Camino de señalización de EGFR (página 2)

1-Construcción de biblioteca de cDNA en humanos

Para la construcción de esta biblioteca de cDNA humano, partimos de un cultivo de células Hela (linaje de células de carcinoma de cervix humano, verdaderamente «inmortales») y realizamos una lisis de las células y simultánea extracción de mRNA a través de una columna de afinidad a la cual se encuentra fija una secuencia complementaria a la cola poli A de los mensajeros maduros(Oligotex Direct mRNA Mini Kit, Qiagen). Este kit permite obtener mRNA intacto directamente de las células Hela.

Una vez obtenidos los mRNAs, proseguimos con la obtención del cDNA. Dado que el fin de la obtención de cDNA es su clonado para lograr la expresión de las proteínas que se expresan en esta línea celular humana, es conveniente que la síntesis del cDNA sea la apropiada para llevar a cabo un clonado direccionado. Es por ello que fue utilizada la estrategia que se esquematiza a continuación.

Figura 1. Esquema de síntesis de cDNA para realizar un clonado direccionado.

Por empezar, se utiliza un oligo(dT)18 100M, al cual se le ha añadido a su extremo 3’OH libre un oligonucleótido (Operon Technologies) que contiene la secuencia de corte para la enzima de restricción XhoI. La síntesis de oligodT-XhoI es realizada por Operon Technologies.

La reacción siguiente es la incubación de ese primer oligodT- Xho I con el RNAm ya purificado para realizar la reacción de retrotranscripción con el kit conteniendo la M-MulV RT (Fermentas). Esta enzima permite sintetizar la primera cadena de cDNA provenientes de mensajeros largos. Dado que el cDNA total puede contener secuencias de corte para alguna de las enzimas de restricción utilizadas, es preciso que, para evitar su corte posterior, esta síntesis se realice en presencia de un nucléotido metilado ,5–metil dCTP, (Fermentas, dNTP mix 10mM each).

El oligodT-Xho I se sintetizó con arreglo al mapa del sitio múltiple de clonado de p YD1 y su secuencia es la siguiente.

5’ XXXCTCGAG(T)183’

donde X representa los tres nucleótidos que se colocan delante de la secuencia de corte para Xho I para que la enzima pueda cortar correctamente. En amarillo se puntualiza la secuencia palíndrome de corte para Xho I.

A continuación, se coloca RNAasa H, la cual realiza nicks en las cadenas del RNAm, dejando los extremos 3’OH libres que funcionarán de primers para la segunda cadena que sintetizará la DNA polimerasa I utilizando un kit second Strand synthesis(Fermentas). Luego, es necesario ligar al cDNA doble cadena un adaptador con la secuencia de corte para Acc65 (Operon Technologies). Esta ligación se hace con la T4DNA ligasa.

La secuencia adaptadora que contiene el sitio de corte para Acc65 es la siguiente

La secuencia en rojo es el sitio de corte para Acc65.

El nucléotido A marcado en amarillo se agrega a la secuencia de corte de Acc65 para lograr que el cDNA quede en marco de lectura al ser clonado.

Luego, pasamos a digerir el cDNA con la enzima de restricción Acc65 y Xho I simultáneamente dado que ambas son compatibles en su máxima actividad en un mismo buffer de digestión (NEBuffer3). Así, obtenemos el cDNA con los extremos cohesivos para dos enzimas de restricción diferentes, listo para clonarlo en el vector p YD1.

A continuación se presenta el sitio múltiple de clonado de pYD1 a partir de cual se pudo construir los oligonucleótidos necesarios para incorporar las secuencias de restricción al cDNA ya en su síntesis.

Figura2. Sitio múltiple de clonado de p YD1. En círculos se encuentran marcados los sitios de corte para Acc65 y Xho I.

El cDNA sintetizado contiene las secuencias de corte para la enzima Acc65 en el extremo 5’ de la cadena codificante y la secuencia de corte para Xho I en el extremo 3’.

