Patrones genéticos de los cultivares de vides de vinificación más comúnmente usados en Chile basados en marcadores de microsatélites (página 2)

La diferenciación e identificación de estos cultivares ha representado un problema de difícil solución para las técnicas ampelográficas, basadas en el estudio de caracteres morfológicos, botánicos y agronómicos (forma, tamaño y color de planta, hojas y racimo, época de maduración, resistencia a enfermedades, etc.) (Galet, 1979). Además, estas características pueden ser moduladas por determinantes ambientales, tales como el efecto de determinados patógenos, la etapa del crecimiento o el ambiente agroclimático en que se encuentre la planta. Esta caracterización morfológica depende del criterio y experiencia individual de cada ampelógrafo. Esto ha llevado a que en numerosas ocasiones existan genotipos mal indexados, especialmente cuando se trata de cultivares que presentan fenotipos muy similares. Por otra parte, la identidad genética de un cultivar puede modificarse debido a mutaciones somaclonales producidas durante su reproducción vegetativa (Vignani et al., 1996), y aunque conserven el nombre original, pueden presentar diferencias tanto fenotípicas como genotípicas (sinonimia). La sinonimia también se aplica a cultivares que, aunque genéticamente diferentes, se han manejado como si fueran un único tipo. Alternativamente, la dispersión geográfica de un mismo genotipo o cultivar suele conllevar su redenominación, por lo que un mismo genotipo presenta diversos nombres (homonimia) (Vignani et al., 1996; Cervera et al., 1998).

El uso de herramientas analíticas basadas en el análisis directo del genoma (ADN) supera varios de estos inconvenientes, debido a que el análisis se hace independiente de factores ambientales (Morell et al., 1995). De esta manera, se obtienen "marcadores moleculares" que definen un "perfil molecular" o "fingerprinting" propio para cada cultivar.

Existen diversos marcadores moleculares aplicables para estudios moleculares en plantas, y específicamente para el desarrollo de estos perfiles moleculares (Ferreira y Grattapaglia, 1996). En vides, ha sido posible identificar variedades mediante análisis de fragmentos de restricción (RFLP) (Bowers et al., 1993), amplificación de fragmentos de ADN usando partidores de diseño aleatorio (RAPD) (Collins y Symons, 1993; Gogorcena et al., 1993; Jean-Jaques et al., 1993; Qu et al., 1996; Stavrakakis et al., 1997; This et al., 1997), amplificación de fragmentos de largo polimórfico (AFLP) (Sensi et al., 1996; Cervera et al., 1998) y secuencias simples repetidas (SSR) (Thomas y Scott, 1993, Cipriani et al., 1994; Bowers et al., 1996; Vignani et al., 1996), entre otros.

Un método óptimo de análisis de ADN es aquel que presenta un alto índice de polimorfismo, exhibe una herencia codominante, se distribuye a lo largo de todo el genoma uniformemente, y permite una fácil interpretación de los datos generados. En buena medida, estos requisitos son cumplidos por las secuencias de microsatélites o SSR (Rafalsky y Tingey, 1993), estudiadas mediante PCR (STMS, por Sequence Tagged Microsatellites; Thomas y Scott, 1993; Thomas et al., 1994). Los SSR son series de entre dos y cinco nucleótidos que se repiten 10 o más veces (por ejemplo (GA)18, (CAC)10, etc.), series que a su vez se repiten muchas veces en el genoma entero (Jeffreys et al., 1985; Tautz, 1989). Su tipo y abundancia varía entre distintas especies de plantas y animales (Lagercrantz et al., 1993), y son considerados excelentes marcadores moleculares para distintos propósitos, como estudios de caracteres cuantitativos (Hearne et al., 1992) u otros estudios genéticos en plantas (Morgante y Olivieri, 1993), siendo propuestos como un enfoque general para mapeo genético en eucariontes (Tautz, 1989; Beckmann y Soller, 1990). El principal inconveniente de esta metodología es la identificación de los partidores, diseñados a partir de secuencias conservadas adyacentes al SSR.

Actualmente se cuenta a lo menos con 20 pares de partidores de SSR de vides (Thomas et al., 1994; Bowers et al., 1996, 1999b), los cuales han sido aplicados principalmente para realizar fingerprinting de cultivares de uva de mesa, de vino y portainjertos de distintas especies de Vitis. Los primeros trabajos correspondieron al grupo de Thomas y Scott (Thomas et al., 1993; Thomas y Scott, 1993). Allí se identificaron al menos cuatro grupos de partidores, algunos de los cuales resultaron tener una alta capacidad discriminativa entre cultivares. Posteriormente, este mismo grupo (Botta et al., 1995) y otros (Cipriani et al., 1994; Bowers et al., 1996) han optimizado metodologías libres de isótopos radiactivos y han desarrollado bases de datos que permitirían comparar sus resultados con los de otros laboratorios, a nivel internacional (Thomas et al., 1994). Más recientemente, un consorcio internacional de 20 laboratorios ha desarrollo sobre 300 marcadores de SSR adicionales, los que podrán ser aplicados tanto en la caracterización genética de la especie como para perfeccionar protocolos de fingerprinting.

