Lipoproteínas (página 2)

Las lipoproteínas consisten de un centro de lípidos hidrofóbicos rodeado por una cubierta de lípidos polares lo que, a su vez, está rodeado por una cubierta de proteína. Las proteínas que se utilizan en el transporte de los lípidos son sintetizadas en el hígado y son denominadas «apolipoproteínas» o «apo». Hasta 8 apolipoproteínas pueden estar involucradas en la formación de la estructura de una lipoproteína. Las proteínas son llamadas Apo A-1, Apo A-2, Apo B-48, Apo C-3, etc.

En su conjunto, las lipoproteínas conservan una concentración de lípidos en sangre de unos 500 mg de lípidos totales en 100 ml de sangre. De estos 500, 120 mg son triacilgliceroles (TAG), 220 mg es colesterol y 160 mg es fosfolípido.

Las LDL contienen, típicamente, el 50-70 % del colesterol total sérico y ambos están directamente relacionados con los riesgos de enfermedades cardíacas o coronarias. Las HDL contienen, normalmente, el 20-30 % del colesterol total; los niveles de HDL están inversamente relacionados con los riesgos de enfermedades cardíacas o coronarias. Las VLDL contienen 10-15 % del colesterol sérico total y la mayor parte de los triglicéridos en el suero post-ayuno; las VLDL son precursoras de las LDL; se presume que algunas formas de VLDL, en especial las VLDL residuales, son aterogénicas.

Pequeñas cantidades de colesterol son transportadas, también, por dos clases menores de lipoproteínas: las lipoproteínas de densidad intermedia («Intermediate Density Lipoproteins» o IDL), de densidad 1,006-1,019 Kg. /L y las lipoproteínas(a) de densidad 1,045-1,080 Kg. /L.

Los quilomicrones (densidad < 1,006 Kg. /L) aparecen en la sangre transitoriamente, luego de una comida de contenido graso y normalmente desaparecen por completo antes de 12 horas. Son ricos en triglicéridos y responsables por el aumento postprandial (luego de comer) de los triglicéridos en el plasma aunque normalmente no tienen efecto importante sobre la concentración de colesterol total.

5. El Colesterol

El nivel de colesterol en la sangre está determinado en parte por herencia y en parte por factores adquiridos tales como dieta, cantidad de calorías y nivel de la actividad física.

Los factores que afectan al colesterol en sangre comprenden edad, sexo, peso corporal, dieta, consumo de alcohol y tabaco, ejercicio físico, factores genéticos, antecedentes familiares, medicamentos, situación menopausia, el uso de una terapia de reemplazo hormonal y desórdenes crónicos tales como hipotiroidismo, enfermedad obstructiva del hígado, enfermedad pancreática (inclusive diabetes) y enfermedad renal. En muchas personas, un elevado nivel de colesterol sanguíneo constituye un alto riesgo de desarrollo de una enfermedad en las arterias coronarias. Los niveles sanguíneos de colesterol total y varias fracciones de colesterol, en especial el colesterol-LDL y el colesterol-HDL son útiles en la evaluación y el monitoreo del tratamiento de pacientes con enfermedades cardiovasculares y otras relacionadas. Los niveles sanguíneos de los mencionados componentes del colesterol, inclusive los triglicéridos, han sido separados en las categorías «deseable», «al límite» y «alto riesgo» por el Instituto Nacional de los Pulmones, el Corazón y la Sangre de los Estados Unidos, en su informe del año 1993. Estas categorías conforman una base útil para la evaluación y el tratamiento de los pacientes con hiperlipidemia (niveles de lípidos por encima de lo normal). La terapia para reducir estos parámetros de riesgo incluye dieta, ejercicio físico y medicación y reducción de la masa grasa corporal, lo que resulta particularmente efectivo cuando se lo combina con dieta o ejercicio físico.

