ARN de interferencia y su importancia en la biomedicina molecular (página 2)

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Mecanismo

De acuerdo a su origen y función en células humanas, dos tipos de ARN pequeños disparan el mecanismo del ARNi. Por un lado, los ARN de interferencia pequeños (ARNip) y los ARN en horquilla pequeños (ARNhp), los cuales son producto del procesamiento de ARNdc largos sintetizados en laboratorio e introducidos a la célula; y por otro lado los microARN (miARN), originados de la transcripción de genes especiales localizados dentro del genoma de la propia célula y su procesamiento a partir de precursores.

Como se menciona anteriormente, los mecanismos de silenciamiento mediante ARNi fueron reconocidos en principio, o bien como mecanismo antivirales protegiendo a los organismos de virus de ARN24 o previniendo la integración azarosa de elementos transponibles.25 Sin embargo, el papel general del silenciamiento en la regulación de la expresión genética sólo se hizo aparente cuando se descubrieron los genes específicos que codificaban formas pequeñas de ARNdc en horquilla.26 Muchos de estos miARN se encuentran evolutivamente conservados y su función principal es inhibir la traducción de los ARNm.

Procesamiento de los ARNdc precursores a miARN La maduración de los ARN pequeños es un proceso gradual catalizado mediante endonucleasas de tipo ARNasa III específicas de ARNdc, llamadas Drosha y Dicer, las cuales contienen dominios catalíticos y de unión a ARNdc (Figuras 1 y 2). Drosha es requerida específicamente para el procesamiento de precursores de miARN.25 Típicamente, los miARN son derivados de largos transcritos primarios originados a partir de la ARN polimerasa II (Pol II),27 que son procesados en el núcleo28-30 mediante la ribonucleasa II Drosha junto con la proteína con dominio de unión a ARNdc, DGCR8.31 Una vez que Drosha/DGCR8 escinden en horquilla el miARN primario (pri-miARN) recién transcrito, un remanente de 2 nt OH 3" y fosfato 5" permanecen en la base del tallo.29,32 Los miARN precursores (pre-miARN) resultantes de 70 nt son entonces exportados hacia el citoplasma mediante el factor de exportación nuclear, la Exportina-5.33-35

Ya en el citoplasma, los pre-miARN son ahora procesados por Dicer.36-40 El procesamiento de los ARNdc mediante Dicer genera una molécula dúplex de ARN de 21 nt aproximadamente, es decir el miARN maduro, el cual posee de igual forma 2 nt sobresalientes.41,42 A diferencia de otros organismos, el procesamiento de los ARNdc dependiente de ATP no se ha observado en células humanas.

Ensamble en los complejos proteicos efectores de ARNi Posterior al procesamiento de los ARNdc a través de Dicer, los ARNip y los miARN ya maduros se ensamblan en grupos de partículas ribonucleoprotéicas o RNPs. Los cuales ya funcionales, contienen únicamente una sola cadena de ARNip o miARN, aquella que es homóloga o antisentido al ARNm objetivo.

Si bien, es difícil designar funciones distintivas, el complejo efector que monta en su estructura al ARNip es comúnmente referido como complejo silenciador inducido por ARN (RISC),43 mientras que el complejo efector que mantiene a un miARN se denomina complejo ribonucleoproteico (miRNP).44 Cada RISC o miRNP contiene un miembro de la familia de las proteínas Argonauta (Ago); las cuales probablemente se unen al ARN de manera directa en estos complejos, sin embargo se requiere mayor evidencia.44-47 El estimado aparente del peso molecular va de 130 a 160 kDa en el caso de RISC purificado con altas concentraciones de sal.46,48

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Figura 3. Dominios estructurales de los componentes involucrados en el fenómeno del ARN de interferencia.

El ensamble de RISC y presumiblemente también el de los miRNP es dependiente de ATP,49,50 lo cual puede reflejar el requerimiento energético en el desenrollamiento de los ARNip/miARN dúplex y/o algún cambio conformacional o composicional. Como ya se mencionó, la cadena que permanece montada es la cadena antisentido del ARNip/miARN, complementaria al gen objetivo,26,51,52 propiamente su ARNm.

El ARNip/miARN de cadena sencilla (cs) que permanece en el RISC/miRNP se encuentra extremadamente unido a una proteína Ago. Concentraciones de sal tan altas como KCl 2.5 M no afectan la disociación de los ARN pequeños con la proteína Ago durante la purificación por afinidad del RISC.48 Las proteínas Ago tienen un peso molecular de alrededor de 100 kDa y poseen dos dominios conservados: PAZ y PIWI (Figura 3).53 En el humano se han determinado cuatro miembros de las Argonauta (Ago1-Ago4), las cuales se han visto asociadas con ARNip/miARN (Cuadros I y II). Sin embargo, únicamente los complejos proteicos como RISC contienen a la Ago2 en su estructura.54,55 Finalmente, los patrones y niveles de expresión diferentes de las proteínas Ago pueden controlar el grado al cual los distintos procesos de silenciamiento operan.25

Además de las proteínas centrales Ago y los ARN cortos, han sido identificados algunos otros componentes proteicos de los diferentes complejos de silenciamiento. Se han observado interacciones bioquímicas de Ago2/eIFc2c con FMRP (proteína del retraso mental frágil X).56 Así mismo, en los miARN humanos, los cuales residen en un complejo definido 15S, se ha observado la presencia de Ago4 y las ARN helicasas Gemin3 y Gemin4.44 No obstante, su función precisa de esta variedad de proteínas en el silenciamiento genético requiere de más estudios.