La aplicación más importante de los SSR en vides ha estado centrada en la identificación de genotipos (Thomas et al., 1994; Grando y Frisinghelli, 1998; Lin y Walker, 1998; Sefc et al., 1998; Meredith et al., 1999). Además, usando una aproximación estadística basada en índices de exclusión, se han podido determinar los progenitores de varios cultivares de origen ancestral desconocido. Por ejemplo, Bowers y Meredith (1997) identificaron a Cabernet Franc y Sauvignon blanc como los progenitores de Cabernet Sauvignon, el cultivar más plantado en el mundo. Usando la misma aproximación, Sefc et al. (1997) identificaron los posibles progenitores para cuatro variedades cultivadas en Alemania y, más recientemente, Bowers et al. (1999a) identificaron los progenitores de más de 15 cultivares tradicionales de Francia, entre ellos los de Chardonnay.

En este trabajo se presenta la caracterización genética de 20 cultivares de vides viníferas basada en la determinación de los patrones alélicos de 12 loci de microsatélites. La información colectada constituye un catálogo cuyo principal uso está referido a la posibilidad de respaldar un sistema de certificación genética que asegure un mínimo de posibilidad de error al comparar cualquiera de los genotipos considerados en el estudio.

MATERIALES Y MÉTODOS

Variedades analizadas y extracción del ADN.

Se analizaron 20 cultivares de vides de vinificación (Vitis vinifera L.) manejados como una colección de genotipos (jardín de variedades) mantenidos en el Centro Regional de Investigación (CRI) La Platina del Instituto de Investigaciones Agropecuarias (INIA), ubicado cerca de la ciudad de Santiago. El listado de estos genotipos, correspondientes a cultivares de vino blanco y tinto, se encuentra en el Cuadro 1. Se colectaron hojas en desarrollo (de unos 5 cm de diámetro) que se almacenaron a -80°C hasta que se extrajo su ADN, siguiendo el protocolo descrito por Narváez et al. (2000).

Cuadro 1. Alelos identificados en 20 cultivares de vid usando 12 marcadores de SSR. Los valores indicados corresponden al tamaño de cada amplicón en pares de bases. Table 1. Alleles identified for the twenty grapevine cultivars using 12 SSR markers. Numbers refer to amplicon sizes (in bp).

SSR: Secuencias simples repetidas. -: indica que se detectó un único alelo para una determinada combinación marcador/genotipo, lo que puede corresponder a un homocigoto o un alelo nulo (Botta et al., 1995). ND: no determinado.

Marcadores de microsatélites (SSR)

Para el análisis de SSR se usaron partidores para 11 loci diseñados por Bowers et al. (1996, 1999b), más aquel denominado VVS-29, diseñado por M. Thomas, de CSIRO, Australia (resultados no publicados). Las secuencias y otras características de estos partidores de SSR se encuentran en las citas indicadas. Las secuencias de los partidores VVS-29 son las siguientes:

VVS-29 forward: 5’ CCCCAAGGCTCTGAAAACAAT 3’ VVS-29 reverse: 5’ TGCAAACGAAATAAAGCTTCCA 3’

Reacciones de PCR para SSR

Cada mezcla de reacción contenía (concentraciones finales) 10 ng de ADN, 10 pmoles de partidores (directo y reverso), 8mM de dNTPs, 1,5 mM de MgCl2, tampón de PCR 1X (Tris-HCl 10 mM pH 8,3; KCl 50 mM y 0,01% de gelatina) y 0,5 U de Taq polimerasa en 16 m L de volumen final. Se usó un termociclador Perkin-Elmer con el siguiente programa de amplificación: desnaturación a 95ºC por 5 min; 35 ciclos de 95ºC por 45 s, alineamiento a 56ºC por 45 s y extensión a 72ºC por 90 s; elongación final por 7 min a 72ºC.

La eficiencia de la reacción de amplificación fue confirmada en un gel de agarosa-TBE al 2,5%, cargando 7 m L de la reacción; luego, se tomó 1 m L del producto de cada reacción y se diluyó a la mitad con tampón de formamida (0,05% de azul de bromofenol y xilen cianol, en 95% de formamida). Esta mezcla se cargó en un gel desnaturalizante de poliacrilamida al 6% conteniendo urea (6,5 M), preparado en TBE 1X. La corrida electroforética se realizó a 70-80 W, verificándose una corriente inicial de unos 1.800 a 2.000 V (temperatura óptima de corrida de 50°C). Luego de aproximadamente 2 h, se procedió a fijar y teñir el gel con nitrato de plata, de acuerdo al protocolo del kit Promega Silver Sequencing (Promega) (Bowers et al., 1996). Los tamaños de cada banda se determinaron por comparación con referencias de alelos de SSR de genotipos conocidos, previamente analizadas en el laboratorio y cargadas en el mismo gel. Además, se compararon con patrones de algunos cultivares disponibles en la literatura (ver Resultados y Discusión).

Determinación de la capacidad de los marcadores de SSR para diferenciar cultivares

Se contabilizó el número de alelos y genotipos identificados con cada marcador de SSR y en base a estos datos se calculó la heterocigocidad esperada (He = 1 – S pi2, siendo pi la frecuencia alélica), expresada como porcentaje (Cuadro 2). He refleja la capacidad de cada marcador de SSR para diferenciar dos alelos seleccionados al azar en una población determinada (Powell et al., 1996), en este caso, entre los 20 genotipos de vides.