Síntesis y Caracterización de AuNPs para su Funcionalización con Sondas Específicas de DNA

Introducción y antecedentes

Las nanopartículas (NPs) de metales nobles, y específicamente, las nanopartículas de oro (AuNPs), exhiben excelentes propiedades físicas, químicas y biológicas, que son intrínsecas a su tamaño (Saifuddin et al., 2009).

Un aspecto de relevancia es la coincidencia de escala de tamaño, el nanómetro (1 X 10-9metros), con las unidades básicas de la vida encerradas dentro de la membrana celular o de su núcleo. Los cromosomas, un virus o una molécula tienen tamaño nanométrico; esta convergencia de escala ha conducido el aterrizaje de la nanotecnología en la Biofísica (Hernando 2007), figura 1.

Figura 1. Algunas unidades Básicas de la vida de tamaño manométrico. Imagen modificada de google imagens

Las AuNPs pueden ser producidas con distintos tamaños y formas y ser fácilmente funcionalizadas con un amplio abanico de ligandos, tales como: anticuerpos, polímeros, sondas de diagnóstico, fármacos, material genético, inclusive para la detección de amenazas químicas y biológicas (Upadhyayula, 2012). Por todo ello, las AuNP han despertado un gran interés en diversos campos del conocimiento científico, especialmente en los estudios de las áreas biomédica y ambiental (Castro-Ortíz, 2007; Wei et al., 2010; Díaz et al., 2011).

Por otro lado los microorganismos se constituyen como buenos indicadores del estado trófico de los ecosistemas y responden a los disturbios ocurridos modificando su estructura en cuanto a composición y abundancia se refiere. La detección de cambios en los ecosistemas acuáticos, específicamente a partir de las comunidades de hongos, bacterias y algas, en la actualidad es ampliamente utilizada y constituye un mecanismo confiable y de bajo costo, debido a que no requiere de equipos muy sofisticados para evaluar las alteraciones en los sistemas, puesto que dichos microorganismos reflejan los cambios que se han presentado en un recurso hídrico, a diferencia de los parámetros fisicoquímicos que solo muestran las situaciones puntuales del momento de la muestra.

En este trabajo se realiza la síntesis (química y biológica) caracterización de AuNPs y funcionalización con sondas específicas de DNA de dos microorganismos de interés ambiental Achlya sp. y Escherichia coli (E.coli). Achlya sp.es un hongo que infecta peces en piscifactorías, acuarios y embalses naturales; E coli, es una bacteria patógena para los humanos y puede ser fuente de contaminación en alimentos y agua.

Las AuNPs funcionalizadas con DNA podrán ser utilizadas en el diseño y construcción de biosensores ambientales para detectar los microorganismos antes mencionados, permitiendo monitorear, prevenir y corregir aspectos que causen desequilibrios ecológicos en ambientes acuáticos tales como los canales de Xochimilco, hábitat del pez endémico Girardinichtys viviparus, que se encuentra en peligro de extinción (Navarrete-Salgado et al., 2004), debido a la sobreexplotación, contaminación con descargas de aguas residuales y la consecuente infección de Achlya sp.

Estos nuevos dispositivos analíticos (genosensores) proporcionan información de forma rápida, simple y de bajo costo, comparada con las técnicas convencionales.

Acerca de la síntesis biológica de nanopartículas utilizando extractos de plantas, Narayanan y Sakthivel, 2011 mencionan que es más sostenible y renovable que la síntesis química, además de que el uso de plantas y sus productos es más ventajoso que el uso de microorganismos ya que éstos necesitan metodologías costosas para el mantenimiento del cultivo microbiano y del proceso de síntesis.

La funcionalización de las AuNPs mediante el sistema Estreptavidina- Biotina ha sido usada durante muchos años en múltiples aplicaciones. Diamandis y Christopoulos (1991), lo utilizan en ensayos de reacción inmunológica y de hibridación de ácidos nucleídos.

Wang et al., 2001 reportan la detección electroquímica del gen BRCA1 asociado a cáncer de mama y ovario. Este fue el primer reporte de detección electroqímica de DNA con nanopartículas de oro funcionalizadas con estreptavidina.

En cuanto al diseño de sondas específicas de DNA (oligonucleótidos) para los microorganismos Achlya sp. y E. coli, no se encontró ningún trabajo en la literatura que lo reporte, sobre todo en lo que se refiere a Achlya sp. Mendoza (2011) construyó un biosensor basado en nanoestructuras, mediante el uso de DNA como molécula de biorreconocimiento (genosensor), utilizando AuNPs como marca, para la detección electroquímica de E. coli, mediante el evento de hibridación, sin embargo las secuencias genéticas utilizadas fueron tomadas de la literatura.

