Identificación del género Clostridium (página 2)

Generalmente, las células vegetativas tienen forma de bacilos, pudiendo variar desde bacilos cocoides cortos a largos bacilos filamentosos. Pueden aparecer sueltos, en parejas o en cadenas. La mayoría de las especies suelen teñirse como grampositivas, pero hay excepciones como C. clostridioforme y C. ramosum que suelen ser gramnegativos incluso en cultivos jóvenes de 24 h. Clostridium tetani puede aparecer como gramnegativo después de la formación de esporas. Las esporas pueden tener forma oval o esférica y aparecer en situación terminal o subterminal. La demostración de esporas, es difícil en algunas especies como C. perfringens, C. ramosum y C. clostridioforme.

La mayoría de las especies son móviles por medio de flagelos perítricos; C. perfringens, C. ramosum y C. innocuum son inmóviles. Raramente producen catalasa pero cuando lo hacen, la reacción es débilmente positiva. La mayoría son anaerobios obligados moderados, con excepciones como C. haemolyticum y C. novyi tipo B, que son anaerobios obligados estrictos (no crecen cuando se exponen a niveles de oxígeno mayores al 0,5%) o C. tertium, C. carnis, C. histolyticum y alguna cepa de C. perfringens, que son aerotolerantes.

Algunas especies son sacarolíticas (fermentación de la glucosa), otras proteolíticas (hidrólisis de la gelatina) y otras pueden tener ambas características. Algunas especies producen lecitinasa o lipasa que pueden demostrarse en agar yema de huevo. La lecitinasa (alfa-toxina, fosolipasa C) produce un halo opaco alrededor de la colonia por lisis de la lecitina y la lipasa transforma las grasas en glicerol y ácidos grasos, dando una capa iridiscente que cubre la superficie de la colonia.

DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DE INFECCIONES DE PIEL Y TEJIDOS BLANDOS POR Clostridium

Selección, recolección y transporte adecuado de muestras clínicas

Se seguirán las precauciones debidas para la toma de muestras que

puedan contener bacterias anaerobias.

-En infecciones de tejidos o abscesos con superficie intacta, la toma se efectuará por punción percutánea y aspiración, procurando que no penetre aire, previo lavado y desinfección.

-En focos o heridas abiertas, debe limpiarse el orificio del drenaje con solución salina estéril y tomar la muestra de la parte más profunda por aspiración.

-En la gangrena gaseosa son buenas muestras las procedentes del desbridamiento quirúrgico de las lesiones, así como las obtenidas por aspiración de las burbujas o ampollas que se forman en la piel.

-Generalmente, las muestras en escobillón no son adecuadas y únicamente se utilizarán ante la imposibilidad de obtener la muestra de las formas anteriormente indicadas.

-El material obtenido debe enviarse en tubo estéril o vial de transporte de anaerobios lo antes posible al laboratorio para su procesamiento.

Medios de cultivo e incubación

Para la recuperación de bacterias del género Clostridium a partir de muestras clínicas, se pueden utilizar los siguientes medios: agar sangre para anaerobios, como agar Brucella, agar sangre PEA, agar Schaedler, agar sangre para anaerobios CDC, etc. Es conveniente incluir un medio con yema de huevo para investigar la producción de lipasa y lecitinasa y un medio líquido de enriquecimiento, como el tioglicolato. La incubación se hará a 35-37ºC en anaerobiosis (cámaras, jarras o bolsas con generadores de atmósfera anaerobia).

Identificación de especies de Clostridium

El examen de la típica morfología tanto microscópica como de la colonia permite una identificación presuntiva y rápida de algunas especies de Clostridium frecuentemente aisladas (tabla 2). Además, junto con la utilización de pruebas bioquímicas sencillas como el estudio de la producción de lecitinasa y lipasa en agar yema de huevo, la hidrólisis de la gelatina y de la urea y la producción de indol por el método rápido (p-dimetil-aminocinnamaldehído), constituyen un método fácil y poco costoso para la identificación, incluso definitiva, de algunas de ellas.

Por las características particulares de algunas especies, se pueden presentar ciertos problemas en el proceso de identificación que pueden ser fácilmente resueltos:

-Las especies que se tiñen gramnegativas pueden identificarse como grampositivas por la resistencia a un disco de colistina de 10 μg y la sensibilidad a uno de vancomicina de 5 μg.

-Las especies aerotolerantes se pueden diferenciar de miembros del género Bacillus porque Clostridium crece mucho mejor en anaerobiosis, es catalasa negativo (o muy débilmente positiva) y esporula sólo en condiciones anaerobias, mientras que Bacillus crece mejor en aerobiosis, es catalasa positivo y generalmente no esporula enanaerobiosis.

-Las esporas de algunas especies son difíciles de observar y puede ser necesaria una técnica de selección de esporas, bien por tratamiento con calor a 70-80ºC o con etanol.

Cuando son visibles, es suficiente la tinción de Gram, las tinciones especiales para esporas no suelen ofrecer ventajas adicionales.

-Las colonias pueden presentar un aspecto pleomórfico dando la impresión de un cultivo mixto. Debe hacerse un subcultivo de una simple colonia para comprobar el mismo pleomorfismo.

Para la identificación definitiva, los métodos utilizados tradicionalmente para anaerobios, como la determinación de sus características fermentativas y bioquímicas con los medios líquidos prerreducidos (PRAS) y la determinación de los productos metabólicos por cromatografía líquido-gaseosa o el análisis de los ácidos grasos de la pared han proporcionado en general buenos resultados. Sin embargo, estas técnicas están sólo disponibles en algunos laboratorios.

