Vitrificación como técnica de crioconservación de embriones bovinos (página 2)

4. Crioprotectores

Los embriones, al ser congelados, necesitan ser deshidratados parcialmente a fin de evitar la formación de cristales que lesionan las estructuras citoplasmáticas (). Esta deshidratación se logra incorporando un agente crioprotector al medio de congelación. En la congelación de embriones se utilizan dos tipos de crioprotectores:

PERMEABLES O INTRACELULARES: De bajo peso molecular, Glicerol (G), Dimetilsulfóxido (DMSO), 1-2 propanodiol, etilenglicol (EG), propilenglicol (PG), polietilenglicol (PEG), etanol y otros alcoholes; todos estos compuestos deshidratan la célula penetrando a ésta para ayudar a proteger el citoplasma (Miyake y col., 1993).

IMPERMEABLES O EXTRACELULARES: De alto peso molecular, polivinilpirrolidona (PVP), glucosa, fructosa, ficol, dextrano sorbitol, sucrosa, lactosa, trealosa, rafinosa y otros azucares (Kuleshova y col., 1999), estos compuestos extraen el agua libre intracelular utilizando la diferencia de presión osmótica sin penetrar a la célula; son efectivos para preservar la funcionalidad y estructura de las membranas a baja actividad de agua; deshidratan junto con el crioprotector las células de los embriones durante el equilibrio (Sommerfeld y Nieman, 1999).

Los crioprotectores previenen la deshidratación total y la degeneración proteica, causada por la congelación del agua intra y extracelular durante el proceso. Además, no deben ser tóxicos a los embriones. Para reducir el daño osmótico y tóxico del crioprotector, debido a la alta concentración de sales, se ha dejado de utilizar G y DMSO para hacer uso de EG, solo o en combinación con sucrosa o trealosa que ha demostrado ser menos tóxico (Dochi y col., 1990; Leeuw y col., 1994). Dado su bajo peso molecular, el EG tendría una mayor velocidad de penetración y, por ende, necesitaría menor tiempo de exposición, disminuyendo su efecto tóxico (Saha y col., 1996).

Se ha demostrado lo importante que es el estado de desarrollo embrionario en la velocidad de penetración del crioprotector. Leibo (1977) demostró que la permeabilidad de los embriones a los crioprotectores se incrementa luego de la fecundación, aumentando a medida que el desarrollo embrionario progresa. Esto se debería a la diferencia que existe en la relación área/volumen en un embrión en los primeros estadios del desarrollo.

La etapa del desarrollo más apropiada para la vitrificación en etilenglicol es la mórula compacta y blastocisto temprano de embriones producidos in vivo o in vitro (Cocero y col., 2000), así como también se ha demostrado que embriones producidos in vitro tienen menor tolerancia a la congelación debido a la formación de hielo intracelular, aumento en la concentración de lípidos y enzimas que digieren la zona pelúcida, lo que los hace más sensibles al enfriamiento y a la invasión de virus, bacterias y hongos (Saha y col., 1995; Semple y col., 1995; Kobayasi y col., 1994; Le Gal y Massip, 1999; Dattena y col., 2000). Otro aspecto a considerar es la calidad de los embriones a vitrificar, ya que cuando se congelan embriones de buena calidad, se obtienen mejores resultados que cuando se congelan aquellos de calidad regular (Humbolt y col., 1987).

Está claro que la congelabilidad de los embriones mamíferos varía con la especie del animal. Esta diferencia de especie está claramente establecida entre embriones bovinos, porcinos y equinos. Sin embargo trabajos recientes demuestran que embriones de bovinos, ovinos, ratones y conejos tienen un comportamiento similar a la congelabilidad (Hasler y col., 1995; Sommerfeld y Niemann, 1999; Saha y col., 1996).

5. Conservacion de embriones

Los embriones pueden ser conservados, in vitro, para su posterior transferencia mediante: Cultivo a temperatura ambiente, refrigeración entre 0 °C a + 4 °C ó congelación a –196 °C.

CONSERVACION A TEMPERATURA AMBIENTE. Un paso indispensable en la transferencia de embriones es la conservación temporal de embriones recobrados de una donadora antes de ser transferidos o congelados, ésta se realiza en un medio de Solución Buffer Fosfato (PBS), suplementado con 10% suero, una fuente de proteínas que reduce la tensión superficial favorece la sedimentación, evita que los embriones se adhieran a algún elemento utilizado para su manipulación, incorpora sustancias promotoras del crecimiento que favorecen su desarrollo, absorbe e inhibe metales pesados tóxicos que puedan estar presentes en el medio. La viabilidad embrionaria declina después de 12 horas (Palma y Brem, 1993).