El vector utilizado en la construcción de la biblioteca de cDNA para ser expresada en la superficie de levaduras es el p YD1 ( yeast display vector, Invitrogen). El vector pYD1 está específicamente diseñado para direccionar y expresar proteínas recombinantes en la superficie de Saccharomyces cerevisiae. Las proteínas pueden ser analizadas por su habilidad para interactuar con ligandos de interés, como es en este caso EGFR.

Preparación del vector p YD1

A continuación se esquematizan los componentes del vector utilizado para la construcción de la biblioteca de cDNA.

Figura 3. Vector p YD1 con sus elementos. El vector contiene un sitio múltiple de clonado interrumpiendo el cassette AGA2. Este cassette contiene una secuencia para aga2 seguido de una secuencia de corte para una enterokinasa, luego un epitope Xpress, MCS, un epitope V5 y una cola 6 His. Contiene un promotor inducible por galactosa (pgal1), un origen de replicación de alto número de copias en bacterias (pUC ori), una resistencia a ampicilina (ampicilin, codificante para la enzima -lactamasa), un origen de replicación en levaduras (CEN/ARS), un marcador de selección para eucariotas (TRP1).

Dentro del cassette de aga2 se encuentra el sitio múltiple de clonado, con sitios de corte únicos para varias enzimas de restricción. La estrategia de clonado para la construcción de la biblioteca de cDNA se basa en el rol de las proteínas aga1 y aga2. Estas dos proteínas están asociadas con el camino secretorio en levaduras, de modo tal que aga 2 interactúa con aga1, la cual está retenida en la pared celular de levaduras, formando puentes disulfuro, quedando aga2 fuera del célula. Es así como, de clonar el cDNA obtenido anteriormente como proteína de fusión de aga2 podremos direccionar las proteínas codificadas por el cDNA a la superficie de las células de levaduras.

El cassette que permite llevar a cabo esta estrategia contiene flanqueando el MCS dos tags que codifican para epitopes para poder monitorear la expresión de las proteínas de fusión. Estos epitopes son Xpress y V5. Finalmente, también se encuentra una secuencia tag 6 His para purificar, si se quisiera, la proteína de fusión. De cualquier manera los tags río abajo del MCS no serán expresados en la proteína de fusión, ya que vamos a clonar un cDNA completo que contiene su sitio de terminación de la traducción. Si el cDNA es ligado fuera de fase con los tags río arriba del MCS, resultara en una proteína abortiva por existir codones stop prematuros.

La preparación del vector comienza con su amplificación en bacterias electrocompetentes (ver apéndice) para obtener mayor cantidad. Luego, se extrae DNA plasmídico utilizando un HiSpeed Plasmid Midi Kit Qiagen (Qiagen, Hilden, Alemania).

Una vez que se tiene cantidad suficiente del vector p YD1, se procede a la digestión del mismo con las enzimas correspondientes, Acc65 y XhoI (New England Biolabs). Dado que las enzimas elegidas compatibilizan en su actividad óptima, se podrá usar un buffer común a las dos y así realizar una digestión simultánea. Para ello se utiliza un buffer NET3 (ver apéndice). Ya digerido el vector, se purifica con columna (QIAquick PCR purification kit, Qiagen).

Luego, se procede a la ligación y posterior transformación en bacterias (ver apéndice) competentes 10G Supreme (Lucigen, Middleton,WI), mediante electroporación, es decir un método físico, de alta eficiencia. La selección de las bacterias transformantes se realiza con ampicilina y de todas las colonias, se eligen aproximadamente 30 colonias al azar para realizar un control de la calidad y diversidad de la biblioteca. Para ello se amplifica por colony PCR utilizando un juego de primers que flanquean el sitio de multiple clonado.

El producto de PCR se corre un un gel de agarosa, y luego se manda a secuenciar. Las secuencias así obtenidas se podrán comparar en bases de datos públicas, esperándose encontrar diferentes genes trancripcionalmente activos en células de carcinoma de cervix humano (Hela).

