Caracterización del desarrollo neuronal, astrocitario y microglial

Desarrollo de poblaciones neuronales y gliales

Cada una de las características estructurales y funcionales que se manifiestan en la madurez del sistema nervioso, dependen de las diferentes relaciones e interconexiones de células neuronales y no neuronales, que se establecen durante el desarrollo embrionario y postnatal (Kandel, Schwartz, & Jessell, 2001).

El desarrollo cerebral, inicialmente involucra la generación de neuronas y glía a partir de la zona ventricular del tubo neural, de origen ectodérmico del embrión en estadio de gástrula (Kandel, et al., 2001; Kuijpers & Hoogenraad, 2011; Laminga et al., 2000). la zona ventricular da lugar a las células progenitoras, las cuales tienen la capacidad de dividirse, produciendo finalmente células definidas incapaces de dividirse, denominadas neuroblastos y glioblastos, que se convierten a su vez en neuronas y glía respectivamente (Kolb & Whishaw, 2002).

La formación del complejo sistema nervioso, requiere procesos coordinados para llegar finalmente a la madurez (Kuijpers & Hoogenraad, 2011). Estos procesos, comprenden la generación celular (neurogenesis y gliogenesis), la migración de los precursores a través de células gliales radiales desde la zona ventricular hasta la zona cortical, la maduración neuronal con la extensión de dendritas y axones necesarios para las sinapsis, el desarrollo sináptico, la muerte celular y la formación de mielina (Freeman, 2006; Kolb & Whishaw, 2002).

Al generarse diferenciación de las células progenitoras en neuronas estas migran a diferentes partes durante el desarrollo cerebral para organizarse en diversas estructuras y de esta manera ocupar sus posición final, una vez establecidas ellas extienden unas estructuras llamadas filopodios, ricos en actina, que posteriormente darán lugar a las neuritas. Finalmente estas neuritas desarrollan largos axones y dendritas para que las neuronas maduras puedan realizar el proceso de sinapsis (Kuijpers & Hoogenraad, 2011).

A pesar de los conocimientos básicos del desarrollo de células neuro gliales Son pocos los estudios que se han realizado sobre el desarrollo integral y la interrelación neuronal – glial, siendo importante caracterizar los aspectos poblacionales, de supervivencia, morfológicos y de distribución, de tal forma que permitan profundizar en el análisis del desarrollo integrado de las células nerviosas encefálicas en etapa postnatal en donde seguramente participan diversas sustancias sintetizadas por estas células, como respuesta a dicho proceso de desarrollo.

Tipos celulares

De acuerdo a lo anterior, en la mayor parte de las regiones del sistema nervioso las células precursoras se convierten en glía y neuronas; de hecho, el número de células gliales supera sustancialmente al de las neuronas (Cimadevilla, Garcia Moreno, Gonzalez Pardo, Zahonero, & Arias, 1997). La mayoría de las células no neuronales son de tipo glial, las cuales durante el desarrollo no son simples espectadoras pasivas, sino que ejercen un importante papel como moduladoras del neurodesarrollo, incluyendo la mielinización por parte de los oligodendrocitos y las células de schwann, el soporte otorgado por los astrocitos, la migración a través de la glía radial, la regulación del numero de neuronas y las conexiones entre células que favorecen la maduración funcional del sistema nervioso (Colognato & ffrench-Constant, 2004; Freeman, 2006).

Por otra parte, los procesos involucrados en el desarrollo cerebral, en los que se generan diferentes tipos celulares a partir de células madre neurales en común, definen la proliferación y la especificidad de estas poblaciones celulares mediante la activación de genes intrínsecos, que se expresan en proteínas para producir células neuronales o gliales; sin embargo, también es necesaria la presencia de factores extrínsecos para la diferenciación celular como los factores neurotróficos (Fabienne, Pierre, Salaun, deLapeyrière, & Pascale, 2008 ; Kolb & Whishaw, 2002; Verkhratskya, Parpurac, & Rodríguez, 2011 ) que son proteínas sintetizadas para garantizar la supervivencia en diferentes estadios del desarrollo de las células neuronales y juegan un papel crítico en la inducción, especificación, supervivencia y maduración neuronal. Ciertos factores neurotróficos también actúan en el cerebro adulto, para soportar y proteger las poblaciones celulares maduras (Sullivan & Toulouse, 2011). Los proteoglicanos y los miembros de la familia de la IL-6 y las citoquinas por su parte, han demostrado un papel central en el desarrollo del sistema nervioso, como moduladores de la proliferación, la diferenciación y la migración celular, así como en el crecimiento axonal y la formación de sinapsis (Araujo et al., 2010; Fabienne, et al., 2008 ).

