MATERIAL DE MICROBIOLOGIA ACANGI- 2.008
Microbiología – para llevar información No todas las bacterias son malas. De hecho, solamente un porcentaje muy pequeño es perjudicial a los seres humanos.
Microbiología – para llevar información La prueba bacteriana no es difícil, sino que es consumidora de tiempo. La mayoría de las pruebas consisten en un proceso de dos etapas: Paso presuntivo Paso de la confirmación
CITOLOGÍA Y MORFOLOGÍA DE BACTERIAS Las bacterias, junto con los protozoarios, algas microscópicas, hongos microscópicos (incluyendo levaduras) y virus, constituyen los llamados microorganismos. El término microorganismo no tiene un significado taxonómico preciso sino que agrupa a todos los organismos de dimensiones microscópicas (< 0.1 mm) aunque presenten grandes diferencias entre si. Por ejemplo incluye organismos procariotas (bacterias), eucariotas (hongos, protozoarios, algas) y virus. También difieren notablemente en el tamaño aunque sean todos microscópicos. En una escala comparativa tenemos: Protozoarios > levaduras > bacterias > virus Aunque existen miles de especies de bacterias diferentes, los organismos individuales presentan una de las tres formas generales siguientes: elipsoidal o esférica cilíndrica o en forma de bastón espiral o helicoidal.
Observación y examen microscópica La observación y examen de las bacterias se puede realizar de dos maneras fundamentales: observando los microorganismos vivos sin teñir. observando las células fijadas, teñidas con colorantes Las bacterias vivas en suspensión acuosa tienen propiedades ópticas similares a las del agua y, por lo tanto, son difíciles de observar con el microscopio de campo claro debido a la falta de contraste con el medio que las rodea. Este contraste aumenta cuando se las tiñen con un colorante adecuado. Sin embargo, para muchos fines es preferible evitar la coloración debido a que puede alterar la forma y además mata a las células. En los casos en los que se quieren observar los microorganismos vivos es conveniente usar un microscopio de campo de contraste de fases o en su defecto un microscopio de campo claro en iluminación mínima. Ésta se logra bajando el condensador, minimizando la iluminación.
Movimiento El movimiento de traslación de algunas bacterias puede observarse en preparaciones húmedas del material, es decir con los microorganismos vivos. Debe distinguirse claramente el movimiento independiente de las bacterias móviles del movimiento por arrastre con corrientes de convección y el movimiento browniano. Cuando el movimiento se realice por propulsión flagelar, el tipo de movimiento variará con la disposición de los flagelos en el cuerpo celular. La coloración de las bacterias tiene como fines: poder visualizarlas para determinar morfología y tamaño. diferenciar grupos bacterianos por su reacción frente a determinados colorantes. revelar la presencia de distintas estructuras internas. Los colorantes utilizados son sales en las que el anión o el catión es el responsable del color; en el primer caso se trata de un colorante ácido o aniónico y en el segundo, básico o catiónico. La célula bacteriana tiene una débil carga negativa cuando el medio externo tiene un pH cercano a la neutralidad. Como la diferencia de carga eléctrica es lo que determina la afinidad entre el colorante y la célula, las bacterias tendrán afinidad por los colorantes básicos (ej.: cristal violeta y azul de metileno).
coloraciones Cuando se utiliza un solo colorante básico, el método se denomina coloración simple, mientras que cuando se usan dos o más se llama coloración compuesta. La coloración diferencial es un caso particular de coloración compuesta. Cuando a una preparación bacteriana se le aplica un colorante ácido tal como eosina, éste no se une a las células cargadas negativamente, pero si se deposita alrededor de ellas, quedando así un fondo coloreado donde contrastan las células incoloras. No es, por lo tanto, una verdadera tinción y se denomina tinción negativa o indirecta. En algunas ocasiones es necesario utilizar un mordiente, es decir, alguna sustancia que contribuya a la fijación del colorante a la célula, por ejemplo: ácido tánico, sales de Al, Fe, etc.
Coloración simple Consiste en la aplicación de un colorante luego de fijada la preparación. Pueden emplearse los siguientes colorantes básicos: azul de metileno, cristal violeta o fucsina fenicada. Estos presentan diferente afinidad por las bacterias y por ello los tiempos de aplicación serán distintos.
