ARN de interferencia y su importancia en la biomedicina molecular (página 2)
Enviado por miguel francisco baez mota
Mecanismo
De acuerdo a su origen y función en células humanas, dos tipos de ARN pequeños disparan el mecanismo del ARNi. Por un lado, los ARN de interferencia pequeños (ARNip) y los ARN en horquilla pequeños (ARNhp), los cuales son producto del procesamiento de ARNdc largos sintetizados en laboratorio e introducidos a la célula; y por otro lado los microARN (miARN), originados de la transcripción de genes especiales localizados dentro del genoma de la propia célula y su procesamiento a partir de precursores.
Como se menciona anteriormente, los mecanismos de silenciamiento mediante ARNi fueron reconocidos en principio, o bien como mecanismo antivirales protegiendo a los organismos de virus de ARN24 o previniendo la integración azarosa de elementos transponibles.25 Sin embargo, el papel general del silenciamiento en la regulación de la expresión genética sólo se hizo aparente cuando se descubrieron los genes específicos que codificaban formas pequeñas de ARNdc en horquilla.26 Muchos de estos miARN se encuentran evolutivamente conservados y su función principal es inhibir la traducción de los ARNm.
Procesamiento de los ARNdc precursores a miARN La maduración de los ARN pequeños es un proceso gradual catalizado mediante endonucleasas de tipo ARNasa III específicas de ARNdc, llamadas Drosha y Dicer, las cuales contienen dominios catalíticos y de unión a ARNdc (Figuras 1 y 2). Drosha es requerida específicamente para el procesamiento de precursores de miARN.25 Típicamente, los miARN son derivados de largos transcritos primarios originados a partir de la ARN polimerasa II (Pol II),27 que son procesados en el núcleo28-30 mediante la ribonucleasa II Drosha junto con la proteína con dominio de unión a ARNdc, DGCR8.31 Una vez que Drosha/DGCR8 escinden en horquilla el miARN primario (pri-miARN) recién transcrito, un remanente de 2 nt OH 3" y fosfato 5" permanecen en la base del tallo.29,32 Los miARN precursores (pre-miARN) resultantes de 70 nt son entonces exportados hacia el citoplasma mediante el factor de exportación nuclear, la Exportina-5.33-35
Ya en el citoplasma, los pre-miARN son ahora procesados por Dicer.36-40 El procesamiento de los ARNdc mediante Dicer genera una molécula dúplex de ARN de 21 nt aproximadamente, es decir el miARN maduro, el cual posee de igual forma 2 nt sobresalientes.41,42 A diferencia de otros organismos, el procesamiento de los ARNdc dependiente de ATP no se ha observado en células humanas.
Ensamble en los complejos proteicos efectores de ARNi Posterior al procesamiento de los ARNdc a través de Dicer, los ARNip y los miARN ya maduros se ensamblan en grupos de partículas ribonucleoprotéicas o RNPs. Los cuales ya funcionales, contienen únicamente una sola cadena de ARNip o miARN, aquella que es homóloga o antisentido al ARNm objetivo.
Si bien, es difícil designar funciones distintivas, el complejo efector que monta en su estructura al ARNip es comúnmente referido como complejo silenciador inducido por ARN (RISC),43 mientras que el complejo efector que mantiene a un miARN se denomina complejo ribonucleoproteico (miRNP).44 Cada RISC o miRNP contiene un miembro de la familia de las proteínas Argonauta (Ago); las cuales probablemente se unen al ARN de manera directa en estos complejos, sin embargo se requiere mayor evidencia.44-47 El estimado aparente del peso molecular va de 130 a 160 kDa en el caso de RISC purificado con altas concentraciones de sal.46,48
Figura 3. Dominios estructurales de los componentes involucrados en el fenómeno del ARN de interferencia.
El ensamble de RISC y presumiblemente también el de los miRNP es dependiente de ATP,49,50 lo cual puede reflejar el requerimiento energético en el desenrollamiento de los ARNip/miARN dúplex y/o algún cambio conformacional o composicional. Como ya se mencionó, la cadena que permanece montada es la cadena antisentido del ARNip/miARN, complementaria al gen objetivo,26,51,52 propiamente su ARNm.
