Patrones genéticos de los cultivares de vides de vinificación más comúnmente usados en Chile basados en marcadores de microsatélites (página 3)

Cuadro 2. Resumen de la información obtenida con cada marcador de SSR analizado. Table 2. Summary of the information obtained for each SSR marker analyzed.

SSR: Secuencias simples repetidas.

Para estimar teóricamente la capacidad de diferenciación que tendría cada marcador de SSR (o combinación de ellos), se recurrió a la fórmula deducida por Tessier et al. (1999). Brevemente, se listaron los marcadores, comenzando por el que tuviese el mayor número de genotipos observados, y posteriormente se agregaron secuencialmente los demás partidores, hasta los menos informativos. Luego se calculó el número teórico de pares de genotipos no diferenciables, Xk, haciendo combinaciones con un número creciente de marcadores (Cuadro 3). Para este cálculo, se usó la fórmula:

donde N es el número de genotipos estudiados, [N(N-1)/2] representa el número de pares de combinaciones diferentes entre genotipos y Cjes la probabilidad de que dos individuos seleccionados aleatoriamente presenten un fingerprinting idéntico. Por ejemplo, si se tienen 20 genotipos, existen 190 posibles combinaciones diferentes entre ellos (pares), o dicho de otro modo, se tiene una probabilidad de 1 en 190 de equivocarse si se pretende identificar un genotipo en base a un patrón único. En este contexto, se define un factor de exclusión, D, que es el complemento de Cj (D = 1 –C ) y es equivalente a la heterocigocidad esperada, determinada para cada marcador en base a las frecuencias de los diferentes patrones alélicos (Tessier et al., 1999). Como comparación a los valores teóricos calculados, se verificó el número de genotipos que no es posible diferenciar efectivamente con cada combinación de marcadores (Cuadro 3).

Cuadro 3. Capacidad acumulada de los marcadores de SSR para diferenciar cultivares de vides viníferas. Table 3. Cumulative ability of the SSR markers to differentiate wine grape cultivars.

SSR: Secuencias simples repetidas. 1 El número teórico de pares de genotipos no diferenciados (Xk) se calculó de acuerdo a lo indicado en Materiales y Métodos. 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En este trabajo se han definido los patrones genéticos para 20 cultivares de vides viníferas (Cuadro 1), muchos de los cuales tienen características ampelográficas que dificultan su diferenciación por métodos morfológicos clásicos. Para este propósito, se han usado los marcadores de ADN conocidos como microsatélites, considerados la mejor alternativa si se cuenta con partidores diseñados para loci genéticos polimórficos, debido principalmente a sus características de reproducibilidad y buena calidad de la información generada (Morgante y Olivieri, 1993).

La Figura 1 muestra la separación electroforética en un gel de poliacrilamida desnaturalizante de los alelos correspondientes al marcador VVMD-5 de los 20 cultivares estudiados. Allí también se ilustra la calidad técnica y facilidad de interpretación de los patrones de microsatélites. En este caso (VVMD-5) se encontraron 13 genotipos diferentes combinando siete alelos de tamaños entre 226 y 240 pares de bases; dado que VVMD-5 es un marcador de dinucleótidos, cuyos tamaños se diferencian de dos en dos nucleótidos, en esta serie sólo faltó la banda correspondiente al alelo 230. De estos 13 genotipos, ocho patrones fueron propios de un único cultivar, cuatro patrones correspondieron a pares de genotipos indiferenciables (sumando ocho genotipos) y hubo un grupo de cuatro genotipos con igual combinación alélica. Este resultado es indicativo de la alta heterocigocidad de este tipo de marcadores en vides.

Figura 1. Patrones electroforéticos de genotipos de vid analizados con el marcador VVMD-5. Los tamaños de los amplicones fueron calculados de acuerdo a la co-migración con estándares auténticos de algunos cultivares (ver texto y tamaños indicados en el lado derecho). Figure 1. Electrophoretic patterns of grapevine genotypes analyzed with the VVMD-5 marker. Amplicon sizes were calculated based on co-migration of reference cultivars (see text and allele sizes at the right).

