Camino de señalización de EGFR

2. Objetivo
3. Construcción de biblioteca de cDNA en humanos
4. Elección del fragmento de EGFR para hacer la interacción
5. Selección de clones positivos por citometría de flujo
6. Subclonado en vector de expresión
7. Ensayo de co-inmunoprecipitación
8. Conclusión
9. Referencias

Identificación de los componentes en el camino de señalización de EGFR mediante la construcción de una biblioteca de cDNA humana expresada en la superficie de células de levaduras (técnica de yeast display)

Introducción

Si bien las modificaciones post-traduccionales como la fosforilación, acetilación, glicosilación, agregado de grupos sulfato, entre otras, son de superlativa importancia en la regulación fina de infinidad de procesos biológicos dentro la célula, no es de menor tenor el papel desempeñado por la interacción de algunas proteínas con una o más de estas modificaciones.

Es, precisamente, para estudiar este tipo de interacciones que hoy no poseemos de una variedad amplia de técnicas que nos permita abordar con precisión este problema. Hasta el momento, entre las técnicas más utilizadas para identificar a gran escala proteínas o fragmentos de las mismas con propiedades específicas de unión encontramos al sistema del doble híbrido y al llamado phage display. No obstante, estos sistemas poseen varias limitaciones.

Por empezar, el método del doble híbrido no nos permite identificar proteínas que se unan a proteínas que se encuentren fuera de la célula o compuestos sintetizados externamente. En relación al phage display, su mayor inconveniente es la incapacidad que poseen los sistemas procariotas de llevar a cabo modificaciones post-traduccionales de proteínas eucariotas, lo que puede traer aparejado su falta de actividad biológica1.

En virtud de sortear estas dificultades que presentan estas metodologías en relación a nuestro estudio de interacción de algunas proteínas con las modificaciones post-traduccionales de otras, nos propusimos construir una biblioteca de cDNA en humanos expresada en la superficie de las células de Saccharomyces cerevisiae, estrategia llamada yeast display. Dado que los caminos de expresión de proteínas en levaduras son similares a aquellos encontrados en células de mamíferos, nos permitimos pensar que las proteínas humanas o fragmentos de las mismas expresadas en la superficie de células de levadura serán plegadas, modificadas post-traduccionalmente de modo correcto y, por tanto, serán funcionales.

Por todo lo antes expuesto, la estrategia de construcción de una biblioteca de cDNA en humanos expresada en la superficie de las células de levaduras comienza a ofrecerse como una metodología poderosa por las posibilidades que ofrece y sus múltiples aplicaciones entre las cuales encontramos la detección de proteínas que interactúen con drogas así como también la selección de ciertas proteínas con novedosas actividades enzimáticas.

Objetivo

En el presente trabajo nos proponemos identificar los componentes del camino de señalización del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) que tienen afinidad por las tirosinas fosforiladas del mismo utilizando la técnica de yeast display.