Alvarado (2012) construyó un biosensor electroquímico de afinidad usando un anticuerpo como molécula de reconocimiento (inmunosensor), basado en AuNPs como marca y utilizando partículas superparamagnéticas como plataforma para la inmovilización del anticuerpo (anti- E. coli), todo ello sobre un electrodo de grafito-epoxi compósito con un imán integrado (M-GECE) que actuó como electrodo de trabajo, para la detección de E. coli en agua.

Resultados

Síntesis Química

Las AuNPs fueron sintetizadas por el método de Turkevich et al. (1951), con algunas modificaciones, este método es sencillo y relativamente rápido. En la figura 2 se observan las AuNPs sintetizadas y el espectro Uv-Vis.

Figura 2. Espectro Uv-Vis de AuNPs sintetiadas químicamente

Con esta caracterización se observó una longitud de onda máxima de absorción de las AuNPs sintetizadas de 519.5 nm, lo cual indica que se cuenta con AuNPs de aproximadamente 20 nm, ya que en la literatura se reporta un espectro de 520 nm para las mismas (Carralero, 2009).

Síntesis Biológica

La síntesis biológica de AuNPs se realizó con una combinación de las técnicas de Turkevich et al., 1951 y Rico-Moctezuma et al 2010. Se utilizó extracto de Opuntia sp. (nopal), Allum sp. (cebolla), Pyrus sp. (pera), Coffea sp. (café) y Laurus sp. (laurel), como agente reductor; en la tabla 1 se observan los extractos obtenidos, el pH y la longitud de onda de las AuNPs sintetizadas, en la figura 3 se observan los espectros de UvVis.

Tabla 1. Extractos de las diferentes plantas utilizados como agente reductor en la síntesis biológica de AuNPs.

Figura 3. Espectro UV-Vis de las AuNPs biosintetizadas

Diseño de Sondas

El diseño de las sondas se realizó utilizando el programa Primer Blast. En la tabla 2 se observa el resultado.

Tabla 2. Sondas Diseñadas

Estas sondas ya han llegado al laboratorio de Microbiología Ambiental y estamos por realizar la funcionalización de las AuNPs.

Conclusiones

• La síntesis química y caracterización por UV-Vis, TEM y AFM de las AuNPs muestra que se obtuvieron AuNPs de aproximadamente 20nm, de forma esférica y monodispersas las cuales pueden ser funcionalizadas con DNA.

• Con la biosíntesis de AuNPs a partir de extractos de plantas se obtuvieron nanopartículas de diferentes tamaños y formas.

• La siguiente fase del proyecto consistirá en la funcionalización de las sondas de DNA con las AuNPs sintetizadas tanto químicamente como biológicamente. Estas técnicas se llevarán a cabo en el Laboratorio de Microbiología Ambiental de la UAM-A.

Referencias

Alvarado, Vanegas Susana. (2012) «Biosensor Electroquímico de Afinidad para la Deteccion de E. Coli en agua.» Proyecto Terminal de la carrera en Ingeniería Química, UAM-Azcapotzalco, Mexico D.F.

Castro-Ortíz, P.B., Luna Pabello, V.M y Villalobos Pietrini R. (2007) «Estado del Arte y Perspectivas del uso de biosensores ambientaes en México.» Revista Internacional de Contaminación Ambiental 23:35-45

Díaz, J., B. Fontal, D. Combita, C. Martínez, y A. Corma. (2011) «Sintesis de nano-Au soportados en oxidos metalicos y su sactividad catalitica en reacciones de oxido redución de CO.» Rev. LatinAm. Metal. Mat. ( Universidad Simón Bolívar.) 33: 43-53.

Hernando, Grande A. (2007) «Nanotecnología y Nanopartículs Magneticas: La Física actual en la lucha contra la enfermedad.» Rev.R.Acad.Cienc.Exact.Fís.Nat. 101: 321-27.

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Navarrete Salgado, N., Contreras Rivero, G., Elías Fernándz, G. y Rojas Bustamante M.L. (2004)«Situacion de Giriardinichthys viviparus, especie que se encuentra en peligro de extinción.» Revista de Zoología (Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) 15: 1-6.

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Turkevich, P., S. Cooper, y J. Hilier. (1951) «A Study of the Nucleation and Growth Process in the Synthesis of Collidal Gold.» J. Discuss. Faraday Soc., 11: 55-75.

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Autor:

Blanca Estela Chávez Sandoval*,

María Teresa Castañeda Briones,

Francisco García Franco,

Susana Alvarado Vanegas

Ezel J. Galindo Pérez.

Universidad Autónoma Metropolitana-Azcapotzalco

México D.F.