Si la calidad de la biblioteca es buena (pocos vectores vacíos, diversidad de insertos), se procede a transformar las levaduras. Primero se hace un pool de todos los clones de E.coli (10G Supreme) que sobrevivieron la selección por ampicilina. Se realiza una extracción de DNA plasmídico usando un kit maxiprep Qiagen (Qiagen, Hilden, Alemania) y, con el producto de la extracción, se transforman las células de Saccharomyces cerevisiae cepa EBY100 (Invitrogen).

Las transformantes son seleccionadas en medio SD-CAA (2% de dextrosa, 0,67% de fuente de nitrógeno,0,5% de hidrolizado de caseina ). Finalmente, las colonias de levaduras sobrevivientes a la selección se agrupan y se colocan en un cultivo líquido SD-CAA que además contiene 15% de glicerol para ser guardadas ya alicuotadas a –80°C. Esta será nuestra biblioteca de cDNA expresada en levaduras.

2-Elección del fragmento de EGFR para hacer la interacción.

El objetivo del trabajo es identificar proteínas citoplasmáticas con afinidad por el receptor de EGF cuando el mismo se encuentra fosforilado. Por lo tanto es razonable usar algún fragmento del EGFR que se autofosforile en tirosina para hacer la interacción. De trabajos en células de carcinoma epitelial humano (línea celular A431)2 , sabemos que el receptor de EGF se autofosforila en tres tirosinas del dominio citoplasmático (Y1110, Y1172, Y1197)3.

Estas tres tirosinas se encuentran en secuencias similares a sitios de fosforilación para tirosinas descriptos previamente. Sin embargo se sabe que la tirosina Y1197 es la más fuertemente fosforilada in vivo ante la inducción por EGF, lo que la hace una buena candidata para la interacción. Por lo tanto vamos a usar un péptido de 15 aminoácidos centrado en Y1197, es decir de 1165-1180.

1 mrpsgtagaa llallaalcp asraleekkv cqgtsnkltq lgtfedhfls lqrmfnncev

61 vlgnleityv qrnydlsflk tiqevagyvl ialntverip lenlqiirgn myyensyala

121 vlsnydankt glkelpmrnl qeilhgavrf snnpalcnve siqwrdivss dflsnmsmdf

181 qnhlgscqkc dpscpngscw gageencqkl tkiicaqqcs grcrgkspsd cchnqcaagc

241 tgpresdclv crkfrdeatc kdtcpplmly npttyqmdvn pegkysfgat cvkkcprnyv

301 vtdhgscvra cgadsyemee dgvrkckkce gpcrkvcngi gigefkdsls inatnikhfk

361 nctsisgdlh ilpvafrgds fthtppldpq eldilktvke itgflliqaw penrtdlhaf

421 enleiirgrt kqhgqfslav vslnitslgl rslkeisdgd viisgnknlc yantinwkkl

481 fgtsgqktki isnrgensck atgqvchalc spegcwgpep rdcvscrnvs rgrecvdkcn

541 llegeprefv enseciqchp eclpqamnit ctgrgpdnci qcahyidgph cvktcpagvm

601 genntlvwky adaghvchlc hpnctygctg pglegcptng pkipsiatgm vgalllllvv

661 algiglfmrr rhivrkrtlr rllqerelve pltpsgeapn qallrilket efkkikvlgs

721 gafgtvykgl wipegekvki pvaikelrea tspkankeil deayvmasvd nphvcrllgi

781 cltstvqlit qlmpfgclld yvrehkdnig sqyllnwcvq iakgmnyled rrlvhrdlaa

841 rnvlvktpqh vkitdfglak llgaeekeyh aeggkvpikw malesilhri ythqsdvwsy

901 gvtvwelmtf gskpydgipa seissilekg erlpqppict idvymimvkc wmidadsrpk

961 freliiefsk mardpqrylv iqgdermhlp sptdsnfyra lmdeedmddv vdadeylipq

1021 qgffsspsts rtpllsslsa tsnnstvaci drnglqscpi kedsflqrys sdptgalted

1081 siddtflpvp eyinqsvpkr pagsvqnpvy hnqplnpaps rdphyqdphs tavgnpeyln

1141 tvqptcvnst fdspahwaqk gshqisldnp dyqqdffpke akpngifkgs taenaeylrv

1201 apqssefiga

Figura 4. Secuencia de aminoácidos del receptor de EGF. Las tirosinas atuofosfotiladas están marcadas en rojo, y las secuencia elegida en azul.