6. Concentraciones de lipoproteínas en el plasma

El nivel de los lípidos en el plasma es el indicador clínico más comúnmente usado para medir el riesgo potencial de alguna enfermedad cardiovascular prematura. Los niveles de triglicéridos, colesterol y colesterol-HDL post-ayuno también pueden ser usados para identificar posibles anormalidades. Es característico de las mujeres la menor concentración de triglicéridos (80 mg/Dl.) respecto de la de los hombres (120 mg/Dl.); las mujeres también tienen más alto nivel de colesterol-HDL (55mg/Dl. versus 43 mg/Dl. para los hombres). El bebé recién nacido tiene niveles de triglicéridos y de colesterol total entre un medio y un tercio de los de un adulto. Los niveles de colesterol-HDL son relativamente altos en el recién nacido (35 mg/Dl.) en el que la proporción entre colesterol total y colesterol-HDL es igual a 2; en los adultos esa proporción es de 3,5 para las mujeres y de 4,6 para los hombres. Los niveles de lípidos en los infantes son, quizá, los «ideales»; al nacimiento, el colesterol total en plasma es bajo mientras que el colesterol-HDL es relativamente alto. Excepto en el caso de anormalidades genéticas, las paredes vasculares de los recién nacidos están libres de rastros de grasa. La acumulación de grasa aparece durante los primeros años de vida, indicando que la ingesta alimentaría y los factores ambientales probablemente influyen sobre la iniciación y la progresión de la aterosclerosis. Al nacimiento, no se observan diferencias entre bebés varones o mujeres ya que las hormonas sexuales tienen, aparentemente, una reducida influencia en esta etapa del desarrollo.

Las apolipoproteínas (Apo) son componentes estructurales de las lipoproteínas plasmáticas que, que juegan un papel importante en la regulación del metabolismo.

De las nueve apolipoproteínas que se conocen, todas difieren en su contenido de aminoácidos y su peso molecular; su concentración plasmática en individuos sanos se encuentra en el rango de 0.03 a 0.15 g/l.

Las apolipoproteínas poseen una conformación molecular típica conocida como "alfa hélice anfipática", en la que su porción hidrofóbica integra un alto contenido de aminoácidos no polares y su porción hidrofílica integra los residuos polares de los aminoácidos que son abundantes. Cada estructura es esencial para la integridad de la lipoproteína, para que sea capaz de interaccionar con los lípidos de la porción hidrofóbica de la molécula de lipoproteínas e interaccionar simultáneamente con el ambiente acuoso.

Basados en un criterio alfabético, las apolipoproteínas pueden agruparse en cuatro familias que incluyen miembros de diferente estructura, función y carácter metabólico.

Apolipoproteínas A

Las apolipoproteínas A son un grupo de proteínas distribuidas en forma variable sobre diferentes lipoproteínas; por ejemplo, la Apo A-I y Ia Apo A-II se encuentra principalmente en HDL, pero también en los quilomicrones. La Apo A-IV se encuentra en forma libre en el plasma o unida a lipoproteínas.

La Apo A-I es la apolipoproteína más abundante en el plasma; está presente casi en forma total en HDL y constituye cerca del 90% y 60-70% de la fracción proteica en las subfracciones HDL2 y HDL3 respectivamente. Los niveles plasmáticos de Apo A-I son generalmente mayores en mujeres y correlacionan positivamente con la concentración de HDL-Colesterol. Esta correlación no es válida en sujetos con hipertrigliceridemia, en donde la fracción HDL está enriquecida con triglicéridos y casi ausente el colesterol.

La Apo A-I es sintetizada inicialmente en el hígado e intestino como un precursor proteico, el cual es degradado hasta su forma madura en plasma, que es una simple cadena polipéptida que contiene 243 aminoácidos. Como el componente proteico de mayor concentración de HDL, participa activamente en el "transporte reverso de colesterol", actúa como activador de la enzima lecitin-colesterol-acetiltransferasa (LCAT), y como liga para el complejo receptor-HDL, localizado en el hepatocito y sobre diversas células periféricas.