El ARNip/miARN de cadena sencilla (cs) que permanece en el RISC/miRNP se encuentra extremadamente unido a una proteína Ago. Concentraciones de sal tan altas como KCl 2.5 M no afectan la disociación de los ARN pequeños con la proteína Ago durante la purificación por afinidad del RISC.48 Las proteínas Ago tienen un peso molecular de alrededor de 100 kDa y poseen dos dominios conservados: PAZ y PIWI (Figura 3).53 En el humano se han determinado cuatro miembros de las Argonauta (Ago1-Ago4), las cuales se han visto asociadas con ARNip/miARN (Cuadros I y II). Sin embargo, únicamente los complejos proteicos como RISC contienen a la Ago2 en su estructura.54,55 Finalmente, los patrones y niveles de expresión diferentes de las proteínas Ago pueden controlar el grado al cual los distintos procesos de silenciamiento operan.25
Además de las proteínas centrales Ago y los ARN cortos, han sido identificados algunos otros componentes proteicos de los diferentes complejos de silenciamiento. Se han observado interacciones bioquímicas de Ago2/eIFc2c con FMRP (proteína del retraso mental frágil X).56 Así mismo, en los miARN humanos, los cuales residen en un complejo definido 15S, se ha observado la presencia de Ago4 y las ARN helicasas Gemin3 y Gemin4.44 No obstante, su función precisa de esta variedad de proteínas en el silenciamiento genético requiere de más estudios.
Degradación del ARNm y represión traduccional Los ARNipcs en RISC guían la degradación específica de secuencia de los ARNm objetivo complementarios o casi complementarios.46,48 RISC corta al ARNm a la mitad de la región complementaria, 10 nt río arriba del nucleótido emparejado con el extremo 5" del ARNip guía.41 La reacción de escisión guiada mediante RISC/miRNP es un proceso que no requiere ATP.47,50
Sin embargo, se ha observado que el silenciamiento genético resulta ser más eficiente en su presencia.47
Los complejos RISC/miRNP catalizan la hidrólisis del enlace fosfodiéster del ARNm dejando terminaciones fosfato 5" e hidroxilo 3".48,57 Esta reacción también requiere iones Mg2+, al igual que la reacción hidrolítica que ocurre cuando Dicer genera los ARNipciente para llevarse a cabo el corte hidrolítico; aunque se ha visto que puede realizarse bajo ciertas condiciones especiales.48 El mecanismo general de acción es la represión traduccional (Figura 2). La primera evidencia fue observada en C. elegans donde se demostró que los miARN específicos para un gen reducían la síntesis de proteínas sin afectar los niveles del ARNm 26 los cuales poseían en su región no traducible (UTR) 3" varios sitios de unión para el miARN, y tanto el ARNm como el miARN bloquean la elongación o terminación de la traducción, no así su iniciación.62-63
EL ARNI Y SU POTENCIAL EN LAS ENFERMEDADES HUMANAS Conocer y entender mejor el mecanismo del ARNi puede sin lugar a dudas, iluminar el oscuro camino que el ser humano transita a través de las enfermeda des mortales; afortunadamente, los resultados por demás alentadores observados hasta nuestros días, colocan una luz más a favor de la humanidad.