Degradación del ARNm y represión traduccional Los ARNipcs en RISC guían la degradación específica de secuencia de los ARNm objetivo complementarios o casi complementarios.46,48 RISC corta al ARNm a la mitad de la región complementaria, 10 nt río arriba del nucleótido emparejado con el extremo 5" del ARNip guía.41 La reacción de escisión guiada mediante RISC/miRNP es un proceso que no requiere ATP.47,50

Sin embargo, se ha observado que el silenciamiento genético resulta ser más eficiente en su presencia.47

Los complejos RISC/miRNP catalizan la hidrólisis del enlace fosfodiéster del ARNm dejando terminaciones fosfato 5" e hidroxilo 3".48,57 Esta reacción también requiere iones Mg2+, al igual que la reacción hidrolítica que ocurre cuando Dicer genera los ARNipciente para llevarse a cabo el corte hidrolítico; aunque se ha visto que puede realizarse bajo ciertas condiciones especiales.48 El mecanismo general de acción es la represión traduccional (Figura 2). La primera evidencia fue observada en C. elegans donde se demostró que los miARN específicos para un gen reducían la síntesis de proteínas sin afectar los niveles del ARNm 26 los cuales poseían en su región no traducible (UTR) 3" varios sitios de unión para el miARN, y tanto el ARNm como el miARN bloquean la elongación o terminación de la traducción, no así su iniciación.62-63

EL ARNI Y SU POTENCIAL EN LAS ENFERMEDADES HUMANAS Conocer y entender mejor el mecanismo del ARNi puede sin lugar a dudas, iluminar el oscuro camino que el ser humano transita a través de las enfermeda des mortales; afortunadamente, los resultados por demás alentadores observados hasta nuestros días, colocan una luz más a favor de la humanidad.

ARNi como tratamiento contra el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) de los ARNdc precursores.58,59 Sin embargo, dentro de los candidatos para este importante proceso puede descartarse a Dicer.46,48 La Tudor-SN caracterizada también como componente de RISC,60 puede ser rechazada como la endonucleasa en cuestión, ya que como miembro de la familia proteica de las nucleasas micrococales, debe generar terminaciones fosfato 3" en vez de fosfato 5". Recientemente se ha propuesto con base en la similitud del dominio PIWI con la ARNasa H, que las proteínas Ago pueden actuar por sí mismas como nucleasas;61 lo cual falta de confirmarse, pues únicamente Ago2 es el miembro de la familia que presenta esta propiedad.25

En el caso de los miran, su sitio de unión al ARNm sobresale por ser de una complementariedad insufiEl desarrollo y uso de dos o tres medicamentos combinados en el tratamiento de la infección causada por el VIH ha repercutido dramáticamente en el mejoramiento de la calidad de vida de los individuos contagiados. Pero, a pesar del éxito aparente de los nuevos medicamentos anti-retrovirales, existen los problemas emergentes de las variantes virales drogorresistentes así como la toxicidad en la combinación de los medicamentos administrados actualmente. Además existe el enorme interés por explorar nuevas propuestas terapéuticas antivirales. El VIH fue el primer agente infeccioso objeto del ARNi, quizá porque su ciclo de vida y patrón de expresión genética es bastante conocido. Se han utilizado ARNip y ARNhp – considerados estos últimos como la forma sintética de los miARN – como objetivo de varios ARN codificados por el VIH en líneas celulares hematopoyéticas primarias, que incluyen el elemento TAR,65 tat,66-68 rev,66,67 gag,69,70 env,70 vif,65 nef65 y la transcriptasa reversa.68

A pesar del éxito en la inhibición mediada por ARNi de los diferentes ARN virales en cultivos de células, atacar el virus de manera directa representa un reto substancial para las aplicaciones clínicas, ya que debido a su alto índice de mutación se generan variantes que pueden evitar ser tratados eficientemente.71 Quizá la regulación de los cofactores celulares requeridos para la infección del VIH sea una alternativa atractiva o una propuesta complementaria. Algunos de estos, tales como el NF-kB,68 el receptor CD4+69 y los co-receptores CXCR4 y CCR572 han sido exitosamente regulados mediante ARNi resultando en la inhibición de la replicación del VIH en numerosas líneas celulares y células primarias incluyendo linfocitos T y macrófagos derivados de células madre hematopoyéticas.65-

67,69,72-75 Aunque silenciar el NF-kB no es muy apropiado como terapia debido al importante papel que tiene en la célula (ej. repuesta del interferón), el co-receptor CCR5 se mantiene como una promesa particular. Este co-receptor no es esencial en la respuesta inmune normal, y los individuos homocigotos con una deleción de 32 pares de bases (pb) en este gen, son resistentes a la infección del VIH, mientras que los individuos que son heterocigotos para esta deleción muestran una progresión retardada al SIDA.76,77 El uso de vectores lentivirales para traducir un ARNhp anti-CCR5 en linfocitos humanos, resulta en una modesta pero significante reducción de tres a siete veces menos infección con respecto a los controles.78 Desafortunadamente estas células tratadas con ARNhp aún eran susceptibles a la infección debido a que el virus T trófico utiliza el CXCR4; además, dado que el CXCR4 es esencial para la función normal de las células madre hematopoyéticas,79 silenciar este co-receptor no es buena opción como terapia anti-VIH; mucho menos el receptor CD4.

