Genética de la Cebada

Enviado por anonimo

Los cereales trigo y cebada tienen gran importancia en la agricultura de nuestro país, tanto por la superficie sembrada como por el valor de la producción. Los programas de mejora de estos cereales, llevados a cabo tanto en organismos públicos como en el sector privado, necesitan explotar la máxima variabilidad posible. Esto debe hacerse de forma rápida y además se debe complementar con nueva variabilidad como base óptima para la obtención de nuevas variedades. En este contexto, las actividades del Grupo se centran en la optimización de técnicas de cultivo in Vitro y regeneración de cereales como herramientas para la mejora de cereales. Estas técnicas permiten tanto acortar el tiempo de desarrollo de los programas de mejora mediante la utilización de plantas doblehaploides (DH), ó introducir nueva variabilidad mediante técnicas de transformación génica y mutagénesis.

1. Obtención de dihaploides y optimización del proceso de androgénesis

Las actividades desarrolladas por nuestro Grupo en los últimos años se han centrado en la puesta a punto de técnicas de regeneración de plantas doblehaploides (DH) de cebada a partir del cultivo de anteras y microsporas. Como aplicación directa de estas técnicas, se obtuvieron más de 2700 líneas DH que entraron a formar parte de; a) Programa Nacional de Mejora de Cebada; b) Proyectos de búsqueda de marcadores moleculares ligados a caracteres agronómicos. Destacamos también que las variedades de cebada "Belén" y "Lola" ambas registradas por el Instituto Técnico Agrícola Provincial de Albacete (ITAP S.A.) proceden de dos líneas DH obtenidas por nuestro grupo de trabajo. Asimismo se ha establecido una colaboración con la Universidad del Estado de Washington (USA) para producir DH con el fin de obtener variedades de cebadas cerosas desnudas, y el mapeo de genes que afectan a la dormancia.

A pesar de los logros obtenidos, el bajo número de microsporas que dividen, la baja proporción de embriones completos desarrollados respecto al número de microsporas que dividen, y los elevados porcentajes de albinismo de algunos genotipos limitan en algunos casos la aplicación práctica en mejora. Se necesita seguir optimizando los protocolos de androgénesis para reducir el coste de la producción de los DH a partir de cualquier cruzamiento de interés agronómico o científico.

Nuestros objetivos en esta línea de investigación son: El desarrollo de protocolos de androgénesis independientes del genotipo, el estudio de los procesos biológicos involucrados en el proceso del pretratamiento de las anteras, y la influencia de la concentración de algunos micronutrientes, en la inducción de la embriogénesis a partir de microsporas de cebada y trigo. Al mismo tiempo estamos estudiando la posibilidad de existencia de selección gametofítica asociada a los procesos de androgénesis. Para la evaluación de las características agronómicas de los DH producidos y la posible obtención de nuevas variedades, este trabajo se realiza en colaboración con los Entes Promotores/Observadores: Semillas Batlle S.A. y Prof. I. Romagosa (UdL Lérida).

En el cultivo de anteras de cereales, a pesar de ciertas dificultades todavía existentes, la cebada y el arroz se han considerado cultivos modelos. La aplicación directa al trigo de los protocolos desarrollados para cebada han dado resultados limitados. Nuestro grupo ha iniciado el desarrollo de técnicas de producción de plantas DH de trigo blando y trigo duro, en estrecha colaboración con distintas empresas productoras de semillas. Estamos estudiando la influencia de varios factores en las distintas fases de la androgénesis, pretratamientos de estrés, y medios de inducción y regeneración. Hemos obtenido plantas DH de varios cultivares de trigo duro y trigo panadero mediante el cultivo de microsporas. El gran interés de estos materiales para las empresas del sector se traduce en la firma de dos Contratos, CSIC-Agromonegros S.A y CSIC-Semillas Batlle S.A., para la producción de dihaploides de trigo panadero y trigo duro.