La secuencia peptídica elegida será entonces STAENAEYLRVAPQS.

3-Selección de clones positivos por citometría de flujo.

El screening se realizará por citometría de flujo (FACS, Fluorescence Activated Cell Sorting).

Para ello se crecen las células de la biblioteca en medio SD-CAA hasta una absorbancia a 600nm de aproximadamente 5. Luego se pasan a un medio SRG-CAA (SD-CAA + 2% Galactosa) a una densidad óptica inicial de 0.5 y se incuba over night a 30ºC. Este medio induce la expresión del cassete de AGA2 con el inserto (proteína de fusión), ya que el mismo se encuentra bajo el promotor de GAL1, inducible por galactosa.

Una vez inducidas las células se centrifugan y lavan dos veces con PBS (Phosphate buffer saline). Luego se incuban en un volumen de 500μL de PBS con 10μM del pιptido elegido fosforilado y biotinilado por 4 horas a 4ºC.

Pasado este tiempo, se agrega hasta una concentración de 40μM el péptido sin fosforilar ni biotinilar para eliminar por competencia las interacciones no especificas entre el péptido marcado y las proteínas de la superficie celular. Las células que expresen en superficie alguna proteína que interactúe específicamente con el péptido fosforilado, quedaran marcadas con biotina. Luego de lavar dos veces con PBS, se incuban las células con 1:500 de streptavidina conjugada a ficoeritrina (SA-PE, Streptavidine-Phycoerythrin, Invitrogen). Tras 20 minutos a 4ºC de incubación se lavan dos veces las levaduras con PBS.

La citometría de flujo se realiza en un equipo comercial (FACSaria, BD Bioscience) excitando a 488nm y midiendo la emisión a alrededor del máximo a 570nm (con un filtro pasa banda de 585±22 nm). El espectro de fluorescencia de la ficoeritrina se muestra en el apéndice. Para calibrar la citometría primero se analizan levaduras EBY100 sin transformar, incubadas con el péptido y SA-PE como se detalló anteriormente, para definir el umbral de fluorescencia que será utilizado para seleccionar las células de la biblioteca. Se espera obtener un gráfico como el de la figura 5, en el cual se muestra la región supraumbral definida para la selección.

Figura 5. Distribución esperada para la calibración de la citometría de flujo. PE:niveles de flurescencia de la ficoeritrina (a 585nm). APC: niveles de fluorescencia de la aloficocianina (a 670nm). P2: Región de selección.

Las células de la biblioteca seleccionadas por el citómetro se recolectan en una placa con medio SD-CAA. Para aumentar la especificidad del screening se pueden hacer varias rondas del procedimiento descrito, usando las células seleccionadas como punto de partida para la siguiente ronda. Además se puede alternar el uso de SA-PE con SA-APC (streptavidine-allophycocyanin, estreptavidina conjugada a aloficocianina), para minimizar la selección de clones que unen directamente los reactivos de detección (ficoeritrina o aloficocianina). La detección de APC se realiza excitando a 633nm y midiendo la fluorescencia alrededor de 670nm. El espectro de la aloficocianina se muestra en el apéndice. Por este método de screening se pueden seleccionar los clones que expresen en superficie alguna proteína que interactúa específicamente con el péptido fosforilado.

Una vez identificados estos clones se minipreparan los plásmidos de cada uno utilizando un kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen, Hilden, Alemania) y se transforman en bacterias electrocompetentes (Ver apéndice). Una vez seleccionadas en medio con ampicilina, se puede hacer una colony PCR con los primers pYD1 For y Rev (detallados anteriormente), y secuenciar el producto de PCR. Conociendo la secuencia se puede llevar acabo una búsqueda (utilizando BLAST) en bases de datos públicas, e identificar el cDNA aislado. De esta manera es posible saber la identidad de las proteínas que interactúan específicamente con el péptido fosforilado.