ARNi como tratamiento contra el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) de los ARNdc precursores.58,59 Sin embargo, dentro de los candidatos para este importante proceso puede descartarse a Dicer.46,48 La Tudor-SN caracterizada también como componente de RISC,60 puede ser rechazada como la endonucleasa en cuestión, ya que como miembro de la familia proteica de las nucleasas micrococales, debe generar terminaciones fosfato 3" en vez de fosfato 5". Recientemente se ha propuesto con base en la similitud del dominio PIWI con la ARNasa H, que las proteínas Ago pueden actuar por sí mismas como nucleasas;61 lo cual falta de confirmarse, pues únicamente Ago2 es el miembro de la familia que presenta esta propiedad.25
En el caso de los miran, su sitio de unión al ARNm sobresale por ser de una complementariedad insufiEl desarrollo y uso de dos o tres medicamentos combinados en el tratamiento de la infección causada por el VIH ha repercutido dramáticamente en el mejoramiento de la calidad de vida de los individuos contagiados. Pero, a pesar del éxito aparente de los nuevos medicamentos anti-retrovirales, existen los problemas emergentes de las variantes virales drogorresistentes así como la toxicidad en la combinación de los medicamentos administrados actualmente. Además existe el enorme interés por explorar nuevas propuestas terapéuticas antivirales. El VIH fue el primer agente infeccioso objeto del ARNi, quizá porque su ciclo de vida y patrón de expresión genética es bastante conocido. Se han utilizado ARNip y ARNhp – considerados estos últimos como la forma sintética de los miARN – como objetivo de varios ARN codificados por el VIH en líneas celulares hematopoyéticas primarias, que incluyen el elemento TAR,65 tat,66-68 rev,66,67 gag,69,70 env,70 vif,65 nef65 y la transcriptasa reversa.68
A pesar del éxito en la inhibición mediada por ARNi de los diferentes ARN virales en cultivos de células, atacar el virus de manera directa representa un reto substancial para las aplicaciones clínicas, ya que debido a su alto índice de mutación se generan variantes que pueden evitar ser tratados eficientemente.71 Quizá la regulación de los cofactores celulares requeridos para la infección del VIH sea una alternativa atractiva o una propuesta complementaria. Algunos de estos, tales como el NF-kB,68 el receptor CD4+69 y los co-receptores CXCR4 y CCR572 han sido exitosamente regulados mediante ARNi resultando en la inhibición de la replicación del VIH en numerosas líneas celulares y células primarias incluyendo linfocitos T y macrófagos derivados de células madre hematopoyéticas.65-
67,69,72-75 Aunque silenciar el NF-kB no es muy apropiado como terapia debido al importante papel que tiene en la célula (ej. repuesta del interferón), el co-receptor CCR5 se mantiene como una promesa particular. Este co-receptor no es esencial en la respuesta inmune normal, y los individuos homocigotos con una deleción de 32 pares de bases (pb) en este gen, son resistentes a la infección del VIH, mientras que los individuos que son heterocigotos para esta deleción muestran una progresión retardada al SIDA.76,77 El uso de vectores lentivirales para traducir un ARNhp anti-CCR5 en linfocitos humanos, resulta en una modesta pero significante reducción de tres a siete veces menos infección con respecto a los controles.78 Desafortunadamente estas células tratadas con ARNhp aún eran susceptibles a la infección debido a que el virus T trófico utiliza el CXCR4; además, dado que el CXCR4 es esencial para la función normal de las células madre hematopoyéticas,79 silenciar este co-receptor no es buena opción como terapia anti-VIH; mucho menos el receptor CD4.
No existe duda alguna de que los componentes virales deben ser incluidos en cualquier estrategia exitosa que utilice ARNi; así, mismo estos objetivos deben tener secuencias que se encuentren altamente conservadas para asegurar su eficacia contra todas las cepas virales.17 La forma de administración de los ARNip/ ARNhp en las células infectadas por el VIH es indiscutiblemente el otro gran reto. Las células objeto son linfocitos T primarios, monolitos y macrófagos. También debido a que los ARNip no persisten durante largos periodos de tiempo en las células, se tendría que administrar consecutivamente durante años para tratar eficazmente la infección. Hasta ahora los vectores lentivirales han sido utilizados como una de las estrategias anti-VIH más prometedoras.80-83 Probablemente en un lapso menor de tres años la tecnología del ARNi pueda comenzar a aplicarse en ensayos clínicos humanos para el tratamiento del SIDA.
ARNi en el tratamiento contra la hepatitis viral La hepatitis viral es una de las enfermedades más importantes que afectan al ser humano, ya que miles de millones de individuos están infectados en todo el mundo. Su agente etiológico puede ser el virus de la hepatitis B (VHB) y el de la hepatitis C (VHC). Actualmente contra el VHB existe una efectiva vacuna, pero ésta es sólo para prevención de la infección viral; sin embargo, en el caso del VHC no existe ninguna vacuna. Estos dos patógenos han sido prospectos muy importantes para evaluar la potencial terapia del ARNi. La primera demostración de la eficacia del ARNi contra un virus in vivo se realizó en ratones con VHB.84 En este estudio se observó una significativa reducción del 99% en la replicación viral, logrado mediante la administración de ARNhp anti-VHB en los hepatocitos proveyendo una prueba importante del principio de las futuras aplicaciones antivirales del ARNi en el hígado.