REFRIGERACION. Ha quedado claro que embriones de bovinos mantenidos en un medio no nutritivo por un largo tiempo y a temperatura ambiente decrecen ampliamente su capacidad de desarrollo, este desarrollo puede ser preservado si los embriones se refrigeran de 0 a 4 ºC por no más de 24 horas (Refsdal y col., 1988). La refrigeración se efectúa vehiculizando los embriones en PBS envasados en pajuelas de 0.25 ml y colocadas en un refrigerador. Se utiliza hielo y agua para regular el descenso de la temperatura, de manera similar a como se realiza la estabilización del semen (Landsverk y col. 1992). La refrigeración de embriones puede ser considerada como una alternativa interesante cuando no sea posible recurrir a la congelación.

CONGELACION ESTANDAR. El método de congelación estándar posibilitó a Wilmut y Rowson (1973)obtener el primer ternero nacido de la transferencia de un embrión congelado. Al método estándar se le han efectuado desde entonces distintas modificaciones tendientes a su simplificación.

En el método de congelación estándar la exposición de los embriones al medio de congelación (PBS + G) debe realizarse a temperatura ambiente (20 – 22 °C), en un solo paso, de 10 a 30 minutos de duración (Chupin y Procureur, 1984; Niemann, 1991). Este período incluye el envasado de los embriones en pajuelas plásticas. Esto permite realizar más rápidamente y con mayor precisión la inducción de la cristalización o "seeding" (Maurer, 1978). Las pajuelas deben ser colocadas en un equipo de congelación a -7 °C durante 5 minutos para equilibrar la temperatura de las pajuelas con la del equipo; el seeding se realiza poniendo en contacto la superficie de la pajuela con una placa metálica enfriada con nitrógeno líquido (NL2); el agente refrigerante del equipo puede ser nitrógeno líquido alcohol o etanol enfriado por medio de un compresor.

El no inducir la cristalización conduce a la formación de cristales de hielo bajo un estado de súperenfriamiento y a una elevación repentina de temperatura (se genera calor latente de –10º – –15 ºC), resultando un severo trauma físico que puede dañar las células (Niemann, 1995).

Una vez efectuado el seeding, se mantiene la temperatura estable durante 10 minutos (período de estabilización) y luego se desciende a una velocidad de entre 0.1 y 0.5 °C hasta -30 ó -35 C para establecer un adecuado balance entre deshidratación y formación de hielo intracelular, en este momento las pajuelas pueden ser retiradas del equipo de congelación y sumergidas en nitrógeno líquido (Lehnjensen y Greve, 1982). La descongelación se realiza de manera rápida, sumergiendo las pajuelas en baño María a 30 ó 35 °C durante 20–30 segundos.

CONGELACION RAPIDA. Método desarrollado por Chupin (1986). Los embriones son deshidratados parcialmente como ocurre en el método estándar, luego se les deshidrata nuevamente colocándolos en una solución mixta de glicerol y sucrosa. Esta segunda deshidratación deja a los embriones en condiciones de ser enfriados rápidamente. Las pajuelas son colocadas en el cuello del termo de nitrógeno, durante 5 minutos, posteriormente son sumergidas al NL. Los resultados obtenidos fueron dispares, según el estadio de desarrollo del embrión congelado. Martino y col. (1996)realizaron modificaciones, congelando ovocitos en gradillas de microscopio electrónico con 1 µl de EG sumergiéndolas inmediatamente en NL. Obteniendo tasas de sobrevivencia semejantes a los de ovocitos expuestos al EG, pero sin congelamiento.

VITRIFICACION. La vitrificación es un proceso físico de solidificación utilizado para conservar órganos, tejidos y embriones. La solución vitrificante (SV) lleva incorporado crioprotectores en alta concentración. Al ser enfriada no cristaliza, sino que se torna viscosa y pasa del estado líquido a un estado sólido no estructurado similar al vidrio, tomando de ahí su nombre. Todo el procedimiento desde el equilibrio hasta la inmersión en NL no requiere más de 10 minutos (Fahy y col., 1984; Rall y Fahy, 1985).

Durante el proceso de vitrificación, el embrión esta sometido a deshidratación durante el enfriamiento e hidratación durante el descongelamiento. Esto se debería a que a medida que desciende la temperatura, se va formando mayor número de cristales de hielo provenientes de agua pura intracelular, y así la concentración del soluto va aumentando en los espacios que aún no se congelan. Este choque osmótico es conocido como "efecto solución", y puede llegar a ser dañino para la sobrevivencia del embrión (Scheider y Mazur, 1984), debido a la pérdida del equilibrio de las soluciones intra y extracelulares, respuestas químicas y osmóticas de las células a dichos efectos.

