Estudio preliminar del comportamiento de drosophila melanogaster cultivadas in vitro bajo condiciones de estrés

La mosca de la fruta (Drosophila melanogaster) es el organismo modelo empleado para varios tipos de investigaciones científicas principalmente estudios genéticos y poblacionales. La manipulación de los mismos en el laboratorio genera presión de estrés sobre estas, lo cual podrían afectar su comportamiento. El presente estudio se llevó a cabo en poblaciones de Drosophila melanogaster cultivadas in vitro con el propósito de analizar el comportamiento bajo condiciones de estrés mecánico y químico. Se procedió a la selección al azar de 60 individuos por frasco (30 machos y 30 hembras), con duplicados para cada tratamiento, así contabilizando en total 360 individuos silvestres (Samarkand). Los tratamientos se realizaron por 60 segundos cada 20 minutos y consistió en la perturbación de los frascos con una fuerza de 1.50 N generado por un bloque macizo (estrés mecánico) y aplicación de 3 ml de éter etílico (estrés químico). El testigo no fue sometido a ningún procedimiento. El etograma se realizó mediante el método de Scan por 30 minutos, llevando registro de las frecuencias en que fueron apareciendo las unidades de comportamientos analizadas. Se observó en los resultados de las observaciones un aumento considerable en la frecuencia de vuelo en bucles y caminata, así como una disminución en la frecuencia de alimentación en contrastes con los individuos testigos.

Palabras claves: estrés mecánico, estrés químico, etograma, in vitro.

Introducción

Los organismos modelos utilizados para las investigaciones científicas, son individuos que en su mayoría poseen una alta similitud en las secuencias de nucleótidos en varios genes, tal es el caso de Drosophila melanogaster, la cual posee un 60 % de similitud y es utilizado en biomedicina para el estudio de enfermedades (Reiter et al., 2001). Este es un díptero, que solo posee cuatro pares de cromosomas, es de fácil manejo y cultivo, además posee un ciclo de vida corto y permite la utilización de una gran población en un lapso corto de tiempo (Ashburner & Thompson, 1978).

La utilización de organismos modelos como objetos de estudios etológicos y fisiológicos ha aumentado en las ultimas décadas con el objetivo de conocer y comprender el comportamiento y la neuroetología de los mismos (Curran et al., 2012). Es de amplio conocimiento que la manipulación de estos organismos y de su entorno, y de cualquier otro, generan altas tensiones de estrés, los cuales se ven reflejadas en la fisiología del animal, en el comportamiento de los mismos y en los patrones de movilidad de los mismos, lo que podría interferir en los resultados de las investigaciones (Kimura et al., 1993 y Curran et al., 2012).

Las características de los patrones de movimiento de insectos se resumen como sigue: es generado fundamentalmente en el sistema nervioso central, el generador central de patrones (Graham 1979 a, b); y el mismo puede verse afectada significativamente en función de las velocidades que posee el animal para caminar (Hughes, 1952); y los patrones varían con la carga (Pearson, 1972). Por lo que se podría decir que depende de la condición de los estados internos y alrededores de los mismos (niveles de estrés). Esta propiedad es básicamente lo mismo en artrópodos y mamíferos que presentan la locomoción dependiente de las patas (Wilson, 1996).

En el Paraguay estos organismos son empleados para prácticas laboratoriales en la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad Nacional de Asunción, por lo que es importante la determinación de los efectos sobre el comportamiento que generan los distintos tipos de estrés a las que se someten estos organismos.

El siguiente trabajo de investigación tuvo por objetivo principal analizar el comportamiento bajo condiciones de estrés mecánico y químico en poblaciones de Drosophila melanogaster in vitro mediante la descripción y la elaboración de etograma.

Materiales y métodos

Área de estudio

El trabajo se llevó a cabo los meses de septiembre 2015 a noviembre 2015, en el Laboratorio de Genética del Departamento de Biología, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (FACEN-UNA).

Diseño de la investigación

Descripción del comportamiento de Drosophila melanogaster in vitro bajo distintas condiciones de estrés

Se procedió a la esterilización de seis frascos de vidrio de 700 ml de capacidad (121ºC y 1 atm de presión, 30 minutos), y se preparó medios de cultivo estándar para los frascos autoclavados (21 g de harina de maíz, 12 g sacarosa, 13,35 g de levadura granulada, 3 g de agar-agar, ácido fosfórico: ácido propiónico 1 ml, nipagin 1 ml) (Rodríguez-Arnaiz, 2005).

Una vez depositados los medios de cultivos en cada frasco se designaron al azar 60 individuos (Drosophila melanogaster) de la cepa Samarkand (silvestre) en una proporción 1:1 (30 hembras y 30 machos), se utilizaron duplicados por tratamientos (testigo, estrés mecánico y estrés químico), y se mantuvieron en el moscario del Laboratorio de Mutagénesis Ambiental de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales –Anexo A.