Todos los procesos mencionados anteriormente, tienen lugar en un curso temporal a través del cual el sistema nervioso se desarrolla para obtener finalmente las poblaciones neuronales y gliales que definen las funciones cerebrales. En los mamíferos, las células madre neurales pueden dar lugar a ambos tipos de células, neuronas y glía; sin embargo, la neurogenesis se completa casi inmediatamente después del nacimiento, mientras que la gliogenesis permaneces activa y evoluciona durante el periodo postnatal (Sizonenko, Camma, Dayer, & Kiss, 2008). En roedores, las neuronas se generan durante el estadio embrionario, día 12 a 18 (E12 – E18); sin embargo, las células gliales empiezan a aparecer alrededor del día E18 y se prolonga a través del periodo postnatal (Miller & Gauthier, 2007 ; Viktorin, Riebli, Popkova, Giangrande, & Reichert, 2011).

Para poder comprender los cambios morfológicos y funcionales de las células nerviosas en desarrollo y la interrelación de las mismas en un microambiente integrado, se requiere por lo tanto de establecer modelos bajo condiciones controladas de cocultivo, de tal manera que sea factible, práctico y aplicable el conocer la respuesta celular tanto de las neuronas como de las células gliales a diverso tiempos de desarrollo postnatal.

Cocultivos neuro – gliales

Los cultivos celulares aislados o simples, se han establecido como una importante herramienta de investigación en diversos campos de la biomedicina y como alternativa fundamental para reemplazar o reducir el número de animales de experimentación; sin embargo, la finalidad de establecer un cultivo in vitro radica en garantizar en lo posible la obtención de condiciones similares a las del desarrollo postnatal in vivo.

Además estos cultivos neuronales puros o simples, han sido utilizados en diversos estudios considerando sus ventajas en investigación, incluyendo las respuestas celulares específicas. Sin embargo los cocultivos, tienen la importante característica de desarrollar varios tipos celulares, permitiendo la interacción entre ellos y la reproducción de condiciones más acordes con la fisiología de las células y la influencia mutua entre ellas (Stoppelkamp, Riedel, & Platt, 2010). De este modo, los cocultivos o cultivos mixtos no se separan físicamente ni tampoco están influenciados por ningún inhibidor celular, por lo que todas las células se mantienen bajo las mismas condiciones (Majumdar, Gaob, Li, & Webb, 2011).

Los cocultivos se establecen al día 2 post natal, debido a que en esta etapa del desarrollo se produce una interacción esencial entre las neuronas y las células de la glía; la glía, empieza su desarrollo en una etapa más tardía que las células neuronales, siendo los astrocitos quienes empiezan a conformar las condiciones necesarias para el crecimiento de las neuritas (Deumens et al., 2004; Mena, Davila, & Suizer, 1997 ). Se ha establecido que en cultivos neuronales aislados, el porcentaje de astrocitos está alrededor al 2% y la microglia al 3%, en tanto en cultivos mixtos (cocultivos), los astrocitos deben corresponder a un 7% y la microglia aun 5% aproximadamente (Perez Capote, Serratosa, & Solá, 2004).

Sin embargo la mayoría de estudios relacionados con cultivos mixtos, se centran en el efecto de sustancias tóxicas y fármacos sobre la supervivencia neuronal, pero no se fundamentan en la interrelación entre neuronas y otros linajes como las células de la glía, las cuales cumplen diversas funciones en pro del mantenimiento de la homeostasis cerebral.

El trabajo con cultivo celular mixto de neuronas, astrocitos y microglía o cocultivo, también facilitará la observación y seguimiento del desarrollo neuroglial en función del tiempo y de los cambios del microambiente tanto naturales como inducidos por causas exógenas. Se pretende por lo tanto, establecer condiciones de cocultivo como alternativa a los modelos in vivo que pudiesen ser reproducibles para estudios de desarrollo, neurotoxicidad, neurodegeneración, plasticidad y como base para el avance en el conocimiento de las enfermedades neurodegenerativas.

Interacción entre neuronas y células gliales

Se atribuye la función de señalización y comunicación a las neuronas, mientras que la glía se destaca como el soporte de nutrientes, andamio y control homeostático del tejido nervioso; sin embargo, otras investigaciones han fortalecido el concepto acerca de las interacciones neuro-gliales y por consiguiente el desempeño de cada una en el sistema nervioso integrado (Stoppelkamp, et al., 2010).

Las células neuronales son consideras la unidad motora funcional y fisiológica del sistema nervioso, pero estas están acompañadas por un grupo de células a las cuales inicialmente se les denomino neuroglia y que posteriormente se caracterizaron como células de la glía en cada uno de sus tipos, astrocitos, oligodendrocitos y microglia (Pascual, Gonzales-Llanos, Cerdan, Carceller, & Roda, 2000).

Los astrocitos son considerados tradicionalmente como el soporte neuronal; sin embargo, una alteración en su interacción con las neuronas, puede afectar directamente la funcionalidad de estas últimas por diversos mecanismos. La dinámica de los astrocitos tiene como principio, su asociación a las dendritas, al soma neuronal y en los sitios pre y postsinápticos. Además de los astrocitos, la microglía también interactúa con las células neuronales; aunque, este tipo celular tiene una función primordial como células de carácter inmuno protector. Son células que se desarrollan a partir de células hematopoyéticas, por lo que se consideran el componente inmunológico del sistema nervioso central (SNC); la microglía, al igual que los astrocitos liberan sustancias capaces de activar las neuronas y demás células gliales (MILLIGAN, MAIER, & WATKINS, 2003).