Para obtener buenos resultados se deben tomar en cuenta los siguientes factores: volumen de la muestra, concentración de crioprotector, método de adición, temperatura y tiempo de equilibrio, solidificación, tasa de enfriamiento y cambios en el volumen (Arav y col., 2000), debido a que estos factores están estrechamente relacionados con la permeabilidad y la toxicidad del crioprotector (Miyake y col., 1993).

El máximo daño en el embrión durante el enfriamiento ocurre de -15 a -16 ºC debido a la fase de transición de la membrana lipídica. Esta fase se ve afectada por la fusión de los liposomas afectando el termocomportamiento de las membranas en la transición de líquido a gel (Zeron y col., 2000) y la velocidad de penetración de los crioprotectores (Thompson, 1997; Pugh y col., 2000). El daño celular incluye pérdida de microvellosidades, disrupción de la membrana plasmática, cambios mitocondriales, hinchamiento del retículo endoplásmico, pérdida de uniones entre células así como fractura de zona pelúcida (Edashige y col, 1999; Ohboshi y col., 1998).

TECNICAS DE VITRIFICACION. Antes de la vitrificación, los embriones deben ser equilibrados con el crioprotector a temperatura ambiente. La metodología descrita por Sheffen y col. (1986)indica que la exposición a la solución de equilibrio (SE) (10% G + 20% PG en PBS) debe realizarse a temperatura ambiente (20 ºC), durante 10 minutos y la exposición a la SV (25% G + 25% PG) a 4 ºC. Dobrinsky y col. (1991)deshidrataron al embrión en SE (10% G y 25% PG) por 7 minutos a 20 ºC, pasando a SV (25% G y 25% PG) manteniendo la misma temperatura hasta introducirlo al NL.

Dochi y col. (1990) y Kasai (1996) equilibraron mórulas y blastocistos bovinos (10% G + 20% 1–2 Propanodiol) durante 10 minutos, luego los expusieron a SV (25% G + 25% 1-2 Propanodiol + sucrosa 1M en PBS), inmediatamente después de cerrada, la pajuela se introdujo lenta y progresivamente en el nitrógeno para que se produzca simultáneamente la vitrificación de los compartimentos extra e intracelulares, lo que posibilitó transferir los embriones a campo. Utilizando estas soluciones se obtuvo porcentajes de preñez del 50%, demostrando que son soluciones estables con poca tendencia a cristalizar durante el enfriamiento.

Sommerfeld y Niemann (1999)vitrificaron embriones bovinos producidos in vitro (IVP) con EG 1.5 – 1.8 M, teniendo porcentajes de desarrollo del 42%. Dochi y col. (1995)utilizaron 40% EG, 20% PVP y 11,3% trealosa, para determinar la toxicidad de la vitrificación con relación a la temperatura y tiempo de exposición. El tratamiento fue llevado a cabo a 20 ºC, durante 5 minutos, en PBS, obteniendo tasas de desarrollo del 84%.

Rall y Fahy (1985) y Massip y col. (1987)vitrificaron embriones de ratón de 8 células, éstos se equilibraron progresivamente a 4 ºC, con DMSO 20.5%, acetamida 15.5%, PG 10% y PEG 6% en PBS Dulbeco modificado, luego se sumergieron en NL. Los embriones sobrevivieron después de ser cultivados in vitro y se obtuvieron nacimientos vivos en un 39.1%.

Vajta y col. (1996a)equilibraron embriones de 7 días en SV al 50% (12.5% EG y 12.5% DMSO + 75% PBS) a temperatura ambiente durante 5 minutos, fueron transferidos a SV al 100% (25% EG y 25% DMSO) a 4 ºC durante 20 segundos y posteriormente sumergidos en nitrógeno, obteniendo altas tasas de preñez con blastocistos tempranos. Dhali y col. (2000)utilizaron una combinación de EG 3.5M y DMSO 3.4M con un tiempo de equilibrio de 3 minutos obteniendo tasas de desarrollo del 69%. Yang y col. (2000) probaron la adición de PVP (10%) y Trealosa (0.3M) obteniendo porcentajes de preñez del 50% en embriones producidos in vitro y 55% en embriones producidos in vivo.

La técnica descrita por Vajta y col. (1996a) ha sido usada para vitrificar embriones posterior a la biopsia, para un eventual uso en el sexaje de embriones (Vajta y col., 1996b; Vajta y col., 1997a), sin afectar el desarrollo hasta blastocisto sobre los controles.