Los tratamientos se realizaron el transcurso de tres días, bajo condiciones ambientales normales de temperatura 24 ± 2° C, presión 1 atm, humedad relativa del 80% y una exposición a luz (200 luxes) de 12 ± 1 horas.

Testigo (Condiciones normales)

Los frascos con los individuos se dejaron reposar periodo durante el cual se realizaron observaciones mediante el método de Scan por 30 minutos con 60 segundos de espera para la elaboración del etograma, y registro de la frecuencia de los sucesos.

Estrés mecánico

Se midió un bloque macizo de madera con un dinamómetro (precisión 0.50 N) en el Laboratorio de Física del Departamento de Física (FACEN) determinando una fuerza de 1.50 N para realizar los tratamientos de estrés mecánico.

La perturbación mecánica se realizó con los bloques de madera de 1.50 N, las cuales se dejaron caer a la boca de los frascos desde una altura de 20 cm, por un lapso de 60 segundos cada 20 minutos. Durante el tratamiento se realizaron las observaciones por 30 minutos empleando el método de Scan también con 60 segundos de espera para la elaboración del etograma. También se registro la frecuencia de los eventos observados.

Estrés químico

Los frascos fueron sometidos a la aplicación indirecta de 3 ml de éter etílico con ayuda de una almohadilla de gasa esterilizada, la cual se puso en contacto con los mismos. El tratamiento con la substancia se realizó en una campana de gases, el contacto se realizó por 60 segundos cada 20 minutos, durante el cual se realizaron las observaciones correspondientes por 30 minutos mediante el método de Scan con un lapso de espera de 60 segundos. También se realizó un registro cuantitativo de los sucesos.

Resultados & discusión

Etograma

Durante la elaboración del etograma y registro de frecuencias, se reconocieron tres categorías etológicas (locomoción, social agonística y alimentación) las cuales fueron subdivididas en unidades de comportamiento para su mejor análisis– Anexo 3.

Tales unidades de comportamientos que fueron evaluadas en el estudio fueron distribuidos en tres categorías mencionadas a continuación:

Tabla 1: Etograma con categorías y unidades de cada categoría.

Locomoción

• Vuelo recto: los individuos realizaban vuelos de un extremo a otro del frasco con cambio de plano.

• Vuelo en bucles: los individuos al volar realizaban giros en el transcurso del vuelo antes de posarse en las paredes del frasco.

• Salto: los individuos realizaban pequeño desplazamiento mediante vuelos cortos sin cambio de plano.

• Caminata: los individuos se desplazaban sin vuelo sobre el mismo plano.

Social agonística

• Agresividad: los individuos realizaban fricciones en el primer par de patas así como tercer par de patas y machos mantenían las alas rectas ante la presencia cercana de otro par (Hoffman, 1987).

Alimentación

• Comer: los individuos se posaban sobre el medio de cultivo realizando movimientos del aparato bucal.

Durante la observación todas las categorías estuvieron presentes tanto en individuos sometidos a estrés mecánico y a estrés químico. Los individuos sometidos a estrés mecánico presentaron un aumento drástico en la frecuencia de ejecución en la categoría de locomoción en comparación con la muestra testigo. En cuanto a la alimentación y social agonística, disminuyeron notablemente. En individuos sometidos a estrés químico la categoría social agonística fue la de mayor ejecución, observándose la disminución en las dos restantes (locomoción y alimentación).

Dentro de la categoría de locomoción, en individuos sometidos a estrés mecánico, las unidades de comportamiento de vuelo recto y salto son las que aumentaron considerablemente en ejecución. En la categoría social agonística, con la unidad de comportamiento de agresividad, la repetición de la actividad disminuyó. Para la categoría de alimentación, con la unidad de comportamiento comer, la ejecución de la misma también disminuyó en comparación a la muestra testigo.

Los individuos que fueron sometidos a estrés químico presentaron cambios en la categoría de locomoción, donde la ejecución del vuelo en bucle y la caminata aumentaron considerablemente. En cuanto a la categoría social agonística, la agresividad, se da reiteradas veces. Para la categoría de alimentación con la unidad de comportamiento comer, se observó la disminución importante de la ejecución de la misma, en comparación a la muestra testigo– Tabla 2.

Tabla 2: Tabla de frecuencias de unidades de comportamiento de individuos de Drosophila melanogaster sometidos a distintos tipos de estrés (testigo, estrés mecánico y estrés químico).

El aumento en la frecuencia de agresividad en la mosca de fruta bajo estrés químico podría deberse a que estos organismos tratados desencadenarían una respuesta al peligro que podría afectar a la población.

La reacción de los organismos ante estímulos de estrés y circunstancias difíciles es una respuesta crucial en el adaptamiento de los mismos a tensiones que ejerce su entorno (Kimura et al., 1993). Individuos de la mayoría de las clases de animales reaccionan activando una serie de complejos repertorios fisiológicos y conductuales, cuando dichos mecanismos resultan inadecuados (por prolongados o excesivos) se pueden presentar consecuencias negativas sobre otras funciones fisiológicas importantes como la locomoción y la alimentación (Curran et al., 2012 y Perea et al., 1997).