2. Androgénesis en cebada. Análisis genético

La búsqueda de regiones cromosómicas (QTL, Quantitative trait loci) implicadas en la respuesta al cultivo de anteras ayudan a conocer los mecanismos genéticos que gobiernan el proceso de la androgénesis. Nuestro objetivo en esta línea de investigación es la identificación de marcadores moleculares asociados a los procesos de androgénesis en cebada, que nos permitan una caracterización inicial de los híbridos propuestos por los mejoradores, predecir su nivel de respuesta androgénica y por lo tanto optimizar los recursos destinados a la producción de líneas DH.

Se han obtenido poblaciones de doblehaploides segregantes para el carácter cultivo de anteras, mediante el cruzamiento entre dos genotipos Dobla e Igri de muy distinta capacidad androgénica. Se realizó la caracterización androgénica de la población mediante el análisis de: número de divisiones, el número de embriones, la capacidad de regeneración y la frecuencia de albinismo, de cada una de las líneas.

De la caracterización de los polimorfismos moleculares entre los parentales de las poblaciones segregantes, con cebadores del tipo RAPD, microsatélites y marcadores del tipo STS, se han podido determinar aproximadamente 100 marcadores moleculares polimórficos que se han utilizado para estudiar las poblaciones. Así se esta completando un mapa de ligamiento para el cruzamiento Igri x Dobla. Con todos los datos obtenidos hasta el momento se esta trabajando en la identificación de QTLs asociados al carácter porcentaje de plantas verdes regeneradas, limitante de la producción de plantas doblehaploides.

Dentro de esta línea de análisis genético hemos insistido en la asociación entre el carácter número de carreras y la respuesta androgénica. Nuestra experiencia indicaba que los cultivares de cebada de seis carreras tenían una respuesta menor que los de dos carreras. La caracterización androgénica de un mutante de Igri (cultivar de dos carreras) de seis carreras nos ha permitido determinar que la baja respuesta androgénica de los cultivares de seis carreras no se debe a un efecto de pleiotropía, sino a ligamiento con genes relacionados con androgénesis.

3. Obtención de nueva variabilidad mediante tranformación génica y mutación in vitro

La mejora de plantas tiene ante sí grandes retos para el desarrollo de nuevas variedades con características agronómicas, comerciales y sociales distintas a las que se habían considerado hasta ahora. Para poder afrontar no sólo la problemática actual, sino también aquella que va emergiendo el mejorador necesitará explotar una variabilidad que antes no era capaz de generar. En los últimos años nuevas técnicas biotecnológicas basadas en el cultivo in vitro han surgido como respuesta a esta demanda como, por ejemplo entre estas técnicas están la tranformación génica y la mutación in vitro.

La cebada ha resultado ser uno de los cereales más recalcitrantes a las técnicas de transformación génica, debido a la baja capacidad de regeneración de los cultivos celulares y tisulares adecuados para la transformación. Aunque en los últimos años se han conseguido grandes avances en la producción de plantas transgénicas de cebada, no podemos considerar esta metodología como firmemente establecida.

En nuestro grupo hemos puesto a punto un método sencillo de transformación mediante una pistola de partículas del tipo "Particle Inflow Gun" (P.I.G.), construida en nuestro laboratorio. Se ha utilizado como material vegetal microsporas aisladas y embriones inmaduros. Mediante este protocolo se han obtenido lineas transgénicas de los cultivares de cebada Igri y Cobra utilizando microsporas como explantes diana. También se han obtenido líneas transgénicas de cebada a partir de embriones inmaduros o callos embriogénicos jóvenes de los cultivares Hop y Cobra, utilizando material crecido en campo y en cámaras de crecimiento. Las mayores eficiencias de transformación se alcanzaron con material de campo y presiones de selección elevadas. Se demostró la presencia de los transgenes en el interior del genoma de las plantas T0 y T1.

Una vez puesta a punto la técnica de transformación, se ha aplicado para aumentar a producción de fructanos en cebada, dentro de un proyecto FEDER, que se está realizando en colaboración con los Drs. Martinez-Carrasco (CSIC-Salamanca) y Puigdomenech (CSIC-Barcelona). Actualmente se están realizando los análisis moleculares de las líneas que han superado el proceso de selección.