4-Subclonado en vector de expresión.

Como verificación de la interacción entre la proteína encontrada y el fragmento fosforilado de EGFR, se hará un ensayo de co-inmunoprecipitación de células HeLa. Para ello es necesario subclonar el cDNA de la proteína hallado por el screening en un vector de expresión para eucariota superior. Consideraremos que una de las proteínas que interactúan con el dominio fosforilado del EGFR es la subunidad regulatoria de la quinasa PIP3 humana. Para llevar a cabo este subclonado, será necesario buscar la secuencia completa de cDNA de la subunidad de dicha proteína y diseñar los primers adecuados para levantar la secuencia de cDNA de interés. Se utilizará para este fin el vector pCMV-script (Stratagene) detallado en la figura 6.

Figura 6. Vector pCMV-Script. MCS: Sitio de Múltiple Clonado. SV40 pA: Sito de corte y poliadenilación tardío. F1 Ori: Origen de replicación de fago filamentoso. P bla/P SV40: Promotores procariota/eucariota para gen de resistencia a antibiótico neo/kan. TK pA: Sitio de corte y poliadenilación. pUC Ori. Origen de replicación para E.Coli. P CMV: Promotor de citomegalo virus, fuerte constitutivo y eucariota.

En primer lugar se amplifica el vector pCMV-Script en bacterias y miniprepara siguiendo los pasos utilizados en el vector pYD1. Luego se digiere con HindIII y XhoI. Ya que estas enzimas son parcialmente compatibles en el buffer NEB 3 de New England Biolabs a 37ºC (100% actividad HindII, 75-100% actividad XhoI) se pueden incubar ambas enzimas juntas. Luego de la digestión se purifica el vector cortado con una columna de purificación QIAquick PCR purification Kit (Qiagen).

Figura 7. Sitio de múltiple clonado del vector pCMV-Script

Por otro lado se miniprepara el plásmido, de las bacterias transformadas, que provenía de las levaduras que interactuaban con el fragmento peptídico de EGFR fosforilado (QIAprep Spin Miniprep Kit, Qiagen). En este caso, consideramos que tenemos una cultivo de células Hela que está expresando activamente la subunidad regulatoria del PIP3 quinasa.. Es sabido que esta subunidad de la quinasa PIP3 interactúa con la región fosforilada del receptor EGF. Procedemos ahora a extraer mRNA del mismo modo que fue realizado en el apartado 1. Una vez tenido el mRNA intacto y total de estas células, continuamos con una reacción de retrotranscrición con M-MulV (Fermentas) utilizando como primer una secuencia de oligodT-XhoI (Operon Technologies) y una secuencia primer que contiene un segmento que aparea con el extremo 5’ del gen y que lleva a su vez la secuencia de corte para Hind III. Primero se realiza la síntesis de la primera cadena de DNA de la secuencia de interés y luego, llevamos todo el producto de reacción a una PCR para amplificar el cDNA de PIP3 qinasa. Se corre el producto de la digestión en un gel de agarosa 0.8%, teñido con Bromuro de Etidio y se aísla la banda correspondiente al cDNA cuyo tamaño molecular aproximadamente 5kb.Luego se purifica el DNA utilizando QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen).

La reacción de PCR que nos permita levantar ese fragmento de cDNA de la subunidad regulatoria de PIP3 quinasa se lleva a cabo con primers que diseñamos sobre la base de la secuencia de cDNA encontrada en las bases de datos (PUB MED).

A continuación, se muestra el diseño de los primers específicos que contienen las secuencias de corte para las dos enzimas de restricción que serán usadas: HindIII y XhoI.

Primers diseñados para aislar el cDNA de la subunidad regulatoria de la PIP3 quinasa humana.

Primer FORWARD (23 nucleótidos)

5’ XXXAAGCTTAATGGCTGGAGTCC 3’ Temperatura de melting = 60°C

%GC= 43%

La bese en rojo deja ver el nucleótido extra agregado al primer forward para lograr que la secuencia codificante quede en marco de lectura al ser clonada.