La agresividad se ve siempre en la lucha por alimentos, territorio (aproximadamente 20 mm) y éxito reproductivo (Hoffmann, 1987 y Hoffmann & Cacoyianni, 1990)

El aumento observado en la frecuencia de agresividad, de caminata, de vuelos en bucles y la disminución en la frecuencia de alimentación nos podrían indicar lo descrito por Perea et al. (1997), donde estos tipos de estrés a las que podrían estar sometidos estos organismos podrían generar cambios a nivel fisiológicos en los individuos estudiados, ocasionando respuestas del tipo "huida o enfrentamiento" ante la gran presión de estrés que soportan estos organismos durante la manipulación de los mismos en el laboratorio- Figura 1.

Figura 1: Gráfico de frecuencias de unidades de comportamiento en los tratamientos

Conclusiones y recomendaciones

Se pudo llegar al análisis del compartemiento bajo condiciones de estrés mecánico y químico en poblaciones de Drosophila melanogaster in vitro con descripción y elaboración del etograma cumpliéndose así con el objetivo del trabajo.

Los individuos de Drosophila melanogaster sometidos a estrés mecánico presentaron aumentos considerables en la ejecución de la categoría de locomoción en comparación con los organismos testigos. Ante el estrés químico, los individuos sometidos al mismo aumentaron la ejecución de la categoría social agonística en comparación con la muestra testigo. El cambio en el comportamiento podría reflejar consecuencias a nivel fisiológico y neuroetológico ocasionados por estos tipos de estrés generados durante la manipulación de los organizamos en el laboratorio.

Se recomienda seguir realizando estas observaciones en el laboratorio a manera de ejecutar un análisis en el transcurso del tiempo y de esta manera ampliar el espectro del estudio.

Literatura citada

ASHBURNER M., & THOMPSON J. N. 1978. The laboratory culture of Drosophila.

The genetics and biology of Drosophila. Academic Press. 2: 1–81

CURRAN, K. P., & CHALASANI, S. H. 2012. Serotonin circuits and anxiety: what

can invertebrates teach us?. Invert Neurosci. 12: 81-92.

GRAHAM D. 1979a. The effects of circumo esophageal lesion on the behavior of the

stick insect Carausius morosus. I. Cyclic behavior patterns. Biol Cybern 32:139-145.

GRAHAM D. 1979b. The effects of circumo esophageal lesion on the behavior of the

stick insect Carausius morosus. II. Change in walking coordination. Biol Cybern

32:147-152.

HOFFMANN, A. A., & CACOYIANNI, Z. 1990. Territoriality in Drosophila

melanogaster as a conditional strategy. Animal Behaviour. 40(3): 526-537.

HOFFMANN, A. A. 1987. A laboratory study of male territoriality in the sibling

species Drosophila melanogaster and D. simulans. Animal Behaviour. 35(3):

807-818.

HUGHES G. M. 1952. The coordination of insect movements. I. The walking

movements of insects. J ExpBiol 29:267-283.

KIMURA, S., YANO, M., & SHIMIZU, H. 1993. A self-organizing model of walking

patterns of insects. Biological Cybernetics, 69(3), 183-193.

PEARSON, K. G. 1972. Central programming and reflex control of walking on the

cockroach. J Exp Biol 56:173-193.

PEREA, A. T., ISAÍAS, G. T., & MALDONADO, F. G. 1997. Técnicas de medición

de estrés en aves. Vet. Méx, 28(4), 345.

REITER, L. T., POTOCKI, L., CHIEN, S., GRIBSKOV, M., & BIER, E. 2001. A

systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila

melanogaster. Genome research. 11(6): 1114-1125.

RODRÍGUEZ-ARNAIZ, R. 2005. Manual de prácticas de genética y cuaderno de

trabajo. UNAM. 297 pp.

WILSON, D. M. 1966. Insect walking. Annual review of entomology. 11(1): 103-122.

Anexos

Anexo A: Frascos (700 ml de capacidad) con individuos (30 machos y 30 hembras) correspondiente a cada tratamiento.

Anexo B

Anexo C

Anexo D

Anexo B,C,D: Tabla de etograma distribuidos por días de tratamientos. So. Ag: Social agonística; Al: Alimentación; VR: Vuelo recto; VB: Vuelo en bucles; S: Salto; Ca: Caminata; Ag: Agresividad; Co: Comer

Autor:

C. Rivarola Sena1,

Y. Sleiman Alonso1

E. Gayozo Melgarejo1,2

1 Departamento Biología, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (FACEN), Universidad Nacional de Asunción (UNA).

2 Centro Multidisciplinario de Investigaciones Tecnológicas, CEMIT-UNA.

UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES

DEPARTAMENTO BIOLOGÍA

Cátedra Etología