La aplicación de agentes mutágenos y recuperación de líneas mutantes ha demostrado ser muy útil para la generación de nueva variabilidad. En los últimos años ha aumentado la potencialidad de esta técnica gracias a la inducción y selección de mutaciones in vitro y el uso de dihaploides para acortar los ciclos de mejora de las variedades mejoradas a partir de los mutantes. Nuestro grupo ha puesto a punto un protocolo que nos permite la producción eficiente de mutantes de cebada mediante la aplicación de ázida sódica a anteras o a microsporas cultivadas in vitro. Se han podido identificar 61 mutantes a partir de una población inicial de 564 dihaploides procedentes de microsporas tratadas con ázida sódica. Estos incluyen mutantes en altura de la planta, precoces, tardíos, cerosos, con desarrollo de las flores laterales.

Publicaciones más representativas:

Castillo AM, Egaña B, Sanz JM, Cistué L (1998). Somatic embryogenesis and plant regeneration from barley cultivars grown in Spain. Plant Cell Reports, 17: 902- .

Cistué L, Ramos A, Castillo AM (1999). Influence of different anther culture pre-treatments in the production of barley doubled haploid. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 55: 159- .

Castillo AM, Vallés MP, Cistué L (2000). Comparison of anther and isolated microspore culture in barley. Effects of culture density and generation medium. Euphytica, 111: 1- .

Castillo AM, Vallés MP, Cistué L (2000). Improvements of barley androgenesis for plant breeding. In: B. Bohanec (ed) Biotechnological Approaches for Utilization fo Gametic Cells, pp.15-21. European COST Action 824: Gametic Embryogenesis, Brussels (Belgica).

Ramírez C, Testillano PS, Castillo AM, Vallés MP, Coronado MJ, Cistué L, Risueño MC (2001). The early microspore embryogenesis pathway in barley is accompained by concrete ultrastructural and expression changes. International Journal of Developmental Biology, 45: 57-

Castillo AM, Cistué L, Vallés MP, Sanz JM, Romagosa I, Molina-Cano JL (2001). Efficient production of androgenic doubleb haploid mutants in barley by the application of sodium azide to anther and microspore cultures. Plant Cell Reports, 20: 105- .

Castillo AM, Cistué L, Romagosa I, Vallés MP (2001). Low responsiveness of six-row genotypes to androgenesis in barley does not have a pleiotropic basis. Genome, 44: 936- .

Proyectos y Contratos de Investigación más representativos:

Embriogénesis androgénica encaminada a la mejora de cebada mediante biotecnología: Análisis genético y molecular. Programa Sectorial de Promoción General del Conocimiento (DGES). 1998-2001. Investigadora principal: María Pilar Vallés Brau.

Mejora del proceso de obtención de nuevas variedades de trigo duro (Triticum durum, L.), para su cultivo en Aragón, mediante el método de Haplo-Diploidización. Proyectos cofinanciados con Fondos FEDER. 2000-2001. Investigador principal: Luis Cistué Sola.

Transformación genética de la cebada para la producción de fructanos con nuevos usos en la industria agroalimentaria de Castilla y León. Proyectos cofinanciados con Fondos FEDER. 1999-2002. Investigador principal: R. Martínez-Carrasco.

Mejora del proceso de obtención de nuevas variedades de cebada de mayor calidad y tolerancia a estreses abióticos mediante la optimización del proceso de producción de dihaploides, generación de nueva variabilidad somática por medio de la mutagénesis inducida y posterior selección gametofítica. CICYT, Plan Nacional de Ciencias Agrarias. 2000-2002. Investigador principal: Luis Cistué Sola.

Contrato CSIC – Semillas Batlle S.A. para la producción de dihaploides de trigo panadero y trigo duro. Semillas Batlle S.A. 2001-2002. Investigador principal: Luis Cistué Sola.

Contrato CSIC – Agromonegros S.A. para la producción de dihaploides de trigo panadero y trigo duro. Agromonegros S.A. 2001-2002. Investigador principal: Luis Cistué Sola.

Producción y aplicación de técnicas de biotecnología en las líneas doblehaploides de cebada. Predicción de la respuesta androgénica de los genotipos y análisis de la variación genética generada. Plan Nacional de Recursos y Tecnologías Agroalimentarias. 2001-2004. Investigadora principal: María Pilar Vallés Brau.

El autor pidió el anonimato.