En los últimos años, el interés por la utilización de métodos asequibles a todos los  tipos de laboratorios clínicos ha dado lugar a la aparición de sistemas comerciales para laidentificación rápida de anaerobios. Unos están basados en pruebas bioquímicas (API 20 A o Minitek) y consiguen los resultados en 24-48 h. Otros como Anaerobe ANI Card, Rapid ID 32 A, Rapid Anaerobe ID, Crystal Anaerobe ID o RapID-ANA están basados en la detección de enzimas preformadas a partir de sustratos cromogénicos y la lectura se realiza a las 4 h.

El porcentaje de identificación correcta que se obtiene con ellos oscila entre 60-80%. Casi el 100% de las cepas de C. perfringens son identificadas correctamente mientras que los mayores fallos se producen con cepas de C. inocuum, C. difficile, C. sporogenes, C. tetani y C. clostridioforme.

SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS

Los antibióticos activos frente a bacterias anaerobias, son activos frente a la mayoría de cepas de Clostridium, pero existen algunas excepciones.

· Clostridium ramosum, C. butyricum y C. clostridioforme, pueden producir ß-lactamasas inducibles por antibióticos ß-lactámicos. La presencia de estas enzimas se puede investigar por el método de la cefalosporina cromogénica, utilizando como sustrato nitrocefina (Cefinaseâ, Becton-Dickinson). Aunque se ha detectado un aumento de la resistencia a la penicilina en C. perfringens, no se ha demostrado la producción de ßlactamasas en esta especie, lo cual podría reflejar otros mecanismos como la disminución en la afinidad por las proteínas fijadora de penicilina (PBP).

· La resistencia a la clindamicina se ha documentado en cepas de C. perfringens, C. ramosum, C. difficile, C. tertium, C. subterminale, C. butyricum, C. sporogenes y C. innocuum. En el año 1991 Alados et al. encontraron un 9% de resistencia a este antibiótico en las cepas de C. perfringens aisladas en el Hospital Virgen de las Nieves de Granada.

· Clostridium tertium es resistente a los ß-lactámicos, clindamicina y metronidazol y la mayoría de las cepas de C. innocuum son sólo moderadamente sensibles a lavancomicina.

La realización de pruebas de sensibilidad in vitro a los antimicrobianos en estas bacterias están indicadas en pacientes con enfermedad grave, que requieren tratamientos prolongados, que no responden al tratamiento empírico, en especies generalmente asociadas a resistencias y como vigilancia de los patrones de resistencia de la comunidad y hospitalaria.

La dilución en agar es el método de referencia del NCCLS, pero para las pruebas habituales en los laboratorios clínicos los paneles comerciales de microdilución en caldo (Sensititre o ATB ANA) y el E-test® son unas buenas opciones, presentando además, una buena correlación con dicho método de referencia. Con el E-test®, el metronidazol puede dar falsas resistencias, problema que parece eliminarse si la placa es pre-reducida en atmósfera anaerobia durante 18-24 h antes de la prueba. Por el contrario, la clindamicina puede dar falsos sensibles, recomendándose para este antibiótico un periodo de incubación de 48 h que permita detectar la expresión retrasada de la resistencia inducible.

MATERIAL

♥ Asa bacteriológica

♥ Mechero

♥ Tubos con caldo glucosado con sello

♥ Tubos con caldo lactosado con sello

♥Tubos con gelatina bacteriológica con sello

♥ Tubos con leche con sello

♥ Tubos con medio SIM con sello

♥Cultivo Clostridium sesión anterior

PROCEDIMIENTO

1.- Colocar los tubos de caldo glucosado, lactosado y leche en agua hirviendo, para extraerles el aire previamente al desarrollo de la práctica.

2.- Debe enfriar sin mover para evitar aireación

3.- Sembrar cuidadosamente con el cultivo obtenido en la sesión anterior

4.- Sembrar el tubo de gelatina por picadura e incubar a temperatura ambiente.

5.- Incubar los tubos de caldo glucosado, lactosado y leche así como el medio de SIM a 37º C durante 48 hrs y comparar con la siguiente tabla de pruebas bioquímicas e interpretar resultados.

RESULTADOS

            La siembra realizada la clase anterior a la práctica de identificación fue ciertamente infructuosa, es decir, no hubo crecimiento colonial sugestivo de clostridium por lo que se nos sugirió realizar las pruebas bioquímicas con una colonia producto de la contaminación para la cual solo fue positiva la prueba de glucosa y todas las demás pruebas negativas por lo cual podemos estar seguros que no era ninguna especie de clostridium.

CONCLUSIONES

El género clostridium representa un grupo de bacterias con gran importancia clínica pues las enfermedades causadas por estas bacterias son de muy variadas formas y pueden conducir a la muerte como es el caso de una infección por C. perfringens o una intoxicación por toxina botulínica o incluso el mismo tétanos, en caso de sospecha de cualquiera de estas enfermedades se debe actuar ante las sospecha y brindar el tratamiento adecuado, la identificación de la especie involucrada en la patología así como el antibiograma respaldan el tratamiento.

BIBLIOGRAFÍA

Murray, Patrick. 1997. Microbiología médica. 2da Edición. Editorial Harcourt Brace. Barcelona.  Páginas consultadas: 166-174

Davis, Bernard, Dulbecco Renato, Eisen Herman y Ginsberg Harold. 1990. Tratado de microbiología. Editorial. Salvat. Barcelona. Páginas consultadas: 514-519.

Jawetz Ernest. 1990. Microbiología médica. 13a edición. Editorial El manual moderno. México. Páginas consultadas: 188-193

Autor:

Aguilar Franco Alejandra

Baéz Rodríguez Elizabeth

Barajas Calderón Verenice

Chávez Núñez Rafael

González Coronel Luz Nayeli

González Tamayo Celia Paloma

Urbieta López Jissel

Rodríguez Cruz Liliana