No existe duda alguna de que los componentes virales deben ser incluidos en cualquier estrategia exitosa que utilice ARNi; así, mismo estos objetivos deben tener secuencias que se encuentren altamente conservadas para asegurar su eficacia contra todas las cepas virales.17 La forma de administración de los ARNip/ ARNhp en las células infectadas por el VIH es indiscutiblemente el otro gran reto. Las células objeto son linfocitos T primarios, monolitos y macrófagos. También debido a que los ARNip no persisten durante largos periodos de tiempo en las células, se tendría que administrar consecutivamente durante años para tratar eficazmente la infección. Hasta ahora los vectores lentivirales han sido utilizados como una de las estrategias anti-VIH más prometedoras.80-83 Probablemente en un lapso menor de tres años la tecnología del ARNi pueda comenzar a aplicarse en ensayos clínicos humanos para el tratamiento del SIDA.

ARNi en el tratamiento contra la hepatitis viral La hepatitis viral es una de las enfermedades más importantes que afectan al ser humano, ya que miles de millones de individuos están infectados en todo el mundo. Su agente etiológico puede ser el virus de la hepatitis B (VHB) y el de la hepatitis C (VHC). Actualmente contra el VHB existe una efectiva vacuna, pero ésta es sólo para prevención de la infección viral; sin embargo, en el caso del VHC no existe ninguna vacuna. Estos dos patógenos han sido prospectos muy importantes para evaluar la potencial terapia del ARNi. La primera demostración de la eficacia del ARNi contra un virus in vivo se realizó en ratones con VHB.84 En este estudio se observó una significativa reducción del 99% en la replicación viral, logrado mediante la administración de ARNhp anti-VHB en los hepatocitos proveyendo una prueba importante del principio de las futuras aplicaciones antivirales del ARNi en el hígado.

También se han realizado trabajos aplicando el ARNi como terapia contra el VHC, el cual se estima está infectando cerca del 3% de la población mundial.17

El VHC es la principal causa de enfermedades crónicas del hígado y puede dar origen a cirrosis hepática y carcinoma hapatocelular. Su genoma es una molécula de ARN con un sólo marco abierto de lectura (ORF) que codifica una poliproteina, la cual es procesada post-traduccionalmente para producir por lo menos diez proteínas. La única terapia actual disponible es una combinación del interferón con ribovirina, pero la respuesta a esta terapia es frecuentemente pobre, particularmente con ciertos tipos de virus.17

Varios grupos de investigadores han probado la eficacia de los ARNip en la inhibición del replicón del VHC.85-87 Los ARNip dirigidos contra el sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) o contra los ARNm que codifican las proteínas víricas no estructurales NS3 y NS5B inhibieron la función del replicón en células cultivadas;86 además redujeron el número de células Huh-7 con replicones VHC persistentes.85

En otro estudio in vivo se utilizaron ARNip para el tratamiento de una hepatitis fulminante inducida mediante un anticuerpo agonístico específico de Fas en ratones. Los ARNip anti-Fas fueron inyectados en los ratones tratados con anticuerpos: 82% sobrevivieron durante diez días de observación, mientras que todos los controles murieron a los 3 días.88 Cabe resaltar que los ratones que ya habían padecido de hepatitis auto-inmune también mostraron mejoría con el mismo tratamiento. Desgraciadamente trabajos en células humanas no han sido concluyentes, no obstante, estos resultados dejan ver que el uso de los ARNip para atacar las vías de la respuesta inflamatoria en vez del agente infeccioso, puede ser más accesible para tratar la enfermedad.

Al igual que el tratamiento anti-VIH, la forma de liberación o administración de los ARNip/ARNhp es el reto principal para el tratamiento exitoso del VHC. El método utilizado en varios estudios in vivo en ratones como es la inyección intravenosa hidrodinámica, no es viable para el tratamiento de la hepatitis humana. En el caso de conejos, el material genético puede ser introducido directamente a los hepatocitos a través de catéteres o inclusive por procedimientos hidrodinámicos,89 pero falta determinar si éstos pueden ser aplicados en ensayos clínicos en humanos.