El Cuadro 1 contiene la información de los tamaños (pb) de los amplicones identificados en los 20 genotipos con los 12 marcadores de SSR. Para el análisis subsecuente, no se considerará al marcador VVMD-36 debido a que consistentemente mostró dificultades técnicas en las reacciones de PCR, obteniéndose información sólo para 13 de los 20 genotipos. Del resto de los marcadores, sólo un genotipo careció de información en un marcador (Zinfandel en VVMD-31). Para cada uno de los cultivares se cuenta entonces con 11 a 12 loci caracterizados, con excepción del cultivar Zinfandel, con 10 marcadores caracterizados. Con cada marcador se encontraron una o dos bandas, correspondientes a loci homocigotos o heterocigotos, respectivamente. El rango de heterocigosis fluctuó entre 70% (marcador VVMD-6, ver Cuadro 1) y 100% (VVMD-28), aunque el marcador VVMD-34 fue excepcionalmente bajo, con sólo un 32%. Considerando el conjunto de datos colectados con el set de 11 marcadores, la heterocigosis promedio fue de 77%, que aumenta a 82% si no se considera el marcador VVMD-34. Estos valores confirman la alta heterocigocidad de esta especie, la que podría ser aún mayor si se determinara que algunos homocigotos corresponden más bien a heterocigotos con alelos nulos, lo que ha sido reportado en vides (Sefc et al., 1998). Por esta razón, en el Cuadro 1 no se explicita si efectivamente se trata de un homocigoto, excepto en Cabernet Sauvignon, para el cual se conocen los alelos respectivos de los progenitores (Bowers y Meredith, 1997).

El análisis de SSR "genera" alelos nulos porque uno o ambos sitios de unión de los partidores de PCR están mutados por modificaciones puntuales, inserciones o deleciones de fragmentos de ADN, lo que impide la amplificación. El diseño de nuevos partidores, que reconozcan secuencias alternativas cercanas al SSR, puede ayudar a amplificar alelos "desaparecidos" y confirmaría que se trata de alelos nulos (Callen y Thompson, 1993), aunque la forma más usual de verificarlo es estudiar la descendencia de un cruzamiento entre el genotipo con un supuesto alelo nulo (genotipo incógnito) y otro que sea heterocigoto; si en la progenie se obtiene una mezcla en porcentajes iguales de dos heterocigotos, el genotipo incógnito era efectivamente homocigoto, pero si además de estos heterocigotos (ahora reducidos a un 25% cada uno) se encuentran otros dos grupos de segregantes, cada uno también con un 25% de "homocigotos" (nulos verdaderos), entonces se confirmaría la presencia del alelo nulo en el progenitor testeado. Una forma indirecta de estimar la frecuencia de alelos nulos en una determinada población fue discutida por Sefc et al. (1998), quienes, analizando una población de más de 60 cultivares y portainjertos austríacos, determinaron que los marcadores VVMD7, VVMD-28, VVMD-36 y VVS-29 tendrían una baja probabilidad de presentar alelos nulos, basados en los valores de He y Ho (heterocigocidad esperada y observada, respectivamente). Por el contrario, VVMD-5 y VVMD-32 sí podrían aportar alelos nulos (Sefc et al., 1998).

Todos los marcadores fueron altamente polimórficos entre los cultivares analizados, detectándose el mayor número de alelos y genotipos diferentes (10 y 15, respectivamente) con el marcador VVMD-28. Esta información, además de los valores de He (que refleja la capacidad de cada marcador para diferenciar dos o más cultivares elegidos al azar), se resume en el Cuadro 2. De acuerdo a estos datos, los marcadores VVMD-28 y VVMD-5, ambos con valores de He superiores a 0,84, serían los mejores marcadores para diferenciar los 20 cultivares considerados en este trabajo. Cabe mencionar que esta situación dependerá en primer lugar del número y naturaleza de los cultivares que se están analizando, aunque también de la "calidad" técnica del marcador (ver más adelante) así como de la homogeneidad propia del cultivar (Grando y Frisinghelli, 1998). Sefc et al. (1998) también identificaron al marcador VVMD-28 como el más informativo, aunque ellos analizaron otro grupo de marcadores y genotipos, entre los que se comparten sólo algunos con este trabajo.