La apolipoproteína Apo A-II es el segundo componente proteico de mayor concentración de HDL, aunque está ausente en la subfracción HDL2, este mismo constituye la tercera parte como componente proteico de HDL3. La Apo A-II se encuentra en menor concentración en plasma respecto de Apo A-I, y los niveles plasmáticos no correlacionan con los niveles HDL-colesterol. Desde un punto de vista estructural, la Apo A-II es diferente al resto de las proteínas transportadoras de lípidos porque es la única apolipoproteínas plasmática presente en forma de dimero. La Apo A-II está formada de dos cadenas polipeptidicas de 77 aminoácidos, unidos por un enlace disulfuro de los residuos de cistina de la posición 6. La función especifica de la Apo-II no está claramente especificada, pero recientes estudios indican que interviene en la regulación de la actividad de la lipasa hepática. Sin embargo, una absoluta ausencia de Apo-A-II fue observada en una familia japonesa, no encontrándose asociación con algún trastorno metabólico o condición clínica significativa. Lo anterior confirma que la Apo A-Il tiene una reducida participación en el metabolismo de lípidos.

La apolipoproteína A-IV se encuentra en concentraciones mínimas en el plasma y es aquí donde circula en forma libre, así como también se encuentra unida a los quilomicrones y HDLA (cerca del 50%). La Apo A-IV está constituida por una cadena polipeptidica compuesta de 376 aminoácidos, fuertemente conformada como una alfa-hélice de naturaleza anfipática, condición que es necesaria para unir los quilomicrones en las células del intestino y participar en el transporte reverso o contraflujo de colesterol, favoreciendo la interacción entre el HDL y las células.

Apolipoproteína B

La apolipoproteína B es una proteína con gran peso molecular, presente en los quilomicrones, lipoproteínas VLDL y LDL. Las concentraciones plasmáticas de Apo B se encuentran en el rango de 0.8 – 1.0 g/l en individuos normolipémicos. Su concentración es directamente correlacional con los valores de colesterol total y colesterol HDL.

Dos formas moleculares llamadas Apo B100 y Apo B48, existen en plasma. La primera es una simple cadena polipeptidica de 4,536 aminoácidos; es una de las proteínas más grandes que existen en el plasma, sintetizada en el hígado y secretada dentro de VLDL. Esta es cuantitativamente mantenida durante la conversión de VLDL a IDL hasta LDL, de la cual es el único componente proteico. La Apo B 100 es indispensable para el acoplamiento de las partículas de lipoproteínas (VLDL). Esta juega un papel importante como molécula, ligando para LDL y su receptor. También participa en la regulación de los niveles de colesterol a nivel sanguíneo.

La Apo B48 está constituida por una cadena polipeptidica de 2,152 aminoácidos (estos aminoácidos son similares a los de Apo B 100, por lo tanto, Apo B48 es el 48% similar con respecto de Apo B 100). Los niveles plasmáticos de Apo B48 en un sujeto normal en un periodo de ayuno, es de 50 veces menor respecto de la concentración de Apo B 100. Esta concentración tiene un remarcado incremento durante el periodo postprandial.

La Apo B48 es sintetizada en el intestino y es una molécula esencial para la formación de quilomicrones.

Apolipoproteína C

Es una familia de proteínas de bajo peso molecular incluyendo la Apo C-I, C-Il y C-III. Las tres apolipoproteínas difieren en su peso molecular, composición de aminoácidos y su función. Las apolipoproteínas C son sintetizadas en mayor proporción en el hígado y en menor proporción en intestino; están presentes en lipoproteínas que integran en su mayor parte triglicéridos, tal es el caso de quilomicrones, VLDL, HDL. La Apo C en plasma tiene un importante papel, manteniendo el equilibrio dinámico entre HDL, quiomicrones y VLDL. La concentración plasmática en sujetos normales es muy bajo, 0.03 g/l para Apo C-II y 0.15 g/l para Apo C-III. Sólo se puede observar un incremento en periodos postprandiales y en pacientes con hipertrigliceridemia.

