Protoplastos vegetales, aislamiento y cultivo

Los protoplastos son células vegetales que han sido separadas de su pared celular mediante un tratamiento enzimático o mecánico y adoptan forma esférica en el medio de cultivo (Fig. 1).

Fig. 1 Protoplastos vegetales

http://ruisoares65.pbworks.com/w/page/24326349/Protoplastos

Tiene propiedades y aplicaciones interesantes:

• Pueden multiplicarse y desarrollar estructuras similares a embriones y desde ellos, plantas adultas.

• Permite chequear células en vez de plantas enteras para seleccionar una característica ventajosa (ej. Resistencia o tolerancia a un herbicida).

• Las células vegetales se pueden hacer crecer en un medio liquido en el laboratorio o en grandes biorreactores, como fuentes de productos secundarios tales como medicamentos u otros productos industriales.

• Pueden fusionarse con protoplastos de otros tipos o especies, obteniendo híbridos somáticos incluso de especies sexualmente incompatibles. La fusión de protoplastos también perite el intercambio de orgánulos citoplasmáticos y la recombinación génica entre genomas mitocondriales o clroplásticas diferentes.

• Pueden incorporar nuevos genes mediante vectores adecuados (virus, plásmidos, microinyecciones, fusiones de protoplastos…). Podemos chequear el resultado del constructo génico en el protoplasto o regenerar la planta. Estos transgenes permiten a las plantas modificar y mejorar sus características ( Ej. Mayor resistencia a plagas, rango de salinidad mas amplio, mejores características organolépticas,..).

• Permiten obtener líneas celulares dihaploides a partir de cultivos haploides. Se hace con un tratamiento con colchicina que origina la no separación de los núcleos hijos tras la duplicación del número de cromosomas. Los dihaploides generan líneas homocigotas rápidamente, interesantes en programas de multiplicación [1]

El primer aislamiento de protoplastos vivos fue el descrito por Klerccker (1892), quien tuvo éxito al aislar protoplastos de cebolla usando métodos mecánicos. El primer aislamientos por métodos enzimáticos se hizo en células de levadura, utilizando jugo gástrico del caracol Hélix pomotia (Giaja, 1919); aunque en ese momento no se conocía el mecanismo de degradación enzimática de la pared celular, las observaciones de este trabajo fueron importantes ya que el método permitió aislar altas cantidades de protoplastos.

Aislamiento de protoplastos

1.2 Método mecánico: El cual posee un bajo rendimiento, es un procedimiento tedioso y presenta una aplicabilidad limitada. Consiste básicamente en un choque osmótico para producir plasmólisis celular y ruptura de la pared. Los protoplastos se liberan de las células rotas mediante el restablecimiento de su nivel osmótico.

1.3 Método enzimático: Consiste en la incubación de las células en una mezcla de enzimas que degradan la pared celular: celulasas, hemicelulasas y pectinasas. Las preparaciones comerciales de dichas enzimas contienen además proteasas, nucleasas y lipasas.

Los principales factores que se deben considerar para el éxito de este método son:

• El tipo de enzimas que se usaran.

• La composición del medio en que ellas actuarán.

• El material de origen de los protoplastos.

Cultivo de protoplastos

El cultivo de protoplastos es un método en cultivo de tejidos donde se puede originar variación somaclonal para el desarrollo de nuevos tipos de plantas.. Se han desarrollado técnicas especiales con la finalidad de liberar protoplastos desnudos desde los confines de sus paredes y permitir que cada protoplasto individual pueda regenerar en cultivo de tejido hacia una planta.

2.1Sistema de Cultivo

Para inducir la división de los protoplastos aislados y la formación de sus colonias, se han desarrollado diferentes sistemas de cultivo. Generalmente, los protoplastos se cultivan en cajas de Petri plásticas en un medio liquido, o en uno solidificado con agar o agarosa. El medio liquido tiene la desventaja de que , a menudo presenta dificultades para aislar las colonias derivadas de una célula, mientras en el medio sólido los protoplastos inmovilizados producen clones celulares; se requiere, sin embrago, una manipulación manual para transferidos a otro medio.

El medio liquido se usa colocándolo en capas delgadas o en gotas de 50 a 250 &µl (kao et al., 1971). El medio sólido se una mezclando en él los protoplastos cuando tenga de 35 a 40 °C, y depositándolo, en capas delgadas, en las cajas de Petri (Nagata et al,. 1971). Las cajas de Petri se sellan con parafilm y se cultivan en la oscuridad o en la luz difusa a una temperatura de 24 a 28°C.

Los medios adecuados para el cultivo de protoplastos siguen generalmente el modelo de los utilizados para el cultivo de células in vitro; a menudo se han desarrollado diferentes modificaciones, pero básicamente deben tener componentes como sales inorgánicas, estabilizadores osmóticos, reguladores de crecimiento, extractos naturales como (levadura, CH, aminoácido, vitaminas, ácidos orgánicos, azucares entre otros.

Fig.2 Aislamiento y Cultivo de protoplastos (Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT)

Finalmente, la metodología básica para la manipulación y extracción de protoplastos consisten en 5 pasos: Aislamiento, purificación, determinación de viabilidad (Toma de oxigeno, actividad fotosintética y tinciones), cultivo (Medio de cultivo MS o B, solido o liquido, osmolaridad, densidad de plaqueo, condiciones de almacenamiento, y material vegetal) y regeneración (Organogénesis y embriogénesis). La fuente del material, los tratamientos pre-enzimáticos y enzimáticos y la osmolaridad son factores que afectan la producción y viabilidad de los protoplastos.

Hibridación somática de protoplastos

La hibridación somática es una técnica que puede permitir que diferentes especies de la misma familia sean cruzada, representa una opción para transferir características que se encuentran en las especies silvestres hacia las especies cultivadas, la fusión de protoplastos facilita el flujo genético entre las especies que permite superar las barreras para la hibridación sexual interespecífica. De igual forma, esto es usualmente imposible siguiendo el proceso normal de regeneración sexual de las plantas. Estableciendo cultivos de protoplastos de cada especie, los cultivos pueden ser mezclados y algunos protoplastos de cada especie se fusionarán al azar. Por una cuidadosa selección y cultivo, se podrán regenerar plántulas desde estos protoplastos híbridos y ser ensayados por características deseables in vivo.

Fig.3 Hibridación somátics

Referencias

[1] ALONSO J. R. 2011. Manual de Histología Vegetal. Ediciones Mundi-Prensa. Pág. 252. Fuente:http://books.google.com.co/books?id=URwHpBfK_68C&pg=PA252&dq=protoplasto+vegetales&hl=es&ei=Qz1ZT7raD46-gAfnz4WjCw&sa=X&oi=book_result&ct=book- humbnail&resnum=7&ved=0CFEQ6wEwBg#v=onepage&q=protoplasto%20vegetales&f=false

[2] L. Szabados. Protoplastos: aislamiento, cultivo y regeneración de plantas. Fuente: http://webapp.ciat.cgiar.org/biotechnology/cultivo_tejidos/capitulo10_parte1.pdf

Autor:

Juan Gabriel Albornoz