Un ejemplo de interacción entre células neuronales y células gliales es que estas ultimas regulan el numero de neuronas en estadios tempranos del desarrollo, de forma dinámica e influyendo directamente en las divisiones de los precursores neuronales (Freeman, 2006). Por tanto el incremento de la población glial con el desarrollo postnatal se puede observar en la maduración o diferenciación de las estructuras cerebrales. Dado que las células gliales tienen una importancia crucial en el proceso de sinapsis tales como su papel en la recaptación de neurotransmisores liberados en la hendidura sináptica, y el papel de la oligodendroglia en la mielinización de los axones (Cimadevilla, et al., 1997).

Correlación celular en cocultivos

La mayoría de investigaciones han evaluado estos cambios solo en cultivos aislados o simples de neuronas, inhibiendo o bloqueando el crecimiento de cualquier otro linaje que no fuese neuronal, lo cual dificulta la comprensión de las condiciones naturales de integralidad neuroglial durante el desarrollo postnatal del sistema nervioso central.

Diversos estudios han demostrado, que en cocultivos de neuronas y células gliales hay una correlación entre la activación de la glía por medio de lipopolisacaridos (LPS) y la protección neuronal; de acuerdo a esto, se ha observado que en estos cultivos mixtos de neuronas y glía, la neurotoxicidad por glutamato es mas baja que en cultivos neuronales puros a diferentes concentraciones (Perez Capote, et al., 2004), por lo cual, los cocultivos no responden de la misma manera que los cultivos celulares específicos. Es tal la interacción neurona-glia que en otras investigaciones se ha establecido que factores de crecimiento celular, pueden decaer fuertemente en un cultivo mixto, afectando la transcripción de genes específicos, de modo que el contacto establecido entre neuronas, astrocitos y microglía puede actuar controlando la expresión de ciertos genes en estos tipos celulares (Pennypacker, Hong, Mullis, Hudson, & McMillian, 1996 ).

Aunque los cocultivos celulares han sido utilizados en diversos estudios de neuroprotección y toxicidad, poco se ha profundizado con relación a la importante interrelación de neuronas y células de glía a nivel fisiológico, siendo la interacción de estas células un aspecto mucho más complejo que el simple contacto físico. Un ejemplo de ello es que durante el desarrollo de la neuroglia las células gliales promueven la supervivencia neuronal a través de la liberación de factores neurotróficos, como el factor de crecimiento epidermal (EGF), el factor de crecimiento derivado de la glía (GDNF) y la activación de genes específicos(Verkhratskya A, Parpurac V, & J., 2011 ). La mayoría de los estudios realizados hasta la fecha, se centran en el análisis de los efectos de diversas sustancias sobre las células del sistema nervioso, sin tener en cuenta el tiempo específico del desarrollo neuroglial, siendo quizás éste un aspecto fundamental que determina la respuesta celular.

Actualmente, el uso de los cultivos primarios como método alternativo para la obtención de datos cualificables y cuantificables en neurociencia, ha ganado gran relevancia por la facilidad en el control de las condiciones experimentales, la reproducibilidad de los métodos y los tiempos relativamente cortos de experimentación; sin embargo, a pesar de las ventajas relativas de los cultivos simples ya sea de neuronas o de astrocitos que siguen un comportamiento dependiente del tipo celular, la evaluación del desarrollo neuroglial bajo condiciones de cocultivo o cultivos mixtos, es fundamental cuando se pretende determinar la interrelación entre las neuronas y otras células no neuronales del sistema nervioso central.

Muchos de los reportes científicos relacionados con cultivos mixtos, se centran en el efecto de diversas sustancias sobre la supervivencia neuronal; sin embargo, no parten del conocimiento necesariamente básico de la interrelación entre neuronas y de éstas con otras líneas celulares como las células de la glía, las cuales cumplen diversas funciones en pro del mantenimiento de la homeostasis cerebral.

Finalmente para poder comprender los cambios morfológicos y funcionales de las células nerviosas en desarrollo y la interrelación de las mismas en un microambiente integrado, se requiere por lo tanto de establecer modelos bajo condiciones controladas de cocultivo, de tal manera que sea factible, práctico y aplicable el conocer la respuesta celular tanto de las neuronas como de las células gliales a diverso tiempos de desarrollo postnatal.

El estudio de diversos aspectos de desarrollo in vitro, permitirá afianzar el conocimiento de la biología celular en cuanto a la participación y coparticipación de las células macrogliales y microgliales sobre las neuronas en condiciones basales de cultivo mixto; lo cual, podrá a su vez constituir una base para estudios de neurotoxicidad, respuesta inmunológica, de neuroplasticidad y neuroprotección.

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Autor:

Katterine Del Rosario Ospina García,

Stephania Parada Giraldo,

Juan Sebastián Solano Gutiérrez

Estudiantes de Biología

Programa de Biología

Universidad del Tolima

Ibagué-Tolima