Apo C-I es la apolipoproteína más pequeña; está compuesta de 57 aminoácidos. En procesos in vitro es capaz de activar la enzima lecitin-colesterol-acetiltransferasa (LCAT). Esta situación no indica que realice la misma función in vivo; sin embargo, la concentración y afinidad por la enzima es más elevada que la Apo A-I.

Apo C-Il es un polipéptido de 79 aminoácidos, que está distribuido en forma variable de acuerdo a las diferentes clases de lipoproteínas. Esta juega un papel muy importante en la regulación del metabolismo de los triglicéridos; es en realidad, un cofactor esencial para la actividad de la lipasa lipoprotéica, enzima responsable de la hidrólisis de los triglicéridos presentes en las lipoproteínas, y es determinante en el catabolismo de lo quilomicrones y VLDL.

Apo C-III está formado por 79 aminoácidos y está presente en plasma en su forma glicosilada. En relación a un análisis isoeléctrico, existen tres isoformas identificables C-III0, C-III1 y C-III2, dependiendo de las moléculas de ácido siálico a las que esté unido (la cual le sirve para favorecer su unión con su receptor o a otras moléculas). Apo C-II y C-III participan en la regulación de la lipasa lipoprotéica, generando un efecto de inhibición sobre ella.

Apolipoproteína E

La Apo E es un polipéptido de 299 aminoácidos, encontrándose en VLDL e LDL y como una subfracción de HDL llamada HDL1. La concentración plasmática en sujetos normales es de 0.03 – 0.07 g/l y se llega a incrementar 2 a 3 veces por hiperlipoproteinemia y en un padecimiento conocido como enfermedad beta-ancha, caracterizada por la presencia de una banda gruesa de lipoproteínas que emigra a la región pre-beta en un corrimiento electroforético. La Apo E se encuentra los humanos en tres isoformas reconocidas por análisis isoeléctrico, llamadas E2, E3 y E4. Las tres isoformas difieren una de otra por la sustitución de un simple aminoácido (arginina por cistina) en dos posiciones específicas de la secuencia de Apo E. La presencia de tres isoformas, cada una de ellas codificadas por un simple alelo, generan seis diferentes fenotipos, tres homocigotos (E2/E2, E3/E3 y E4/E4), y tres heterocigotos (E2/E3, E2/E4 y E3/E4), distribuidos en forma variable en la población. El fenotipo E3/E3 es el más común (60% de la población) y el E2/E2 es el más raro y sirve como criterio absoluto de hiperlipoproteinemia tipo III.

La Apo E es reconocida por su receptor específico (presente en el hígado y responsable del catabolismo de los residuos de quilomicrones) y por el receptor LDL (que también une a Apo B 100) la isoforma E2 no es reconocida por ningún tipo de receptor.

7. Lípidos y ateroesclerosis

La asociación entre anormalidades del metabolismo de lípidos y la incidencia de enfermedades cardiovasculares es de todos bien conocida en base a los numerosos estudios epidemiológicos que se han documentado en relación del papel aterogénico que tiene LDL, así como también la acción protectora o anti-aterogénica del HDL.

La relación directa que existe entre el incremento del nivel de lípidos y la ateroesclerosis está confirmada por los estudios desarrollados después de la década de los 80"s, en los que claramente se demostraba qué niveles bajos de colesterol en sangre están asociados con la reducción de eventos cardiovasculares y el retraso de trastornos ateroescleróticos. (Figura 2)

Es importante que las autoridades sanitarias de cada país en el mundo, a través de campañas, informen a la población del papel que desempeñan los lípidos plasmáticos en la patogénesis de ateroesclerosis y establezcan los criterios para identificar un riesgo coronario.

Actualmente las concentraciones de colesterol sanguíneo relacionadas a diferentes condiciones son las siguientes:

Para precisar el riesgo cardiovascular en sujetos con colesterol arriba de 240 mg/dl (6.21 mmol/L) requiere como siguiente paso hacer la determinación de colesterol asociado con lipoproteínas aterogénicas, tal como colesterol LDL. Para determinar directamente este analito es necesaria la ultracentrifugación de la muestra, ya que el uso de métodos alternativos no otorgan resultados reales; sin embargo, el equipo requerido solo está disponible en centros especializados. Las concentraciones de colesterol LDL nunca podrán ser estimadas con adecuada aproximación aplicando la bien conocida formula de Friedewald"s.