Para identificar confiablemente un cultivar, es conveniente usar el máximo de descriptores, pero debido al alto costo de la metodología es necesario al mismo tiempo definir un número mínimo de marcadores de SSR, manteniendo un bajo nivel de riesgo de confundir genotipos estrechamente emparentados. En este sentido, es también necesario determinar la diversidad genética inherente a los cultivares y portainjertos del género Vitis en su conjunto y de la especie V. vinifera en particular (Tessier et al., 1999; Narváez et al., 2000). Para determinar la combinación de marcadores que permitiera la mejor diferenciación de los cultivares viníferos (Cuadro 3), se consideró lo propuesto por Tessier et al. (1999), quienes estimaron un valor teórico del número de genotipos no diferenciables, basados en el número de genotipos observados para cada marcador. Como segundo criterio, se eligieron marcadores que tuvieran mayor facilidad para identificar sus diferentes amplicones, razón por la que VVMD-7 aparece precediendo a otros marcadores con mayor número de genotipos observados, como VVMD-27 o VVMD-31.

Como se puede apreciar en el Cuadro 3, la combinación de tres marcadores (VVMD-28, -5 y -6) mostró una alta capacidad discriminativa, representada por un número de genotipos no diferenciados menor que la unidad (0,80), lo que indica que sólo un par de genotipos no fue diferenciado. Esos dos genotipos corresponden a los cultivares Sauvignon blanc y Sauvignon gris, que son considerados clones que se han diferenciado por mutaciones en la vía biosintética de las antocianinas (Galet, 1979), lo que explica su alta similitud genética. Este análisis fue corroborado con el de los genotipos efectivamente diferenciados (Cuadro 3), donde se verificó que bastaría la combinación de los marcadores VVMD-28 y VVMD-5 para diferenciar los 20 genotipos estudiados (con la excepción antes mencionada). De esta manera, este trabajo demuestra que los cultivares viníferos más comúnmente usados en Chile pueden ser identificados mediante dos marcadores de SSR, VVMD-5 y VVMD-28, los cuales pueden ser ampliados a cuatro (sumando los marcadores VVMD-6 y VVMD-7) para tener mayor seguridad en las determinaciones. Además, estos cuatro marcadores se pueden combinar en corridas electroforéticas dobles, ya que los tamaños de sus alelos no se sobreponen. Estas dos parejas ("duplex") serían VVMD-5 + VVMD-7 y VVMD-6 + VVMD-28.

A pesar que los cultivares de vid son multiplicados vegetativamente, y por lo tanto no debieran existir diferencias entre genotipos de un mismo cultivar, se han descrito diferencias entre clones de cultivares como Sangiovese y Colorino usando marcadores moleculares como AFLP (Sensi et al., 1996) y microsatélites (Vignani et al., 1996). Debido a ello, en este trabajo se verificó la reproducibilidad de los patrones de SSR, analizándose los patrones de SSR de entre seis y diez genotipos para cinco cultivares. La Figura 2 muestra el resultado con tres de estos cultivares (Carmenère, Chardonnay y Merlot), usando el marcador VVMD-5. Se observa una completa identidad entre los patrones de las distintas plantas de cada cultivar, lo que demuestra la alta reproducibilidad del método usado.

Figura 2. Reproducibilidad de los patrones de secuencias simples repetidas (SSR). Análisis en gel de electroforesis de los patrones de SSR de seis plantas diferentes para tres cultivares (según se indica) usando el marcador VVMD-5. "Referencias" corresponden a las plantas usadas en este trabajo para generar los patrones señalados en el Cuadro 1 (Chardonnay (Ch), Carmenère (Ca) y Merlot (Me), respectivamente). Figure 2. Reproducibility of the SSR patterns. Electrophoresis separation of simple sequence repetition (SSR) PCR products for six different plants of three cultivars (as indicated) using VVMD-5 marker. "References" are the genotypes effectively used in this work to generate the complete SSR pattern listed in Table 1 (Chardonnay (Ch), Carmenère (Ca) y Merlot (Me) respectively).

