonas.
La conversión de un cromógeno en colorante está vinculada a la adición sobre la molécula aromática, de otros grupos atómicos que le confieren la propiedad de disociarse de manera electrolítica o de formar sales con lo tejidos. Estos radicales reciben la denominación genérica de grupos auxocromos (potenciadores de color).
Según la naturaleza de la vinculación molecular entre los colorantes y los tejidos, existen tres mecanismos generales: de carácter físico, fisicoquímico o histoquímico. Estos mecanismos combinados entre sí en distinta medida explican las particularidades de las principales técnicas de tinción en histología.
Los mecanismos de carácter puramente físico están ligados a las propiedades de disolución (solubilidad) e impregnación (adsorción) del colorante sobre el tejido. En el primer caso, el colorante es más soluble en el tejido que en el solvente que actúa como medio de transporte, de forma que tiende a pasar desde el solvente hasta el tejido. En el caso de la impregnación, el colorante, por su gran volumen molecular o por una precipitación selectiva en forma de agregados insolubles, queda atrapado entre la malla de células y fibras que constituyen los tejidos.
Las tinciones ligadas a un mecanismo principalmente químico están basadas en el desarrollo de una reacción química entre el colorante y la estructura objeto de la tinción de forma que al interaccionar ambos se produce un nuevo cromógeno responsable del color obtenido.
Los mecanismos fisicoquímicos de coloración tisular están vinculados a la formación de uniones intermoleculares por atracción electrostática (principalmente las fuerzas de van der Waals) o por fuerzas de tensión superficial. Los primeros se basan en la propiedad de ligarse entre sí moléculas con carga eléctrica contraria, de manera que los colorantes de carácter ácido tiñen las estructuras básicas, y viceversa.
Los fenómenos de tensión superficial, responsables de la interacción molecular en los líquidos, son debidos a las fuerzas de gravitación generadas al disponerse las moléculas muy próximas entre sí. Este tipo de mecanismo tintorial está implicado fundamentalmente en coloraciones que utilizan moléculas en dispersión coloidal para interaccionar con agregados moleculares dispuestos en la superficie de la estructura a colorear.
La absorción luminosa de las sustancias coloreadas se debe a la resonancia, conocida como un factor de entrecruzamiento para la estabilidad molecular.
Clasificación de los colorantes
De acuerdo al origen, se clasifican en naturales y sintéticos, éstos últimos derivados de la anilina. Desde el punto de vista químico se clasifican en básicos y ácidos. Los colorantes básicos, son electropositivos, se caracterizan por poseer átomos de nitrógeno y las propiedades tintoriales se deben a la presencia de grupos amino (NH2). Los colorantes ácidos son electronegativos, poseen átomos de oxígeno y las propiedades tintoriales se deben a la existencia de grupos hidroxilo (OH) y sulfidrilo (SH).
Basofilia
Se define como basofilia, la afinidad de ciertas estructuras celulares y tisulares de naturaleza química ácida por colorantes básicos. Por ejemplo, el núcleo celular en donde se encuentran los ácidos nucleicos ADN y ARN, es una estructura basófila, de igual manera, en aquellas células ricas en ARN ribosomal en el citoplasma como los plasmocitos o células plasmáticas, éste tiende a ser basófilo.
Acidofilia o Eosinofilia
Por el contrario, la acidofilia es la característica tintorial definida como la afinidad que poseen ciertas estructuras celulares y tisulares, por lo general de naturaleza química básica por colorantes de naturaleza química ácida. Por ejemplo, las proteínas citoplasmáticas se comportan como bases al pH en el que se realiza la coloración con hematoxilina y eosina, por lo que son afines al colorante ácido, que en este caso es la eosina.
Hematoxilina
La hematoxilina es un colorante natural y de naturaleza química básica que se extrae de la corteza del árbol Hematoxylon campechianum, oriundo de Centroamérica. En el comercio se encuentra en forma de cristales rosados o amarillentos solubles en agua o en alcohol. Tradicionalmente se ha mantenido que la hematoxilina en su forma natural no es un colorante, para ser empleada como tal, ha de ser oxidada previamente a hemateína. Tras el proceso de oxidación, normalmente se debe incrementar su capacidad tintorial agregándole determinados grupos auxocromos que, además, le confieren un carácter fuertemente básico y son los responsables de su especificidad por los núcleos celulares. Como auxocromos se emplean sales metálicas bivalentes o trivalentes, por lo general en forma de alumbres de tal forma que se forman diversas lacas de hematoxilina de carácter catiónico y tonalidad azulada o negruzca, dependiendo de la sal metálica utilizada. La laca de hematoxilina más utilizada es la producida a partir del alumbre alumínico-potásico, conocida también en forma genérica como hemalumbre.
Para la preparación de la hematoxilina utilizada en nuestro Laboratorio el protocolo es el siguiente:
Procedimiento:
Calentar la mitad del volumen de agua destilada a una temperatura por debajo del punto de ebullición.
Pesar el alumbre de amonio o de potasio y agregarlo al agua que se está calentando hasta que se disuelva.
Pesar los cristales de hematoxilina y agregarlos hasta que se disuelvan (aproximadamente en 20 minutos).
Agregar el resto del agua destilada.
Pesar y agregar el ácido cítrico, dejar reposar por 10 minutos.
Pesar y agregar el yodato de sodio, dejar reposar por 10 minutos.
Pesar y agregar el hidrato de cloral, dejar reposar por 10 minutos.