Colesterol LDL = Colesterol total – Colesterol HDL – Trigliceridos/5 resultados expresados en mg/dl

Colesterol LDL = Colesterol total – Colesterol HDL – Trigliceridos/2.2 resultados expresados en mmol/L

Nota: la ecuación jamás deberá usarse cuando triglicéridos supere 400 mg/dl (4.52 mmol/L)

Los valores determinados de LDL son la clave para tomar una decisión clínica e iniciar el tratamiento para disminuir las cifras de colesterol.

Los datos de consenso de estudios epidemiológicos sugieren la restricción de los valores de colesterol como único dato para una evacuación clínica lógica y realista de la condición del individuo, considerando los valores de colesterol-LDL como un dato de mayor valor aterogénico.

Sin embargo, otros dos parámetros lipídicos y lipoproteícos como son triglicéridos y colesterol-HDL, juegan un papel importante al establecer el riesgo cardiovascular en cada individuo.

Actualmente es conocido por todo el personal de salud que la elevación en los niveles de colesterol-HDL es un factor protector de ateroesclerosis. Esta consideración también está establecida en un carácter epidemiológico (con aplicación de estudios retrospectivos y prospectivos). Una forma moderada de hipo-alfa-lipo-proteinemia es una forma de dislipidemia diagnosticada en base a valores inferiores de 35 mg/dl de colesterol-HDL; esta condición invariablemente se asocia con una elevada incidencia de enfermedades cardiovasculares. Sin embargo, ésta no es evidencia directa y suficiente de que un incremento en el nivel de colesterol-HDL sea la causa del mejoramiento de in condición cardiovascular.

Algunos estudios han demostrado el valor predictivo de las cifras de colestero-HDL en la identificación de sujetos con riesgo cardiovascular. Sin embargo, algunos clínicos interesados en este parámetro han limitado su uso porque han observado modificaciones individuales en sus evaluaciones, dependiendo el método empleado.

El colesterol-HDL puede ser considerado como parámetro durante terapias de reducción de lípidos, pero su modificación puede ser mínima en forma positiva.

Existe mayor controversia sobre si lo triglicéridos tienen un papel importante en la definición de riesgo cardiovascular. Mientras que la Escuela Americana de Patólogos no considera a los triglicéridos como un factor de riesgo independiente, la Escuela Europea (particularmente Escandinava) por muchos años ha identificado en la hipertrigliceridemia un factor primitivo e independiente de riesgo coronario.

Los mecanismos responsables para la aterogenicidad resultante del incremento de los triglicéridos en sangre, probablemente se encuentran en las modificaciones estructurales y funcionales de las lipoproteínas que se convierten en un mayor factor de riesgo aterogénico para los pacientes con hipertrigliceridemia. Por ejemplo en la lipoproteína LDL, cuando su contenido es alto en triglicéridos y escaso en esteres de colesterol, exhibe una reducida afinidad por sus receptores específicos y es más susceptible a su catabolismo, provocando la acumulación de lípidos en las paredes de las venas.

En forma más constante y evidente es la reducción de los niveles de colesterol-HDL en los pacientes con hipertrigliceridemia, donde los valores son frecuentemente inferiores a 35 mg/dl (0.91 mmol/L). El significado clínico de este fenómeno no está bien establecido, pues la reducción de los niveles de colesterol-HDL no refleja una disminución del número de partículas circulantes pero si una simple reducción en el contenido de colesterol.

La hipertrigliceridemia también está asociada con trastornos en el metabolismo de carbohidratos y de la coagulación, situación que puede en cualquier momento agravar la condición vascular del individuo. Por tanto, es muy importante definir el papel preponderante o no de los triglicéridos en el desarrollo de la ateroesclerosis.