La misma técnica se ha usado también para vitrificar embriones posterior a una eclosión asistida de los blastocistos (Vajta y col., 1997b) sin afectar el desarrollo posterior sobre los controles. Saito (1994), Saito e Imai (1997), Donnay y col. (1998)vitrificaron blastocistos de bovinos en tres pasos 1) 5 minutos (Sucrosa 0.1M, Xilosa 0.1M, PG 1%, G 10%,.); 2) 5 minutos (Sucrosa 0.1M, Xilosa 0.1M, PG 1%, Glicerol 10%, EG 10%) 3) 1 minuto (Sucrosa 0.1M, Xilosa 0.1M, PG 1%, G 10%, EG 20%), en Dulbeco-PBS a temperatura ambiente y posteriormente sumergidos en NL. Obteniendo tasas de desarrollo del 72%, 88,9% y 71% respectivamente. Kaidi y col. (2000), López y López (2000)utilizaron la misma técnica empleando embriones de ovinos y conejos, mejorando los resultados antes mencionados. Este método, en dos pasos, había sido descrito por Sheffen y col. (1986) en embriones de ratón, obteniendo resultados similares a los de sus colegas, más no así Viscarra (1996).

La descongelación puede realizarse exponiendo las pajuelas a temperatura ambiente durante 10 segundos antes de colocarlas en baño María 30-35 ºC, 20-30 segundos (Rall y Meyer, 1986). En ésta debe estar presente un agente permeable extracelular como la albúmina sérica bovina (BSA) que proteja y estabilice las membranas celulares para que no se detenga el transporte de agua a través de éstas, evitando que la célula sufra lisis durante la difusión del crioprotector y daño en la capa trofoblástica (Saha y col., 1996; Massip y col., 1987).

Los crioprotectores pueden ser removidos de los embriones en tres y seis pasos en forma escalonada, hasta lograr una concentración final de PBS sin crioprotector. Saito (1994) utilizó dos pasos sucrosa 0.5M. y 0.25M, manteniendo al embrión durante cinco minutos en cada una. El embrión también puede transferirse en forma directa. Leibo (1984) desarrolló técnicas que permiten extraer el glicerol dentro de la pajuela, modificación conocida como "método de un solo paso en pajuela", donde la variación radica en la disposición de las distintas soluciones (0.24M sucrosa, 1.4M G con el embrión y 0.25M sucrosa en PBS divididas las soluciones por columnas de aire).

Esta técnica permite transferir embriones congelados a campo sin necesidad de equipos y laboratorios muy costosos, obteniendo tasas de preñez que oscilan entre el 30 y el 50 %. Cuando el glicerol es extraído dentro de la pajuela, los porcentajes de preñez se pueden ver afectados por prescindir de la evaluación morfológica (Niemann, 1991).

En los últimos trabajos realizados en vitrificación se ha intentado reducir al máximo el daño celular, por los crioprotectores, su concentración y su volumen. Esto llevó a Vajta y col. (1997c, 1998) a ensayar una técnica de vitrificación denominada OPS (Open Pulled Straw) que consiste en adelgazar una pajuela plástica de 0.25 ml, calentándola sobre una platina y estirándola en su parte central hasta que su diámetro interior llegue a 0.7- 0.8 mm. Luego de enfriada la pajuela es cortada en su parte más delgada. El embrión es recogido por la parte más fina de la pajuela mediante capilaridad y luego esta es inmediatamente sumergida en NL. Embriones de 8 días sobrevivieron al cultivo en un 81% utilizando este método.

Kong y col. (2000)vitrificaron en una ultra mini pajilla (1.0 – 0.8 mm de diámetro) para reducir el daño por el alto volumen de la SV, obteniendo tasas de desarrollo a la descongelación y cultivo del 72%.

Recientemente se ha ensayado el uso de diferentes tipos de contenedores para vitrificación de embriones, como son las gradillas de cobre para microscopio electrónico (Martino y col., 1996) y las mallas de nylon (Matsumoto y col., 2001). En estos contenedores se logró vitrificar de 15 a 65 embriones a la vez. Los resultados obtenidos utilizando estas técnicas de vitrificación fueron similares a sus controles y ofrecen una nueva alternativa para criopreservar gran número de embriones.

6. Conclusiones

El resultado de la vitrificación está condicionado previamente por dos factores. La calidad del embrión y el estado de desarrollo embrionario. Cuando se congelan embriones de calidades muy buena y buena se obtienen mejores resultados que cuando se congelan aquellos de calidad regular. La etapa del desarrollo más apropiada para la vitrificación de embriones es mórula compacta a blastocisto expandido, siendo más sensibles a las bajas temperaturas los embriones producidos in vitro.

Para elegir el mejor método de vitrificación se deben tomar en cuenta diferentes factores como son los siguientes: crioprotectores a utilizar, estos deben manejarse en adecuada concentración, adicionarse al embrión en forma creciente y a tiempos determinados, en combinación con otros crioprotectores que sean de baja toxicidad, para que sean utilizados con el menor volumen posible, temperatura de adición y con tasas de enfriamiento lo suficientemente rápidas para evitar la pérdida del equilibrio osmótico y causar daño celular que comprometa la viabilidad embrionaria.

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