ARNi en el tratamiento contra el cáncer Varios estudios han utilizado a los ARNip como herramienta para desentrañar las vías celulares que originan la proliferación celular descontrolada y el cáncer, así mismo la maquinaria del ARNi ha sido propuesta como un candidato potencial para su tratamiento.90-92 No se tienen antecedentes sobre ensayos clínicos o el uso del ARNi, únicamente se conoce del uso de agentes antisentido.93

El inconveniente principal, la liberación de los ARNip, debe ser superado a través de mecanismos altamente eficientes para su éxito en el tratamiento del cáncer. Se han desarrollado modificaciones al esqueleto de los ARNip sintéticos que les proporciona mayor resistencia a las nucleasas séricas, así como una mayor vida media en los modelos animales.94,95

Sin embargo, la estabilidad incrementada de los ARNip no es suficiente a menos que puedan penetrar en las células y tejidos in vivo a concentraciones suficientes para ser terapéuticamente funcionales. Debido a que son moléculas de doble cadena, la liberación e ingesta celular es más complicada que para los agentes antisentido de una sola cadena, los cuales se unen a las proteínas séricas y son engullidas por la células y tejidos in vivo.96 Existen pocos reportes de ARNi funcional que haya sido obtenido de la liberación sistemática de ARNip encapsulados en liposomas, pero el uso de lípidos catiónicos o iónicos para la liberación in vivo de agentes antisentido nunca se han llevado a la fase de ensayo clínico. Por lo tanto, es necesario comprender y desarrollar mejores modificaciones a los ARNip así como alternativas suficientes en la liberación sistemática de los mismos en la célula cancerosa.

El uso de ARNi para silenciar genes que expresan proteínas oncogénicas de fusión, como son las BcrAbl oncoproteína p210, características la leucemia mieloide crónica (LMC), ha dado una excelente prueba del principio de la ARNi como excelente agente anticancerígeno. En el caso de la LMC, las principales opciones de tratamiento han sido la quimioterapia, transplante de médula ósea alogénica, transplante de células totipotenciales de cordón umbilical y más recientemente, el uso de una molécula pequeña, el inhibidor de tirosina cinasa (imatinib). A pesar del entusiasmo inicial acerca del potencial de esta molécula, un número creciente de pacientes han desarrollado cierta resistencia a él,97-100 haciendo necesaria la búsqueda de fármacos alternativos de tratamiento. Las Bcr-Abl 210 han sido selectivamente reguladas tanto por ARNip sintéticos como por ARNhp transducidos en vectores lentivirales en líneas celulares.101-

103 Es importante destacar que la regulación es únicamente selectiva para la oncoproteína p210 y su ARNm, la cual resulta en la inhibición de la proliferación celular como una consecuencia directa de la acción del ARNi. Debido a que las enfermedades hematológicas son frecuentemente tratadas por medio del transplante de médula ósea, es posible desarrollar una técnica que incluya la participación del ARNi. Nuevamente la administración es el punto clave.

ARNi en el tratamiento contra la hipercolesterolemia

La hipercolesterolemia es una de las causas principales en infartos al miocardio, condición que no sólo afecta personas mayores, sino también a adultos jóvenes, los cuales forman la mayor parte de la población económicamente activa. Si bien no existen ensayos clínicos aún en seres humanos, los trabajos realizados en ratones, han demostrado resultados importantes, además de superar las expectativas de la condicionante administración.104,105 Se decidió silenciar al ARNm que codifica a la apolipoproteína B, una molécula involucrada en el metabolismo del colesterol. Las concentraciones de esta proteína en muestras de sangre humana, correlacionan con las del colesterol y los niveles elevados de ambos compuestos están asociados con un riesgo elevado de enfermedades coronarias.

Los ARNip que se sintetizaron para este propósito contenían modificaciones de estabilización selectivas que los hacía unirse a un grupo colesterol, ligado químicamente al grupo hidroxilo terminal de la cadena con sentido del ARN. Las inyecciones intravenosas de los conjugados de ARNip–colesterol en los ratones, se efectuaron en diversos tejidos incluyendo el hígado, yeyuno, corazón, riñones, pulmones y tejido graso. Muy importante fue la eficiencia de los ARNip al reducir los niveles del ARNm que codifica para la apolipoproteína B en más del 50% en hígado y 70% en yeyuno.106

Lo extraordinario de estos resultados, tal vez sea, debido a la sencillez, el método de administración; pues el sistema no requiere lípidos complejos caros u otras macromoléculas. El uso del colesterol mismo ayuda a la célula a ingerir a los ARNip y liberarlos en su interior. Nuevamente se deja entrever que el uso del ARNi en moléculas que interfieran con la vía molecular del objetivo (en este caso la apolipoproteína B y el colesterol) también es capaz de producir los efectos deseados.

Finalmente, en un lapso muy corto y productivo desde su descubrimiento en organismos modelo, el mecanismo del ARNi ha surgido como una herramienta poderosa en el estudio de la función genética en mamíferos. Como un evento importante surge su uso en organismos completos desde un enfoque terapéutico, donde los primeros frutos comienzan a cosecharse. Quizá el principal reto a vencer a corto plazo es el problema de su administración in vivo en ensayos clínicos en seres humanos; después, la comercialización del primer medicamento basado en el ARNi. Más importante será conocer si el fenómeno del ARNi podrá revolucionar el tratamiento de las enfermedades humanas de la misma forma que ha revolucionado la investigación básica de la función genética en el vasto mundo de la Biología.