Recientemente, la lista de los parámetros lipídicos y lipoproteicos que nos otorgan un valor pronóstico de la ateroesclerosis se ha extendido a otros componentes del sistema lipoproteico, particularmente hacia las apolipoproteínas y lipoproteínas anormales o malignas llamadas lipoproteínas (a) o Lp (a) que es un complejo macromolecular formado por LDL, enlazado a una glicoproteína.

La lipoproteína (a) es estructuralmente homóloga al plasminógeno y existe en el plasma en varias isoformas de diferente peso molecular, con rangos de 200 a 700 KD. Los niveles plasmáticos son igualmente variables con rangos de 0 a 1.0 g/L. El papel fisiológico de la Lp (a) no está bien definido, pero una concentración plasmática de 0.3 g/dl está asociada con una elevada incidencia de ateroesclerosis a nivel coronario y periférico. La lipoproteína (a) parece estar involucrada en la formación de placas ateroescleróticas por un doble mecanismo: inhibición de la fibrinólisis y la acumulación de lípidos como parte de la placa ateroesclerótica.

8. Significado clínico del análisis de las apolipoproteínas

En el año de 1979 P. Avogaro fue el primero en demostrar la utilidad de la determinación de las apolipoproteínas para identificar sujetos con elevado riesgo cardiovascular.

La concentración plasmática de Apo A-I se encuentra reducida un 15% y la concentración de Apo B, incrementada 43% en pacientes con infarto al miocardio, cuando es comparada la concentración de individuos sanos control.

La relación Apo A-I/B (relación entre apolipoproteínas anti-aterogénicas y aterogénicas) fue reducida un 40% en pacientes con infarto al miocardio, estos niveles y su relación manifiestan un valor discriminante entre pacientes normales y en riesgo cardiaco, con mayor evidencia y claridad que los parámetros clásicos lipídicos y lipoproteícos.

En diversos estudios se ha confirmado la disminución, a veces moderada, de Apo A-I y el incremento marcado y constante de los niveles de Apo B, en pacientes con infarto al miocardio y que generalmente manifiestan complicaciones vasculares.

Consecuentemente, la relación Apo A-I/B es considerada por muchos autores como un índice poderoso de riesgo coronario.

La evaluación de apolipoproteínas en pacientes sujetos a una angiografía coronaria ha indicado la existencia de una fuerte correlación de los valores Apo A-I y Apo B como el marcador coronario que refleja un deterioro del sistema arterial.

La relación Apo A-I/B debe usarse no únicamente para identificar a sujetos con riesgo coronario, sino también como un índice importante de la severidad y progreso de la enfermedad ateroesclerótica.

Otras evaluaciones de apolipoproteínas que se han adicionado a las clásicas determinaciones de Apo A-I y Apo B durante años, son los análisis de Apo A-Il y Apo E pero hasta el momento no existe una correlación de resultados para definir un riesgo cardiovascular.

Otras razones para evaluar las apolipoproteínas y que otorguen información de utilidad clínica, es que la apolipoproteína es el mejor índice para estimar el número de partículas en la circulación sanguínea, particularmente importante en el caso de los pacientes con hipertrigliceridemia en el que las lipoproteínas tales como LDL, HDL manifiestan alto contenido de triglicéridos, por lo que exhiben menor cantidad de colesterol, en consecuencia, el resultado de HDL-colesterol es erróneamente interpretado; en este sentido, la determinación de la concentración de Apo A-I proporciona información más exacta para estimar el nivel de HDL en el paciente.

Continuando con el comentario de HDL, se ha mencionado que la determinación de Apo A-Il y la relación A-I/A-II es una valoración alternativa a la difícil metodología de Ultracentrifugación recomendada para estimar las fracciones de HDL.

La determinación de apolipoproteínas es un marcador especifico para distinguir las anormalidades del metabolismo de lípidos. En el caso de una hiperapobetalipoproteinemia, que es un trastorno asociado al alto riesgo coronario, la concentración plasmática de Apo B está elevada en presencia de niveles normales de colesterol total y colesterol LDL.