En relación con esto, los marcadores más útiles son aquellos que muestran alelos (amplicones) con diferencias de más de 2 pares de bases entre cultivares (Lin y Walker, 1998), ya que la determinación del tamaño de los alelos puede variar entre uno a dos pares de bases, de acuerdo al ADN usado como referencia y al método de visualización de las bandas. Es así como el método de tinción con plata entrega tamaños con uno, dos (Bowers et al., 1996; Bowers et al., 1999b) o hasta cuatro u ocho pares de bases de diferencia a los estimados con sistemas de secuenciación automáticos basados en marca fluorescente (Grando y Frisinghelli, 1998; Sefc et al., 1998). Dado que aquí se ha usado tinción de plata, los patrones moleculares determinados deben compararse con los resultados obtenidos con la misma metodología.

Los cultivares incluidos en este estudio corresponden a algunos de los más usados en el mundo, casi todos provenientes de Francia. Estos cultivares han sido caracterizados anteriormente (Bowers y Meredith, 1997; Sefc et al., 1998; Bowers et al., 1999a, 1999b), encontrándose una alta consistencia con los tamaños de los alelos reportados aquí para los cultivares Cabernet Sauvignon, Cabernet Franc, Sauvignon blanc, Pinot noir, Chardonnay, Merlot, Semillon, Sauvignon blanc, Silvaner y Riesling. Para estos cultivares, se comparó directamente con ADN de los respectivos genotipos obtenido del Foundation Plant Material Service de la Universidad de California, Davis, y del Institut National de la Recherche Agronomique, INRA, Montpellier, Francia, encontrándose perfecta coincidencia en cada caso. Este resultado indica que las plantas mantenidas en el jardín de variedades del INIA, CRI La Platina, establecido a partir de materiales colectados en viñedos nacionales, están correctamente indexadas, aunque se tiene evidencia de al menos un error en esta colección, correspondiente a un grupo de plantas de Carmenère consideradas como Merlot hasta antes de este trabajo (Hinrichsen et al., 2001). Del resto de las variedades, no se puede tener certeza de su identidad, ya que no se cuenta con referencias auténticas. Como han demostrado recientemente Meredith et al. (1999), es fundamental disponer de más de una referencia para hacer una certificación confiable, o bien disponer de la información proveniente de centros como los mencionados más arriba, repositorios de cultivares y clones de referencia internacional.

Además de los 20 cultivares analizados más exhaustivamente, se dispone de información que permite diferenciar a otros genotipos de más reciente ingreso al país, o que tienen menor importancia productiva, como por ejemplo los cultivares de uva blanca Viognier y Mouvedre. Estos cultivares fueron recientemente introducidos al valle de Casablanca, siendo diferenciables de los otros 20 con sólo dos marcadores analizados (VVMD-5 y VVMD-7), aunque han sido caracterizados en otros dos marcadores, también polimórficos (VVMD-6 y VVMD-28). Además, ha sido posible identificar genéticamente una serie de muestras cuyo patrón molecular no coincide con ningún cultivar conocido. Algunas de éstas corresponden en uno o ambos alelos con las cepas correspondientes a los viñedos donde se han encontrado, por lo que podrían corresponder a descendientes de esas mismas cepas; en otros casos, en cambio, se han detectado genotipos que en más de un locus no coinciden en ningún alelo con las cepas que podrían ser sus progenitores (estimados por similitud ampelográfica), lo que plantea una interrogante para futuras investigaciones sobre el tema.

CONCLUSIONES

El análisis mediante microsatélites (SSR) permite la inequívoca identificación de los cultivares de vides viníferas más comunes en el país, con excepción de Sauvignon blanc y Sauvignon gris. La información presentada en este trabajo puede constituir la base de un sistema de certificación genética, complementaria a estudios ampelográficos

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue parcialmente financiado por los Proyectos FONDECYT 1970186 y FDI 98 C3-AT01. Los autores agradecen la valiosa colaboración de la Dra. Carole P. Meredith, del Dr. John E. Bowers y de Summaira Riaz, de la Universidad de California, Davis, California, EE.UU. Igualmente, agradecen la posibilidad de usar el marcador VVS-29, desarrollado por el Dr. Mark E. Thomas de CSIRO, Adelaide, Australia.

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Claudio Narváez H. 2, M. Herminia Castro P.2, Jorge Valenzuela B.2 y Patricio Hinrichsen R.2 1Investigación financiada parcialmente por FONDECYT, Proyecto N° 19710186

2 Instituto de Investigaciones Agropecuarias, Centro Regional de Investigación La Platina, Casilla 439 Correo 3, Santiago, Chile.