PCR-heterodúplex por agrupamiento: Implementación de un método de identificación de portadores de la mutación más común causal de fibrosis quística

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RESUMEN: Introducción: La fibrosis quística (FQ) es una enfermedad autosómica recesiva frecuente, con una incidencia de 1 en 2,500 recién nacidos. La causan más de 1,300 mutaciones distintas en el gen regulador de la conductancia transmembranal de la fibrosis quística (CFTR). Sin embargo, la mutación F508del es la más común en la mayoría de las poblaciones.

Objetivos: Desarrollo de una técnica rápida, de bajo costo y confiable que permita filtrar con rapidez a los portadores o afectados por esta mutación que mediante el asesoramiento genético, contribuya a disminuir la aparición de nuevos casos y a un diagnóstico temprano de los enfermos y así lograr un descenso en la morbilidad y la mortalidad asociadas con la fibrosis quística en Colombia.

Metodología: En el presente estudio se aplicó la técnica PCR-heterodúplex por agrupamientos, gracias al análisis de 400 muestras de sangre en papel filtro obtenidas de individuos asintomáticos para la FQ.

Resultados: En las pruebas de validación de la técnica PCR-heterodúplex por agrupamiento se obtuvo una eficiencia, reproducibilidad y especificidad de 100% y una sensibilidad de 92%.

Conclusiones: Se demostró la sensibilidad y reproducibilidad de la técnica PCR Directa-heterodúplex por agrupamientos de hasta 10 muestras, que se pueden emplear en programas para filtrar heterocigotos y afectados de F508del.

Palabras clave: Fibrosis quística; CFTR; Análisis heterodúplex; Mutación; Filtrado genético; Colombia.

PCR-heteroduplex by grouping: Rapid screening carrier method for cystic fibrosis F508del mutation in Colombia

SUMMARY: Background: Cystic fibrosis (CF) is the most frequent autosomal recessive disorder in the Caucasian population with an incidence of 1 in 2,500 newborns. More than 1,300 mutations in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene that causes CF have been described. However, mutation F508del is the most common mutation in different populations around the world.

Objective: To develop a fast, reliable and low-cost technique to screen carriers and affected individuals for the F508del mutation. This kind of analysis will have an impact on genetic counselling to decrease the incidence of new cases, in the early diagnosis and instauration of appropriate treatment to decrease morbidity and mortality associated to CF in Colombia.

Methods: The reliability of the PCR-heteroduplex by grouping technique by analysis of 400 blood spot samples from asymptomatic CF patients was defined.

Results: Using PCR-heteroduplex by grouping technique 100% efficiency, reproducibility and specificity and 92%sensitivity were found.

Conclusions: The sensitivity and reproducibility of the PCR-heteroduplex by grouping technique up to pooling of 10 samples were demonstrated. This kind of analysis could be used in heterozygotes and affected screening programs.

Key words: Cystic fibrosis; CFTR; Heteroduplex analysis; Genetic screening; Colombia.

La fibrosis quística (FQ) es la enfermedad genética autosómica recesiva de mayor frecuencia en la población caucásica, con una incidencia de 1 en 2,500 recién nacidos vivos. Los afectados con FQ presentan enfermedad pulmonar crónica, alteraciones digestivas como insuficiencia pancreática y elevación de los electrólitos en el sudor. La FQ se debe a mutaciones en el gen regulador de la conductancia transmembranal de la fibrosis quística (CFTR) (1), localizado en el cromosoma 7q31.2, del que se conocen hasta la fecha más de 1,300 mutaciones o polimorfismos en este gen (2); la mutación F508del es la más frecuente y se observa en 66% de los afectados a nivel mundial (3). La frecuencia de portadores sanos (heterocigotos) en la población caucásica se ha estimado en 1 de cada 25 personas (4).

En América Latina pocos países han informado estudios sobre el tema. Cuba es el país con la mayor incidencia de FQ (1/3,862) (5) y en México se presenta en 1/9,000 nacimientos (6); Costa Rica es el de menor frecuencia de la mutación F508del con 22.9% (7) y Argentina el de mayor frecuencia (59.5%) (8). En un estudio en hispanos de los Estados Unidos, que agrupa personas de casi toda América Latina, esta mutación se encontró en 48% de los afectados (9).

En Colombia hasta el momento no se conoce la incidencia real de la enfermedad ni la frecuencia de portadores; algunos estudios previos hallaron en la mutación F508del una cifra cercana a 40%, con amplias variaciones regionales (25%-60%) (10,11) y una frecuencia de portadores de 1 en 65, que se debe tomar a título indicativo, pues los estudios se hicieron en un pequeño número de controles sanos (11,12).

La mutación F508del se encuentra en el exon 10 del gen CFTR y se produce por la deleción de tres pares de bases que llevan a la pérdida de un codon de fenilalanina en la proteína. Como es alta su prevalencia, es importante realizar estudios de portadores que permitan identificar las personas en riesgo de tener un hijo afectado por la enfermedad. Esta mutación convencionalmente se había diagnosticado mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) amplificando la región específica del exon 10 donde esta se encuentra. Sin embargo, como la mutación I507del, se encuentra muy cercana a la F508del y corresponde también a la deleción de tres pares de bases, este abordaje metodológico no permitiría diferenciar estas dos mutaciones, lo que puede llevar a errores diagnósticos. La PCR seguida del análisis de heterodúplex permite distinguir estas mutaciones, gracias a la formación, por complementariedad de las cadenas de ADN, de bandas específicas para cada una ellas. La ejecución de esta metodología ha permitido el estudio individual de portadores en otras poblaciones. Para llevar a cabo estudios poblacionales exhaustivos en personas sanas que permitan conocer indicadores epidemiológicos de una enfermedad que se presume común en el medio colombiano, se hace necesario poner en funcionamiento una técnica rápida, de bajo costo, eficiente y confiable que permita identificar los portadores o los afectados por la mutación F508del. En el presente estudio se practicó la técnica de PCR-heterodúplex, aplicada en el análisis simultáneo de varias muestras de sangre, para descubrir la mutación F508del en especímenes tomados sobre papel de filtro S&S903, a fin de ser utilizada en estudios poblacionales futuros y determinar la frecuencia de la mutación en el país o en pruebas diagnósticas de portadores y afectados por tal mutación.