Referencias

1. Baulcombe D. RNA silencing in plants. Nature 2004; 431: 356-363.

2. Novina CD, Sharp PA. The RNAi revolution. Nature 2004; 430: 161-164.

3. Dykxhoorn DM, Novina CD, Sharp PA. Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression. Nat Rev Mol Cell Biol 2003; 4: 457-467.

4. Jorgensen R. Altered gene expression in plants due to trans interactions between homologous genes. Trends Biotechnol 1990; 8: 340-344.

5. Napoli CA, Lemieux C, Jogersen R. Introduction of a chimeric chalcone synthetase gene in Petunia results in reversible cosuppression of homologous genes in trans. Plant Cell 1990; 2: 291-299.

6. van der Krol AR, Mur LA, Beld M, Mol JNM, Stuitje A. Flavonoid genes in Petunia: addition of a limited number of gene copies may lead to a suppression of gene expression. Plant Cell 1990; 2: 291-299.

7. Lau NC, Bartel DP. Censors of the genome. Sci Am 2003; 8: 34-41.

8. Hammond SM, Caudy AA, Hannon GJ. Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA. Nat Rev Genet 2001; 2: 110-119.

9. Romano N, Macino G. Quelling: trasient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by transformation with homologues sequences. Mol Microbiol 1992; 6: 3343-3356.

10. Tijisterman M, Ketting RF, Plasterk RH. The genetics of RNA silencing. Annu Rev Genet 2002; 36: 489-512.

11. Ullu E, Tschudi C, Chakraborty T. RNA interference in protozoan parasities. Cell Microbiol 2004; 6: 509-519.

12. Hannon GJ. RNA interference. Nature 2002; 418: 244-251.

13. Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 1998; 391: 806-811.

14. Fire A, Albertson D, Harrison SW, Moerman DG. Production of antisense RNA leads to effective and specific inhibition of gene expression in C. elegans muscle. Development 1991; 113: 503-514.

15. Guo S, Kemphues KJ. par-1, a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymetrically distributed. Cell 1995; 81: 611-620.

16. Grishok A, Tabara H, Mello CC. Genetic requeriments for inheritance of RNAi in C. elegans. Science 2000; 287: 2494-2497.

17. Hannon GJ, Rossi JJ. Unlocking the potential of the human genome with RNA interference. Nature 2004; 431: 371-378.

18. Bonetta L. RNAi: Silencing never sounded better. Nat Methods 2004; 1: 79-85.

19. Williams RB. Role of the double-stranded RNA activatedprotein kinase (PKR) in cell regulation. Biochem Soc Trans 1997; 25: 509-513.

20. Stark GR, Kerr IM, Williams BR, Silverman RH, Schreiber RD. How cells respond to interferons. Annu Rev Biochem 1998; 67: 227-264.

21. ElbashirSM, Hartborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T. Duplexes of 21-nucleotides RNAs mediated RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 2001; 411: 494-498.

22. Kim DH, Belkhe MA, Rose SD, Chang MS, Choi S, Rossi JJ. Synthetic dsRNA Dicer substrates enhance RNAi potency and eficacy. Nat Biotechnol 2005; 23: 222 226.

23. Siolas D, Lerner C, Burchard J, Ge W, Linsley PS, Paddison PJ, et al. Synthetic shRNAs as potent RNAi triggers. Nat Biotechnol 2005; 23: 227-231.

24. Waterhouse PM, Wong MB, Lough T. Gene silencing as an adaptative defence against viruses. Nature 2001; 411: 834-842.

25. Meister G, Tuschl T. Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA. Nature 2004; 431: 343-349.

26. Bartel DP. MicroRNA: genomics, biogenesis, mechanism and function. Cell 2004; 116: 281-297.

27. Lee Y, Kim M, Han J, Yeom KH, Lee S, Baek SH, et al. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO J 2004; 23: 4051-4060.

28. Lee Y, Jean K, Lee J, Kim S, Kim VN. MicroRNA maturation: stepwise processing and subcellular localization. EMBO J 2002; 21: 4663-4670.

29. Lee Y, Ahn C, Han J, Choi H, Kim J, Yim J, et al. The nuclear RNase III Drosha initiates microRNA processing. Nature 2003; 425: 415-419.

30. Pfeffer S, Sewer A, Lagos-Quintana M, Sheridan R, Sader C, Gróisser FA, et al. Identification of microRNAs of the herpesvirus family. Nat Methods 2005; 2: 269-276.

31. Tomari Y, Zamore PD. MicroRNA biogenesis: Drosha can"t cut it withouth a partner. Curr Biol 2005; 15: R61-R64.

32. Basyuk E, Suavet F, Doglio A, Bordonne R, Bertrond E. Human let-7 stem-loop precursors harbor features of RNase III cleavage products. Nucleic Acids Res 2003; 31: 6593-6597.

33. Bohnsack MT, Czaplinski K, Görlich D. Exportin 5 is a RanGTP-dependent dsRNA-binding protein that mediates nuclear sport of pre-miRNAs. RNA 2004; 10: 185-191.