Problemas prácticos en el análisis de apolipoproteínas

La utilidad clínica de la determinación de apolipoproteínas consiste principalmente en la identificación del riesgo cardiovascular y en determinar la condición del metabolismo individual, pero existen algunos aspectos técnicos que son importantes de considerar, dependiendo las características de la metodología que se emplee para su evaluación.

El primer punto a considerar es que algunas características de las lipoproteínas pueden afectar la determinación de las apolipoproteínas.

Las lipoproteínas son un sistema heterogéneo en el que las apolipoproteínas están distribuidas en forma variable en partículas de diferente tamaño y estructura. Por esta condición, es importante que los métodos empleados para la determinación de los niveles de apolipoproteínas sean capaces de reconocer y cuantificar las apolipoproteínas contenidas en las distintas partículas de lipoproteínas.

Las lipoproteínas tienden a agregarse in vitro, condición que puede manifestarse como una desventaja para la conservación de la muestra o la adecuada preparación de un estándar.

Finalmente, el verdadero problema consiste en establecer los valores normales, así como anormales para las diferentes apolipoproteínas.

Los actuales métodos de análisis deberán estandarizarse y establecerse niveles internacionales de referencia como requisitos para alcanzar esta meta clínica.

9. Aspectos generales de los métodos inmunoquímicos

Hoy en día los métodos inmunoquímicos se han ampliado y apreciado en el laboratorio clínico por su sensibilidad, especificidad y calidad. Las principales técnicas para valorar y cuantificar las apolipoproteínas Apo A-I y Apo B incluyen:

• Radioinmunoensayo (RIA)

• Inmunoenzimáticas (ELISA)

• Inmunodifusión radial (RID)

• Electroinmunodifusión (EID)

• Nefelometría (INA)

• Inmunoturbidimetría (ITA)

Estos métodos no están libres de la crítica. El problema principal es que las apolipoproteínas no están presentes en el suero en forma aislada, sino como grandes partículas químicamente heterogéneas. Esto provoca respuesta variable, a veces significativa, dependiendo de las características de las muestras (normolipemia o hiperlipemia) del anticuerpo empleado, así como también del material de calibración.

Al emplear un anticuerpo en la identificación de una proteína especifica se permite una medición más exacta aunque se encuentre en un medio que contenga otras proteínas sin la necesidad de una separación o purificación preliminar. La especificidad del anticuerpo dirigido hacia la apolipoproteína depende notablemente del inmunógeno empleado o de la apolipoproteína purificada o no. El rápido desarrollo de varios métodos de imnunoensayo ha generado un gran número de datos y de observaciones, aunque algunos discordantes por la naturaleza y reactividad de los calibradores empleados. Desafortunadamente, en la actualidad los laboratorios clínicos carecen de un método más simple, no inmunoquímico, con el fin de establecer adecuadamente la estabilidad de la concentración plasmática de apolipoproteínas, con el cual puedan ser frecuentemente referidos los resultados obtenidos. En relación a la precisión analítica del inmunoensayo, es inferior respecto a otras técnicas, el coeficiente de variación (% CV) generalmente está arriba del 2% para los resultados obtenidos en una misma corrida y se incrementa del 7-8% en aquellos que son procesados en diferentes corridas. La imprecisión se debe no sólo a los reactivos (anticuerpos policlonal), los cuales muestran diferente avidez, especificidad y afinidad hacia el antígeno, sino también ala predilección de la muestra y al procedimiento analítico por sí mismo. También se deben considerar los errores de la fase analítica.

Resumen de métodos para la valoración

De Apolipoproteínas

* Depende del tratamiento de la muestra.