También se han realizado trabajos aplicando el ARNi como terapia contra el VHC, el cual se estima está infectando cerca del 3% de la población mundial.17
El VHC es la principal causa de enfermedades crónicas del hígado y puede dar origen a cirrosis hepática y carcinoma hapatocelular. Su genoma es una molécula de ARN con un sólo marco abierto de lectura (ORF) que codifica una poliproteina, la cual es procesada post-traduccionalmente para producir por lo menos diez proteínas. La única terapia actual disponible es una combinación del interferón con ribovirina, pero la respuesta a esta terapia es frecuentemente pobre, particularmente con ciertos tipos de virus.17
Varios grupos de investigadores han probado la eficacia de los ARNip en la inhibición del replicón del VHC.85-87 Los ARNip dirigidos contra el sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) o contra los ARNm que codifican las proteínas víricas no estructurales NS3 y NS5B inhibieron la función del replicón en células cultivadas;86 además redujeron el número de células Huh-7 con replicones VHC persistentes.85
En otro estudio in vivo se utilizaron ARNip para el tratamiento de una hepatitis fulminante inducida mediante un anticuerpo agonístico específico de Fas en ratones. Los ARNip anti-Fas fueron inyectados en los ratones tratados con anticuerpos: 82% sobrevivieron durante diez días de observación, mientras que todos los controles murieron a los 3 días.88 Cabe resaltar que los ratones que ya habían padecido de hepatitis auto-inmune también mostraron mejoría con el mismo tratamiento. Desgraciadamente trabajos en células humanas no han sido concluyentes, no obstante, estos resultados dejan ver que el uso de los ARNip para atacar las vías de la respuesta inflamatoria en vez del agente infeccioso, puede ser más accesible para tratar la enfermedad.
Al igual que el tratamiento anti-VIH, la forma de liberación o administración de los ARNip/ARNhp es el reto principal para el tratamiento exitoso del VHC. El método utilizado en varios estudios in vivo en ratones como es la inyección intravenosa hidrodinámica, no es viable para el tratamiento de la hepatitis humana. En el caso de conejos, el material genético puede ser introducido directamente a los hepatocitos a través de catéteres o inclusive por procedimientos hidrodinámicos,89 pero falta determinar si éstos pueden ser aplicados en ensayos clínicos en humanos.
ARNi en el tratamiento contra el cáncer Varios estudios han utilizado a los ARNip como herramienta para desentrañar las vías celulares que originan la proliferación celular descontrolada y el cáncer, así mismo la maquinaria del ARNi ha sido propuesta como un candidato potencial para su tratamiento.90-92 No se tienen antecedentes sobre ensayos clínicos o el uso del ARNi, únicamente se conoce del uso de agentes antisentido.93
El inconveniente principal, la liberación de los ARNip, debe ser superado a través de mecanismos altamente eficientes para su éxito en el tratamiento del cáncer. Se han desarrollado modificaciones al esqueleto de los ARNip sintéticos que les proporciona mayor resistencia a las nucleasas séricas, así como una mayor vida media en los modelos animales.94,95
Sin embargo, la estabilidad incrementada de los ARNip no es suficiente a menos que puedan penetrar en las células y tejidos in vivo a concentraciones suficientes para ser terapéuticamente funcionales. Debido a que son moléculas de doble cadena, la liberación e ingesta celular es más complicada que para los agentes antisentido de una sola cadena, los cuales se unen a las proteínas séricas y son engullidas por la células y tejidos in vivo.96 Existen pocos reportes de ARNi funcional que haya sido obtenido de la liberación sistemática de ARNip encapsulados en liposomas, pero el uso de lípidos catiónicos o iónicos para la liberación in vivo de agentes antisentido nunca se han llevado a la fase de ensayo clínico. Por lo tanto, es necesario comprender y desarrollar mejores modificaciones a los ARNip así como alternativas suficientes en la liberación sistemática de los mismos en la célula cancerosa.