34. Lund E, Guttinger S, Calado A, Dahlberg JE, Kutay U. Nuclear export of microRNA precursors. Science 2004; 303: 95-98.

35. Yi R, Qin Y, Macara IG, Cullen RB. Exportin-5 mediates the nuclear exports of pre-microRNAs and short hairpins RNAs. Genes Dev 2003; 17: 3011-3016.

36. Hutvánger G, McLachlan J, Bálint E, Tuschl T, Zamore PD. A celular function for the RNA interference enzyme Dicer in small temporal RNA maturation. Science 2001; 93: 834-838.

37. Grishok A, Pasquinelli AE, Conte D, Li N, Parrish S, Ha I, et al. Genes and mechanisms related to RNA interference regulate expression of the small temporal RNAs that control C. elegans developmental timing. Cell 2001; 106: 23-34.

38. Lee YS, Nakahara K, Pham JW, Kim K, He Z, Sontheimer EJ, et al. Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways. Cell 2004; 117: 69-81.

39. Xie Z, Johansen LK, Gustafson AM, Kasschau KD, Lellis AD, Zilberman Z, et al. Genetic and functional diversification of small RNA pathways in plants. PLoS Biol 2004; 2: E104.

40. Berstein E, Caudy AA, Hammond SM, Hannon GJ. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature 2001; 409: 363-366.

41. Elbashir SM, Lendeckel W, Tuschl T. RNA interference is mediated by 21 and 22 nt RNAs. Genes Dev 2001; 15: 188-200.

42. Chiu YL, Rana TM. RNAi in human cells: basic structural and functional features of small interfering RNA. Mol Cell 2002; 10: 549-561.

43. Hammond SM, Berstein E, Beach D, Hannon GJ. An RNA-directed nuclease mediates post-tanscriptional gene silencing in Drosophila cells. Nature 2000; 404: 293-296.

44. Mourelatos Z, Dostie J, Paushkin S, Sharma A, Charroux B, Abel L, et al. miRNPs: a novel class of ribonucleoproteins containing numerous microRNAs. Genes Dev 2002; 16: 720-728.

45. Hammond SM, Boettcher S, Caudy AA, Kobayashi R, Hannon GJ. Argonaute2, a link between genetic and biochemical analyses of RNAi. Science 2001; 193: 1146-1150.

46. Martínez J, Patkaniowska A, Urlaub H, Lührmann R, Tuschl T. Single-stranded antisense siRNAs guide target RNA cleavage in RNAi. Cell 2002; 110: 563-574.

47. Hutvágner G, Zamore PD. A microRNA in a multiple turnover RNAi enzyme complex. Science 2002; 297: 2056-2060.

48. Martínez J, Tuschl T. RISC a 5"phospho monoester-producing RNA endonuclease. Genes Dev 2004; 18: 975-980.

49. Pham JW, Pellino JL, Lee YS, Carthew RW, Sontheimer EJ. A Dicer-2-dependent 80S complex cleaves trageted mRNAs during RNAi in Drosophila. Cell 2004; 117: 83-94.

50. Nykänen A, Haley B, Zamore PD. ATP requeriments and small interfering RNA structure in the RNAi pathway. Cell 2001; 107: 309-321.

51. Khvorova A, Reynolds A, Jayasena SD. Functional siRNA and miRNA exhibit strand bias. Cell 2003; 115: 209-216.

52. Schwarz DS, Hutvágner G, Du T, Xu Z, Aronin N, Zamore PD. Assymetry in the assembly of the RNAi enzyme complex. Cell 2003; 115: 199-208.

53. Cornell MA, Xuan Z, Zhang MQ, Hannon GJ. The Argonaute family: tentacles that reach into RNAi, developmental control, stem-cell maintenance, and tumorigenesis. Genes Dev 2002; 16: 2733-2742.

54. Meister G, Landthaler M, Patkaniowska A, Dorsett Y, Teng G, Thomas Tuschl T. Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs. Mol Cell 2004; 15: 185-197.

55. Liu J, Carmell LA, Rivas FV, Marsden CG, Thomson JM, Song JJ, et al. Argonaute2 is the catalytic engine of mammalian RNAi. Science 2004; 305: 1437-1441.

56. Jin P, Zarnescu DC, Ceman S, Nakamoto M, Mowrey J, Jongens TA, et al. Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway. Nature Neurosci 2004; 7: 113-117.

57. Schwarz DS, Tomari Y, Zamore PD. The RNA induced silencing complex is a Mg2+ dependent endonuclease. Curr Biol 2004; 14: 787-791.

58. Provost P, Dishart D, Doucet J, Frendewey D, Samuelsson B, Ràdmark O. Ribonuclease activity and RNA binding of recombinant human Dicer. EMBO J 2002; 21: 5864-5874.

59. Zhang H, Kolb FA, Brondani V, Billy E, Filipowicz W. Human Dicer preferentially cleaves dsRNAs at their termini without a requeriment for ATP. EMBO J 2002; 21: 5875-5885.