10. Recolección, almacenamiento y conservación de la muestra

En una publicación reciente de BROWN et. al (1988), evalua diferentes procedimientos para la obtención de sangre y los posibles efectos en la determinación de la Apo A-I por el método de Radioinmunoensayo (RIA). Las variables probadas fueron:

a) El tiempo que transcurre entre la obtención del espécimen sanguíneo y la separación del plasma (el cual puede ser de importancia en los estudios epidemiológicos donde la muestra se obtiene lejos del laboratorio);

b) La presencia de los inhibidores de proteasas (necesarias para mantener la integridad estructural de la Apo B);

c) La conservación a-70ºC por seis semanas.

d) La adición de varios conservadores o aditivos al plasma tales como antibióticos, bacteriostáticos y antimicóticos (los cuales pueden servir para proteger la integridad de la Apo A-I durante su congelamiento y su descongelamiento).

Los resultados de este estudio no mostraron efectos notables por las diferentes variables; arriba mencionadas; los autores señalan que esta conclusión es aplicable únicamente al método de RIA.

El mismo estudio también fue realizado por Albers et. al. (1980) en donde se discutió la conservación de las muestras para la determinación de Apo A-I y Apo-II mediante el método de Inmunodifusión Radial (RID), Las conclusiones en este caso indicaron que la muestra puede ser conservada a 4ºC por un mes y medio, y en el caso de estar libre de contaminación bacteriana es estable durante 2-3 años a 20ºC.

De estudios realizados por diferentes autores y mencionado por S. Marcovina y J. Albers de un reciente "reporte de estandarización para la determinación de la apolipoproteína A-I y B" (Viena, abril 1989), de esta información es deriva: que en los métodos de Nefelometría (INA) e Inmunodifusión Radial (RID) al emplear un anticuerpo mono o policlonal no se afectan por la presencia del anticoagulante (heparina o EDTA); sin embargo, la muestra sérica es la más recomendable porque el plasma presenta un decremento del 3 al 4% en Los resultados por la dilución de la muestra (plasma) a consecuencia de la salida del liquido intracelular, la cantidad de anticoagulante utilizada y el efecto de la congelación y la descongelación en donde se activa la formación de fibrina.

La concentración de ambas apolipoproteínas en las muestras no cambia significativamente después de ser conservadas 18 días a 4ºC. Por el contrario, cuando las muestras almacenadas por 6 meses a -20ºC o -70ºC y analizadas por Nefelometria muestran cambios significativos en la concentración, mientras que los resultados por Inmunodifusión Radial son constantes aún después de ser conservadas un año en las mismas condiciones.

En investigaciones recientes se ha demostrado que al emplear el método de Inmunoturbidimetría (ITA), la conservación de las muestras por dos meses a -20ºC o –70ºC no afectan la concentración de Apo A-I y Apo-B.

Por los antecedentes y estudios mencionados se ha observado que la conservación de las muestras, pretratamiento y dilución pueden ser un factor de interferencia en la determinación de apolipoproteínas por algunos métodos inmunoquímicos existentes. Por otro lado, considerando exclusivamente el método de Inmunoturbidimetria en que su alta estabilidad de reactivos, características de operación, fácil instrumentación y la posibilidad de usar la misma curva de calibración por varios días sin que exista un error significativo, permitiendo el rápido procesamiento de las muestras, evitando el riesgo inherente a los procesos de conservación, para asegurar la calidad de resultados y que éstos reflejen fielmente la condición clínica y fisiológica del paciente, para cumplir con el principal objetivo y/o misión de todo laboratorio clínico.

11. Bibliografía

Apolipoproteínas en Bayer Diagnóstico. Ano I, Número 3. Julio, 1997. Págs. 5-7

Apolipoproteínas en Bayer Diagnóstico. Ano I, Número 4. Septiembre, 1997. Págs. 3-6

http://mcb.berkeley.edu/courses/mcb135k/outline/lipoprotein.htmlhttp://my.webmd.com/http://www.cholesterol-tests.com/http://www.med.unibs.it/~marchesi/lipoprot.htmlhttp://www.nhlbi.nih.gov/http://www.ottawaheart.ca/researchbioathlipo.htm

Autor:

Q.C. Ricardo Vázquez Ballona