Primer REVERSE (25 nucleótidos)

5’ XXXCTCGAGTTACTTTATTGCAATG 3’ Temperatura de melting = 60°C

%GC= 35 %

Ya teniendo los primers diseñados, haremos la reacción de PCR, tomando como molde el DNA del vector linealizado p YD1.

El programa de PCR y las concentraciones de todos los componentes necesarios en la reacción se detallan a continuación.

Tabla 1. Protocolo de PCR llevado a cabo en la amplificación del fragmento a clonar.

Programa de PCR

Tabla 2. Programa de PCR llevado a cabo para la amplificación del fragmento a clonar.

Una vez realizada la reacción de PCR, tenemos en cantidad suficiente el fragmento de interés que contiene el cDNA de la subunidad regulatoria de la PIP3 quinasa que ya tiene incorporados los sitios de corte para las enzimas Hind III y XhoI.

Ahora, debemos proceder a correr el fragmento de PCR en un gel de agarosa 0,8% para su visualización por tinción con BrEt. Luego, logramos extraer la banda del peso molecular de interés y purificamos el DNA utilizando un kit para tal fin(QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen).

Una vez purificado debidamente, el cDNA debe ser digerido con las enzimas HindIII y XhoI siguiendo el siguiente protocolo.

Protocolo de digestión.

Buffer 10X de restricción 10l

Enzima Hind III 1l (1U/g DNA)

Enzima XhoI 1l(1U/g DNA)

cDNA 0,1 g DNA por l

Agua hasta 20 l finales

La reacción transcurre por dos horas a 37°C.

El mismo protocolo es seguido para la digestión del vector pCMV-Script, una vez que éste ha sido minipreparado (QIAprep Spin Miniprep Kit, Qiagen).

Una vez que el vector fue cortado, éste es corrido en un gel de agarosa 0,8% y luego, seleccionada la banda que contiene le vector linealizado, se procede a purificarla(QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen).

Procedemos luego a la reacción de ligación cuyo protocolo se muestra a continuación.

Buffer de ligación 5X 4l

Vector (4,3kb) 20ng

Inserto (5 kb) 3:1 60ng

T4 DNA ligasa 0,5 l

Volumen final 20l

Se incuba la reacción a 37°C durante 1 hora.

El producto de ligación se utiliza para transformar en bacterias electrocompetentes de la misma manera que se realizó para el vector pYD1. Una vez seleccionadas las bacterias en medio con kanamicina, se vuelve a minipreparar el vector de varias colonias para realizar el screening por colony PCR, utilizando los primers universales T3 y T7 que amplifican el sitio múltiple de clonado y darán cuenta de qué colonias tienen el vector recombinante.

El producto de PCR en cada caso se corre es un gel de agarosa 0,8% y se tiñe con BrEt. Así se seleccionan qué colonias tienen el vector deseado. Realizado este paso, volvemos a la/s colonias que contiene el vector recombinante y realizamos una minipreparación de DNA plasmídico con el kit para ese fin (QIAprep Spin Miniprep Kit).

5-Ensayo de co-inmunoprecipitación.

Para realizar el ensayo de inmunoprecipitación hay que hacer una cotransfección transiente del vector pCMV-Script, junto con un vector de expresión que contenga el cDNA de EGFR (considerando que ya esta clonado).

El ensayo se hará en células HeLa, pero se puede hacer en cualquier línea de células de mamíferos. Se transfectan las células por electroporación (ver protocolo en apéndice), buscándose altos porcentajes de células transfectadas, y se incuban por unas horas para asegurase de que expresen las proteínas. En la inmunoprecipitación se usará un anticuerpo monoclonal de ratón contra el epítope Xpress no conjugado (Invitrogen).