60. Caudy AA, Ketting RF, Hammond SM, Denli AM, Bathoorn AM, Tops BBJ, et al. A microccocal nuclease homologue in RNAi effector complexes. Nature 2003; 425: 411-414.

61. Ma JB, Ye K, Patel DJ. Structural basis for overhang-specific small interfering RNA recognition by the PAZ domain. Nature 2004; 429: 318-322.

62. Olsen PH, Ambros V. The lin-4 regulatory RNA controls developmental timing in Caenorhabditis elegans by blocking LIN-14 protein synthesis after initiation of translation. Dev Biol 1999; 216: 671-680.

63. Seggerson K, Tang L, Moss EG. Two genetic circuits repress the Caenorhabditis elegans heterochronic gene lin-

28 after translation initiation. Dev Biol 2002; 243: 215-225.

64. Kim J, Krichevsky A, Grad Y, Hayes GD, Kosik KS, Church GM, et al. Identification of many microRNAs that copurify with polyribosomes in mammalian neurons. Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101: 360-365.

65. Jaque JM, Triques K, Stevenson M. Modulation of HIV-1 replication by RNA interference. Nature 2002; 418: 435-438.

66. Lee NS, Dohjima D, Bauer G, Li H, Li MJ, Ehsani A, et al. Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells. Nat Biotechnol 2002; 20: 500-505.

67. Coburn GA, Cullen BR. Potent and specific inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication by RNA interference. J Virol 2002; 76: 9225-9231.

68. Surabhi RM, Gaynor RB. RNA interference directed against human immunodeficency virus type-1 replication. J Virol 2002; 76: 12963-12973.

69. Novina CD, Murray MF, Dykxhoorn DM, Beresford PJ, Riess J, Lee SK, et al. siRNA-directed inhibition of HIV-1 infection. Nature Med 2002; 8: 681-686.

70. Park WS, Miyano-Kurosaki N, Hayafune M, Nakajima E, Matsuzaki T, Shimada F, et al. Prevention of HIV-1 infection in human peripheral blood mononuclear cells by specific RNA interference. Nucleic Acids Res 2002; 30: 4830-

4835.

71. Boden D, Pusch O, Lee F, Tucker L, Ramratnam B. Human immunodeficiency virus type-1 escape from RNA interference. J Virol 2003; 77: 11531-11535.

72. Martínez MA, Gutíerrez A, Armand-Ugón A, Blanco J, Parera M, Gómez J, et al. Supression of chemokine receptor expressionby RNA interference allows for inhibition of HIV-1 replication. AIDS 2002; 16: 2385-2390.

73. Capodici J, Kariko K, Weissman D. Inhibition of HIV infection by small interfering RNA-mediated RNA interference. J Immunol 2002; 169: 5196-5201.

74. Banerjea A, Li MJ, Bauer G, Remling L, Lee NS, Rossi J, et al. Inhibition of HIV-1 infection by lentiviral vectortransduced siRNAs in T lymphocytes differentiated in SCID-humice and CD34+ progenitor cell-derived macrophages. Mol Ther 2003; 8: 62-71.

75. Li MJ, Bauer G, Michienzi A, Yee JK, Lee NS, Kim J, et al.

Inhibition of HIV-1 infection by lentiviral vectors expressing Pol III-promoted anti-HIV RNAs. Mol Ther 2003; 8:

196-206.

76. Eugen-Olsen J, Iversen AKN, Garred P, Koppelhus U, Pedersen C, Benfield TL, et al. Heterozygocity for a deletion in the CKR-5 gene leads to prolonged AIDS-free survival and slower CD4 T cell-decline in a cohort of HIV-seropositive individuals. AIDS 1997; 11: 305-310.

77. Samson M, Libert F, Doranz BJ, Rucker J, Liesnard C, Farber CM, et al. Resistance to HIV-1 infection in caucasian individuals bearing mutant alleles of the CCR-5 chemokine receptor gene. Nature 1996; 382: 722-725.

78. Qin XF, An DS, Chen IS, Batimore D. Inhibiting HIV-1 in-

fection in human T cells by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against-CCR5. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100: 183-188.

79. Dell"Agnolo C, Rabascio C, Mancuso P, Capillo M, Pruneri G, Gobbi A, et al. In vitro and in vivo hematopoietic potential of human stem cells residing in muscle tissue. Exp Hematol 2002; 30: 905-914.

80. Dropulic B. Lentivirus in the clinic. Mol Ther 2001; 4:

511-512.

81. Davis BM, Humeau L, Dropulic B. In vivo selection for human and murine hematopoietic cells transduced with a therapeutic MGMT lentiviral vector that inhibits HIV replication. Mol Ther 2004; 9: 160-172.

82. Amado RG, Mitsuyasu RT, Rosenblatt JC, Ngok FK, Bakker A, Cole S, et al. Anti-human immunodeficiency virus hematopoietic progenitor cell-derived ribozyme in a phase I study: myeloid and lymphoid reconstitution in human immunodeficiency virus type-1-infected patients. Hum Gen Ther 2004; 15: 251-262.