Envasar en frasco ámbar y almacenar en la oscuridad. Mientras más tiempo permanezca en depósito, el proceso de maduración del colorante será mejor y se obtendrán mejores resultados.
Eosina
La eosina es un colorante xanténico artificial y de naturaleza química ácida, es un derivado hidroxianténico halogenado con tres grupos arilo. Las diferencias de coloración que existen entre ellos están motivadas por el tipo y número de átomos de halógeno que contienen (eosina Y: cuatro átomos de bromo y la eosina B: dos átomos de bromo). En general, los colorantes xanténicos tienen autofluorescencia espontánea y colorean los tejidos de diversas tonalidades entre rojo y rosado. Por lo común, se difunden fácilmente en las estructuras hísticas, sobre todo en las más compactas, a las cuales tiñen debido a que, por su carácter ácido, son atraídos fuertemente hacia los radicales básicos de la histidina, lisina y arginina presentes en las proteínas citoplasmáticas y tisulares.
Para la preparación de la eosina (solución madre), el procedimiento es el siguiente:
Procedimiento:
Preparar las 2 soluciones por separado. Las dos soluciones constituyen la solución madre.
Tomar 1 parte de la solución madre y 3 partes de alcohol al 70 %.
Agregar 3 –6 gotas de ácido acético.
Método de la hematoxilina-eosina
Existen múltiples variantes, según se emplee un tipo u otro de eosina y de hematoxilina (generalmente se emplea la de Harris, aunque también se emplean la de Mayer y la de Ehrlich). Por lo común, este método siempre consta de una etapa inicial, en la que se colorean los núcleos celulares con la hematoxilina, y una fase ulterior de contraste citoplasmático y de los componentes extracelulares con la eosina.
Procedimiento Técnico:
Soluciones:
Xilol
Alcohol isopropílico al 95 %
Agua corriente
Hematoxilina
Eosina
Xilol/Alcohol
Protocolo:
Después del desparafinaje, 3 baños en alcohol isopropílico al 95 % (3 recipientes distintos), el último baño debe ser el más prolongado (5 minutos).
Baño en agua corriente durante 2-3 minutos, agitar suavemente.
Baño en hematoxilina por 5 minutos
Baño en agua corriente por 5 minutos.
Baño en eosina, sumergir la lámina porta-objetos y sacarla inmediatamente.
3 baños rápidos en alcohol isopropílico al 95 %.
1 baño rápido en la solución de xilol/alcohol.
2 baños rápidos en xilol.
MONTAJE
Cuando se extrae el porta-objetos del último baño con xilol (baño de aclaramiento), se coloca una gota de bálsamo de Canadá, de Martex® o de Merckoglass®, sobre un extremo del corte y se deja caer suavemente la laminilla cubre-objetos, limpiando luego cualquier exceso, al endurecer el bálsamo, el Martex® o el Merckoglass®, la lámina porta-objetos protegida con la laminilla cubre-objetos, se puede observar con el microscopio.
RESULTADOS ESPERADOS CON LA COLORACIÓN
Núcleos Azul/negro.
Eritrocitos Naranja a rosado.
Restantes estructuras Rosado a rojizo.
OBSERVACIONES
La causa más común de una tinción inadecuada en la técnica hematoxilina-eosina es la mala fijación tisular. Otras causas a considerar son el exceso o defecto de oxidación de la hemateína o de diferenciación de la coloración y el empleo de una hematoxilina vieja o utilizada excesivamente.
SESIÓN VI
TÉCNICAS ESPECIALES.
Prof. Arisela Díaz
Para el estudio del tejido nervioso, clásica y habitualmente se han usado como control varias técnicas de coloración ejemplo: H-E, y técnicas a base de anilinas (azul de toluidina, cresyl violeta, tionina,)etc, que revelan ciertos detalles citoplasmáticos, solo nos permite ver los cuerpos de las células (neuronales y/o gliales), no así sus prolongaciones. Para un estudio citoarquitectónico apropiado es necesario aplicar los métodos de impregnación con metales pesados. El mas célebre de los métodos metálico es el de Golgi, ideada por Camilo Golgi (1873) o alguna de sus variantes. La difusión de esta técnica al inicio, fue relativamente lenta, y paulatinamente se ha reconocido en el campo de la neurociencias, como un método de gran importancia y aplicación, que llegó a revolucionar la investigación en esta disciplina. A pesar del avance tecnológico esta técnica seguirá siendo una herramienta válida para el estudio morfológico del sistema nervioso.
Esta técnica es conocida como el método de "la reacción negra", que conduce al término de impregnación y no de coloración, ya que la coloración está condicionada por la absorción de determinadas longitudes de onda, que depende de la(s) sustancia(s) colorante(s) empleadas en el proceso de coloración; y las características químicas de la muestra, así como el grosor de las mismas; en cambio en la impregnación como se emplean metales pesados, (ejm plata), el precipitado de microcristales formado, absorbe todas las longitudes de onda del rayo de luz que atraviesa el corte de tejido bajo observación, por lo que se impide la creación de cualesquiera de los colores de la esfera luminosa.
Con este método es posible observar las células nerviosas aisladas o en grupos (poblaciones), impregnadas en tonos oscuros sobre un fondo homogéneo y claro, apreciándose no tan solo el soma, sino también sus procesos. Detectándose en estas células casi todo el territorio del árbol dendrítico e inclusive, sus espinas y varicosidades. A pesar que es difícil la impregnación de la totalidad del axón incluyendo sus ramificaciones, se puede obtener una apropiada y orientadora impregnación de su longitud.
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