Preparación de un frotis Comprende las siguientes etapas: extendido del material en un portaobjetos secado fijación El propósito de la fijación es matar los microorganismos, coagular el protoplasma de la célula y adherir la preparación al portaobjetos. Sin el proceso previo de fijación se lavaría la capa de células durante el proceso de tinción. El agente fijador ideal preserva las estructuras de la célula con su forma y posición sin que aparezcan estructuras que no existían en la célula original. El calor es en general el método de fijación mas utilizado para la observación de la morfología de células bacterianas. Cuando además de los microorganismos interesa la observación de células animales, se utiliza un método químico como la fijación por metanol y por formol, que altera menos que el calor la morfología de las células.
Coloracion de estructuras Esporas Ciertas especies bacterianas, en particular de los géneros Bacillus y Clostridium, producen elementos de resistencia denominados esporas o endoesporas debido a que se forman dentro de la célula, a razón de una por célula. A diferencia de la célula vegetativa que la produce, la espora es muy resistente a condiciones adversas tales como alta temperatura, baja humedad, radiaciones y agentes químicos. Es una forma de vida latente que puede permanecer largos períodos como tal y cuando desaparecen las condiciones adversas puede germinar. También puede inducirse esa germinación mediante, por ejemplo, un shock térmico, es decir un calentamiento a 80º C. Las esporas son altamente impermeables a los colorantes, de manera que con las técnicas de coloración comunes aparecerán como regiones sin teñir dentro de las células coloreadas. Por lo tanto, para teñir las esporas específicamente, deben usarse métodos de coloración especiales. Los datos importantes que se obtienen como resultado de esta coloración son: presencia o ausencia de esporas deformación o no del cuerpo celular posición dentro del cuerpo celular En base a la posición de la espora dentro de la célula se las clasifica en: terminales, centrales y subterminales (posición intermedia).
Manipulación aséptica de cultivos Tomar el tubo del cultivo con la mano izquierda, de modo que el fondo del tubo toque la palma de la mano y probar (con la mano derecha) que el tapón esté libre, girándolo sin destapar. Tomar el ansa con la mano derecha, con los dedos pulgar, índice y mayor, dejando libres el anular y el meñique. Quemar el ansa introduciendo la punta en el cono frío de la llama del mechero, en posición vertical y luego ir levantándola hasta que quede toda al rojo. Pasar el ansa por la llama en un ángulo de 60º con la vertical, manteniéndola siempre en posición paralela al cuerpo. Flamear el metal adyacente al ansa. Trabajando cerca del mechero, tomar el tapón de algodón del tubo con los dedos anular y meñique de la mano derecha y quitarlo girando el tubo; flamear la boca del tubo.Introducir el ansa tocando la pared fría dentro del tubo (sin soltar el tapón de algodón) para que se enfríe el ansa y luego introducirla en el cultivo líquido o deslizarla sobre la superficie del cultivo sólido de abajo hacia arriba, para tomar las células a transferir (inóculo). Sacar el ansa así cargada del tubo, flamear la boca del tubo y taparlo. Transferir el inóculo, ya sea a un portaobjetos para hacer un frotis o a otro medio de cultivo. Quemar nuevamente el ansa. Siempre que se vaya a tomar una muestra de un cultivo con cualquier finalidad debe procederse según técnica aséptica descrita, con el fin de no introducir contaminación en el cultivo y en la muestra.
Observación de un preparado fresco (para observar movilidad, forma, etc.) Método de la gota pendiente Colocar una gota de muestra usando técnica aséptica en el centro de un cubreobjetos limpio. Invertirlo cuidadosamente y colocarlo sobre la depresión de una lámina excavada, de manera que no deslice la gota por el cubreobjeto. La gota no debe tocar el fondo de la depresión. Aplicar unas gotas de agua a los bordes del cubre para sellarlo y mantenerlo en su lugar. Observar con el lente seco de mayor aumento. Método de lámina-laminilla Colocar una gota de la muestra usando técnica aséptica sobre un portaobjetos limpio y cubrir con un cubreobjetos. Para prevenir las corrientes de convección y el secado de la preparación, se puede sellar poniendo en los bordes del cubreobjetos vaselina sólida o esmalte de uñas. Observar igual que el anterior. En caso de disponer de microscopio de contraste de fases la visión es mucho mejor
Las bacterias esféricas o elipsoidales se denominan COCOS. Muchas bacterias con esta forma presentan modelos de agrupación que derivan de los diversos planos de división celular. Así tenemos: cocos en pares (diplococos), ej. Neisseria cocos en cadena, ej. Streptococcus cocos en racimo, ej. Staphylococcus cocos en tétradas, ej. Pediococcus cocos en cubos, ej. Sarcina cocos sin distribución especial Las células bacterianas cilíndricas se denominan BACILOS o BASTONES y presentan otros modelos de agrupación. Así tenemos: bastones en cadena, ej. Bacillus bastones en letras chinas o empalizadas, ej. Corynebacterium bastones sin distribución especial Las bacterias helicoidales se presentan en general como células individuales independientes; pero las células de las distintas especies presentan notables diferencias de longitud, número y amplitud de las espiras y rigidez de la pared.