En primer lugar se hace un lisado de las células, extrayendo la fracción citoplasmática, utilizando un protocolo optimizado para no desarmar las interacciones entre proteínas (ver apéndice). Utilizaremos un kit (Actvie Motif Co-IP) para llevar acabo la inmuprecipitación, cuyo protocolo se especifica en el apéndice. El fundamento del método es la inmovilización de los anticuerpos (contra el epítope Xpress) en un sustrato de fácil precipitación, recubiertas de proteína A y G, que se unen a la región constante de los anticuerpos. Luego se incuban estas perlas (con el anticuerpo asociado) con el extracto celular. La proteína clonada en el vector pCMV-Script contiene el epítope Xpress, por lo que se unirá a las perlas. Si efectivamente interacciona con el receptor de EGF, debería formarse una cadena de interacciones, a saber; proteína A (o G) – Anticuerpo contra Xpress – epítope Xpress fusionado a proteína que interacciona con EGFR – EGFR.

Todo este complejo ha de precipitar junto con las perlas cuando se centrifugue. Para identificar las proteínas precipitadas se podrá hacer un western blot (ver protocolo en apéndice), utilizando un anticuerpo contra EGFR fosforilado en Y1197. Como controles se podrán usar anticuerpos para EGFR sin fosforilar (es decir que no diferencia si esta o no fosforilado en Y1197) lo cual verifica que la interacción entre la proteína encontrada por el screening y EGFR efectivamente se da por la región correspondiente al péptido seleccionado fosforilado.

Además se puede hacer un control con anticuerpo contra Xpress para verificar que la proteína encontrada este precipitando bien.

Todo el procedimiento experimental descrito resulta en la identificación de proteínas citoplasmáticas de células humanas que interaccionan con un dominio fosforilado del receptor EGFR.

Conclusión

Mediante los protocolos y procedimientos descriptos en el trabajo, diseñamos una estrategia para generar una biblioteca de levaduras que expresan en superficie las proteínas correspondientes a los cDNAs aislados de células de carcinoma de cervix humano (HeLa). Luego identificamos por medio de selección por citometría de flujo las levaduras que, gracias a la proteína recombinante que poseían, eran capaces de unir un péptido correspondiente a una región de autofosforilación del receptor de factor de crecimiento epitelial (EGFR). Esto corresponde a un screening de la biblioteca, ya que se identifican los clones individuales que estamos buscando. Para verificar la interacción hallada, desarrollamos un ensayo de co-inmunoprecipitación, para lo cual fue necesario subclonar el cDNA de las células HeLa en vectores de expresión.

El método de "yeast display" utilizado tiene la ventaja de expresar las proteína en levaduras, lo que permite algunas modificaciones postraduccionales. Sin embargo al ser una proteína de fusión, y al secretarse la proteína al exterior es posible que no tengan sus conformaciones nativas y no puedan interaccionar normalmente. Por lo tanto el ensayo, aunque permite encontrar interacciones, no es exhaustivo y debería ser usado para generar hipótesis que luego serán verificadas por otros métodos. En este caso usamos coinmunoprecipitación.

Referencias

1. Bidlingmaier, S. Liu, B. Construction and Apllication of a Yeast Surface-displayed Human cDNA library to identify post-translational modification-dependent protein-protein interactions. Molecular and Cellular proteomics, 533-540, 2007.

2. Downward J., Parker P., Waterfield M.D. Autophosphorylation sites on the epidermal growth factor receptor. Nature 311, 483-485 (1984).

3. Ullrich,A., Coussens,L., Hayflick,J.S., Dull,T.J., Gray,A., Tam,A.W., Lee,J., Yarden,Y., Libermann,T.A., Schlessinger,J.,Downward,J., Mayes,E.L.V., Whittle,N., Waterfield,M.D. and Seeburg,P.H.. Human epidermal growth factor receptor cDNA sequence and aberrant expression of the amplified gene in A431 epidermoid carcinoma cell. Nature 309 (5967), 418-425 (1984).

Sitios visitados

-www.neb.com (New England Biolabs)

-www.invitrogen.com

-www.fermentas.com

-www.promega.com

-www.bdbiosciences.com/spectra.

– www.ncbi.nlm.nih.gov

Alan Bush y Laila Toum –