El uso de ARNi para silenciar genes que expresan proteínas oncogénicas de fusión, como son las BcrAbl oncoproteína p210, características la leucemia mieloide crónica (LMC), ha dado una excelente prueba del principio de la ARNi como excelente agente anticancerígeno. En el caso de la LMC, las principales opciones de tratamiento han sido la quimioterapia, transplante de médula ósea alogénica, transplante de células totipotenciales de cordón umbilical y más recientemente, el uso de una molécula pequeña, el inhibidor de tirosina cinasa (imatinib). A pesar del entusiasmo inicial acerca del potencial de esta molécula, un número creciente de pacientes han desarrollado cierta resistencia a él,97-100 haciendo necesaria la búsqueda de fármacos alternativos de tratamiento. Las Bcr-Abl 210 han sido selectivamente reguladas tanto por ARNip sintéticos como por ARNhp transducidos en vectores lentivirales en líneas celulares.101-
103 Es importante destacar que la regulación es únicamente selectiva para la oncoproteína p210 y su ARNm, la cual resulta en la inhibición de la proliferación celular como una consecuencia directa de la acción del ARNi. Debido a que las enfermedades hematológicas son frecuentemente tratadas por medio del transplante de médula ósea, es posible desarrollar una técnica que incluya la participación del ARNi. Nuevamente la administración es el punto clave.
ARNi en el tratamiento contra la hipercolesterolemia
La hipercolesterolemia es una de las causas principales en infartos al miocardio, condición que no sólo afecta personas mayores, sino también a adultos jóvenes, los cuales forman la mayor parte de la población económicamente activa. Si bien no existen ensayos clínicos aún en seres humanos, los trabajos realizados en ratones, han demostrado resultados importantes, además de superar las expectativas de la condicionante administración.104,105 Se decidió silenciar al ARNm que codifica a la apolipoproteína B, una molécula involucrada en el metabolismo del colesterol. Las concentraciones de esta proteína en muestras de sangre humana, correlacionan con las del colesterol y los niveles elevados de ambos compuestos están asociados con un riesgo elevado de enfermedades coronarias.
Los ARNip que se sintetizaron para este propósito contenían modificaciones de estabilización selectivas que los hacía unirse a un grupo colesterol, ligado químicamente al grupo hidroxilo terminal de la cadena con sentido del ARN. Las inyecciones intravenosas de los conjugados de ARNip–colesterol en los ratones, se efectuaron en diversos tejidos incluyendo el hígado, yeyuno, corazón, riñones, pulmones y tejido graso. Muy importante fue la eficiencia de los ARNip al reducir los niveles del ARNm que codifica para la apolipoproteína B en más del 50% en hígado y 70% en yeyuno.106
Lo extraordinario de estos resultados, tal vez sea, debido a la sencillez, el método de administración; pues el sistema no requiere lípidos complejos caros u otras macromoléculas. El uso del colesterol mismo ayuda a la célula a ingerir a los ARNip y liberarlos en su interior. Nuevamente se deja entrever que el uso del ARNi en moléculas que interfieran con la vía molecular del objetivo (en este caso la apolipoproteína B y el colesterol) también es capaz de producir los efectos deseados.
Finalmente, en un lapso muy corto y productivo desde su descubrimiento en organismos modelo, el mecanismo del ARNi ha surgido como una herramienta poderosa en el estudio de la función genética en mamíferos. Como un evento importante surge su uso en organismos completos desde un enfoque terapéutico, donde los primeros frutos comienzan a cosecharse. Quizá el principal reto a vencer a corto plazo es el problema de su administración in vivo en ensayos clínicos en seres humanos; después, la comercialización del primer medicamento basado en el ARNi. Más importante será conocer si el fenómeno del ARNi podrá revolucionar el tratamiento de las enfermedades humanas de la misma forma que ha revolucionado la investigación básica de la función genética en el vasto mundo de la Biología.
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Autor:
Jorge Luis Hernández García.
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