Microbiología – para llevar información La técnica óptima para recuperar depende de la fuente de la muestra y del cargamento bacteriano. Los números tienen solamente importancia basada en su uso. Los números exactos no indican necesariamente una buena o mala situación.
microscopio
El Microscopio UTILIZACIÓN DEL MICROSCOPIO Colocar una preparación . Abrir el diafragma de la fuente de luz al máximo. Abrir el diafragma del condensador al máximo y llevar el condensador al máximo de su trayectoria. Colocar el objetivo de menor aumento ej. 10x. Prender la fuente de luz y ajustarla a una intensidad confortable. Ajustar los binoculares a la distancia interpupilar y ajustar el foco de cada ocular si el microscopio lo permite. Enfocar la preparación. Gradualmente cerrar el diafragma de la fuente de luz hasta ver una imagen poligonal. Bajar el condensador hasta que los bordes del polígono se vean nítidos. Ajustar el enfoque. Si la imagen poligonal no está en el centro, centrarla utilizando los tornillos del condensador. Abrir el diafragma de la fuente de luz hasta que la poligonal apenas salga del campo, no tocarlo mas. No tocar mas la altura del condensador. Elegir el contraste óptimo ajustando el diafragma del condensador. Verificar la iluminación quitando los oculares y mirando por el tubo hacia los objetivos ajustar el diafragma a 2/3 abierto. (2/3 del campo iluminado). Para cambiar el contraste regular el diafragma del condensador y para ajustar el brillo modificar la intensidad de la fuente luminosa o colocar filtros. No cambiar la distancia del condensador. Al cambiar de objetivo solo modificar el diafragma de la fuente de luz y el diafragma del condensador a la apertura del objetivo.
Tipos de microscopios
Mantenimiento del microscopio DIARIO (cada vez que se usa) Limpiar el aceite de inmersión de lentes y otras superficies del microscopio. El aceite de inmersión debe conservarse cerrado. Apagar la fuente de luz del microscopio Cubrir el microscopio con su funda.
Fundamentos de Microbiología ¿Con que seguridad se determina? Identificación de organismos Microscopia Prueba de los medios de cultivo
Microbiología Descripción de los Productos Paddles Membrana de Filtración (MF) Heterotrófico conteo placa (HPC)
Microbiología Tipos de microorganismos importantes : Bacteria Levaduras y mohos Virus Protozoario Simples- Celulas Algas
Microbiología La presencia de ORGANISMOS en una muestra e indica la contaminación posible con bacterias, levaduras peligrosas Relativamente fácil detectar, identificar, y enumerar
Catalasa Introducción La catalasa es una enzima que descompone el peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua. La catalasa es una hemoproteína de estructura similar a la de la hemoglobina, excepto que los 4 átomos de hierro de la molécula están en estado oxidado (Fe+++) en lugar de reducido (Fe++). Excluyendo los estreptococos, la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas poseen actividad catalasa. Principio El peróxido de hidrógeno se forma como uno de los productos finales del metabolismo oxidativo aeróbico de los carbohidratos. Si se deja acumular, el peróxido de hidrógeno es letal para las células bacterianas. La catalasa transforma el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno de acuerdo a la siguiente reacción: H2O2 ? H2O + ½O2 (burbujas de gas) La prueba de la catalasa, llevada a cabo en portaobjetos o en tubos, es comúnmente utilizada para diferenciar Streptococcus (catalasa negativa) de Staphylococcus (catalasa positiva). Medios y reactivos 1. Cultivo de 24 horas del microorganismo en un medio no selectivo . 2. Peróxido de hidrógeno al 3% (diluir la solución de 30% con agua destilada).