83. Michienzi A, Castanotto D, Lee N, Li S, Zaia JA, Rossi JJ.

RNA-mediated inhibition of HIV in a gene therapy setting.

Ann NY Acad Sci 2003; 1002: 63-71.

84. McCaffrey AP, Nakai H, Pandey K, Huang Z, Salazar FH, Xu H, et al. Inhibition of hepatitis virus B by RNA interference. Nature Biotechnol 2003; 6: 639-644.

85. Randall G, Grakovi A, Rice CM. Clearance of replicating he-

patitis C virus replicon RNAs in cell cultured by small interferings RNAs. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100: 235-240.

86. Wilson JA, Jayasena S, Khvorova A, Sabatinos S, Rodrigue-Gervais IG, Arya S, et al. RNA interference blocks gene expresion and RNA synthesis from hepatitis C replicons propagated in human livers cells. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100: 2738-1788.

87. Kapodia SB, Brideau-Andersen A, Chisari FV. Interference

of hepatitis C virus RNA replication by short interfering

RNAs. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100: 2014-2018.

88. Song E, Lee SK, Wang J, Ince N, Ouyang N, Min J, et al.

RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis. Nature Med 2003; 9: 347-351.

89. Eastman SJ, Baskin KM, Hodges BL, Chu Q, Gates A,

Dreusicke R, et al. Developmental of catheter-based procedures for transducing the isolated rabbit liver with plasmid DNA. Hum Gen Ther 2002; 13: 2065-2077.

90. Kittler R, Buchholz F. RNA interference: gene silencing in the first lane. Semin Cancer Biol 2003; 13: 259-265.

91. Wall NR, Shi Y. Small RNA: can RNA interference be exploited from therapy? Lancet 2003; 362: 1401-1403.

92. Lu PY, Xie FY, Woodle MC. siRNA-mediated antitumori-

genesis for drug target validation and therapeutics. Curr

Opin Mol Ther 2003; 5: 225-234.

93. Buchele T. Proapoptotic therapy with oblimersen (bcl-2 antisense oligonucleotide)-review of preclinical and clinical results. Onkologie 2003; 26: 60-69.

94. Chiu YL, Rana TM. siRNA function in RNAi: a chemical

modification analysis. RNA 2003; 9: 1034-1048.

95. Czauderna F, Fechtner M, Dames S, Aygün H, Klippel A, Pronk GJ, et al. Structural variations and stablishing modifications of synthetic siRNAs in mamlian cells. Nucleic Acids Res 2003; 13: 169-189.

96. Wang L, Prakash RK, Stein CA, Koehn RK, Ruffner DE.

Progress in the delivery of therapeutic ologonucleotides organ/cellular distribution and targeted delivery of oligonucleotides in vivo. Antisense Acid Drug Dev 2003; 31:

2705-2716.

97. Holtz MS, Bhatia R. Effect of imanitib mesylate on chronic myelogenous leukemia hematopoietic progenitor cells. Leuk Lymphoma 2004; 45: 237-245.

98. Tauchi T, Ohyashiki K. Molecular mechanisms of resistance of leukemia to imanitib mesylate. Leuk Res 2004;

28: 39-45.

99. Cowan-Jacob SW, Guez V, Fendrich G, Griffin JD, Fabbro D, Furet P, et al. Imanitib (STI571) resistance in chronic myelogenous leukemia and potential strategies for treatment. Mini Rev Med Chem 2004; 4: 285-299.

100. Marcucci G, Perrotti D, Caligiuri MA. Understanding the molecular basis of imanitib mesylate therapy in chronic myelogenous leukemia and the related mechanisms of resistance. Clin Cancer Res 2003; 9: 1248-1252.

101. Li MJ, McMahon R, Synder DS, Yee JK, Rossi JJ. Specific killing of Ph+ chronic myeloid leukemia cells by a lentiviral vector-delivered anti-bcr/abl small hairpin RNA. Oligonucleotides 2003; 13: 401-409.

102. Wohlbold L, van der Kuip H, Miething C, Vomlocher HP, Knabbe C, Duyster J, et al. Inhibition of bcr-abl gene expression by small interfering RNS sensitizes for imanitib mesylate (ST1571). Blood 2003; 102: 2236-2239.

103. Scherr M, Battmer K, Winkler T, Heindenreich O, Ganser A, Eder M. Specific inhibition of bcr-abl gene expression by small interfering RNA. Blood 2003; 101: 1566-1569.

104. Check E. Hopes rise RNA therapy as mouse study hits target. Nature 2004; 432: 136.

105. Rossi JJ. A cholesterol connection in RNAi. Nature 2004; 432: 155-156.

106. Soutscheck J, Akinc A, Bramlage B, Charisse K, Constein R, Donoghue M, et al. Therapeutics silencing of an endogenous gene by administration of modified siRNAs. Nature 2004; 432: 173-178.

107. Clayton J. The silent treatment. Nature 2004; 431: 598-609.

108. Okamura K, Ishizuka A, Siomi H, Siomi MC. Distinct roles for Argonaute proteins in small RNA-directed RNA cleavage pathways. Genes Dev 2004; 18: 1655-1666.

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