catalasa Procedimiento Transferir una ansada de células del centro de una colonia bien aislada a la superficie de un portaobjetos en el que se coloco una pequeña gota de peróxido de hidrógeno al 3%. Emulsionar bien. Se recomienda probar previamente las ansas que contengan hierro, ya que se pueden producir falsos positivos. Interpretación La rápida aparición y producción sostenida de burbujas de gas o efervescencia, indica una prueba positiva. Dado que algunas bacterias pueden poseer enzimas distintas de la catalasa, capaces de descomponer el peróxido de hidrógeno, unas pocas burbujas diminutas, formadas a los 20 a 30 segundos no se consideran una prueba positiva. Controles
SEGURIDAD 1. Este método entraña el uso de diversas sustancias biológicas peligrosas y procedimientos que pueden ocasionar un aumento del riesgo para quien los aplica. En caso de duda, consultar siempre con el asesor de seguridad competente. 1.1. Precauciones generales 1.1.1.Se llevara en todo momento ropas protectoras, incluido guardapolvo abotonado, gafas y guantes de seguridad, BARBIJO 1.1.2. Los analistas se conocerán cualesquiera de los riesgos atribuibles a las sustancias que usan 1.1.3. Se deberán mantener cerca la hoja de seguridad de los productos utilizados para este uso. 1.1.4. La exclusión de otros compuestos de esta lista no implica que sean seguros. 1.2. Primeros auxilios. Toda herida debe notificarse, todos los accidentes e incidencias se notificaran
Materiales 1.3. introducción Se basa sobre la propiedad de un agregado un medio de cultivo para desarrollar el organismo que estamos investigando (levaduras y mohos, bacterias o recuento total). 1.4. Muestreo. Las muestras serán enviadas al laboratorio con todos los cuidados microbiológicos de extracción y en envases estériles, provisto por nosotros. 1.5. APARATOS Pizeta con agua destilada Alcohol de 80º Algodón estéril medio de cultivo especifico 6.5.1 Equipos Monitor de 100 ml estéril. VER FIGURA Estufa de cultivo. Cámara de flujo laminar Microscopio
Proceder 1.6. REACTIVOS 1.7. PROCEDIMIENTO · En un monitor de 100 ml colocar la muestra extraída del envase estéril. · Realizar el vacío para filtrar la muestra. · Agregar el medio de cultivo por la parte trasera del monitor (2 ml) con jeringa o por medio de la ampolla cuando es plástica · Colocar la tapa en la parte inferior y llevar invertido a la estufa (la tapa superior debe esta hacia abajo). · Llevar a estufa de cultivo por 72 h. a 32º C. · Retirar la muestra de estufa y observar las colonias desarrolladas de color blanco amarillenta. · Si tenemos duda de lo formado llevar al microscopio. · Hacer un raspado y colocar sobre porta objeto junto a una gota de agua estéril, cubrir con un cubreobjeto y agregar aceite de inmersión. Ver en el microscopio con 100 x 10 por inmersión
Brettanomyces INCUBACION 6 días a 25º C. Es conveniente que la caja sea recubierta por film estéril para evitar que la evaporación del caldo perjudique el análisis. Las colonias son pequeñas, cremosas, casi siempre semiesféricas , puede aparecer un halo blanco alrededor de las mismas producto de la acidez. Retirar la muestra de estufa y observar la colonias desarrolladas de color crema. Si tenemos duda de lo formado, llevar al microscopio un raspado sobre cubreobjeto, colocar un porta y aceite de inmersión
Fotos de brettanomyces
MONITOR
Membrana Filtración (MF) Colector de muestra Monitor
instrucciones Tener el monitor con la parte inferior y abrir el corte conforme a la foto
PROCEDER CON MONITORES Conecte el matraz kitasato de filtración de la trampa con la tubería para vacío, ambos matraces pueden ser conectado con un tapón de neopreno 8 con unión de 3/8 “. Conecte el matraz de trampa a la bomba de vacío con tubería de silicón tomando una unidad de filtración intermedia para proteger la bomba. Conecte la bomba , conecte la bomba a un contacto ajustándolo. Coloque un adaptador al tapón que se encuentra en el matraz de filtración. Retire el monitor de la caja, colóquelo sobre el adaptador ajustándolo. Retire la tapa del embudo ( no toque las superficies interna) y vierta la muestra en el monitor. Encienda la bomba de vacío y filtre la muestra. Si el volumen de la muestra es mayor al del embudo, vierta el resto de ella antes que se filtre el tota de la primera porción y filtre completamente. Apague la bomba y enjuagué las paredes del embudo con 20 a 30 ml de buffer estéril ph 7,2. Permita que el buffer se acumule sobre la membrana. Encienda la bomba totalmente la solución de enjuague, asegurase que en la superficie de la membrana no permanezca ningún exceso de liquido Apague la bomba Filter flask Vacuum trap Vacuum pump Fit port into adapter
Trabajo con Monitor
Trabajo con monitor 1 Instalación del sistema de filtración con monitor monitor
Trabajo con monitor 2
TRABAJO CON MONITOR 3
ESTA PRESENTACIÓN CONTIENE MAS DIAPOSITIVAS DISPONIBLES EN LA VERSIÓN DE DESCARGA