Microorganismos inusuales en surcos y bolsas periodontales (página 2)

Los organismos de las familias Enterobacteriaceae y Pseudomonadaceae se definen como superinfectantes en periodontitis, pues parecen estar sobreagregados a la infección producida por los periodontopáticos reconocidos 14,16-26. Sin embargo, su prevalencia varía ampliamente entre regiones geográficas y poblaciones estudiadas con rangos desde 14% en los Estados Unidos de América 22, 61% en rumanos 18, con 67% en pacientes dominicanos 23 hasta 92% en sudaneses 17. Barbosa et al. 27 en el Brasil, mostraron una prevalencia de bacilos entéricos Gram negativos y especies de Pseudomonas de 31.2% en 80 sujetos con periodontitis. En Colombia se han encontrado 39.2% de bacilos entéricos en individuos con enfermedad periodontal severa y de 32% con periodontitis agresiva y crónica 28,29.

Los organismos entéricos, no sólo se han descrito en sujetos con compromiso periodontal, sino también en la boca de otros con riesgo de desarrollar infecciones sistémicas, demostrando que algunos pueden ser portadores de organismos potencialmente patógenos 30-36. Estas bacterias además se han aislado en personas que usan prótesis removibles o totales, y se ha descrito su posible asociación con la halitosis en seres humanos 37.

Los microorganismos inusuales muestran amplia resistencia a los antibióticos que se emplean como coadyuvantes en la terapia periodontal. Existen investigaciones donde se muestra que 10% de los pacientes con periodontitis refractaria poseen organismos de las familias Enterobacteriaceae y Pseudomonadaceae 8,14,21,22 con resistencia a los antibióticos usados regularmente para tratar las periodontitis como amoxicilina, doxiciclina, metronidazol y tetraciclinas y una menor susceptibilidad a antimicrobianos como la clorhexidina 24,25.

Las variaciones en el número de organismos entéricos entre los diversos estudios también podrían tener relación con los procedimientos microbiológicos. Se ha demostrado que el tiempo transcurrido entre la toma de la muestra y su procesamiento en el laboratorio influye en la proporción de los organismos porque los bacilos entéricos Gram negativos proliferan en los medios de transporte y así su presencia se puede sobreestimar 17.

Este artículo presenta la prevalencia de microorganismos inusuales en 356 perfiles microbiológicos de individuos sanos y con enfermedad periodontal en un laboratorio de microbiología oral y periodontal.

METODOLOGÍA

Diseño metodológico y muestra.Se estudiaron los informes microbiológicos de 356 colombianos procedentes del departamento del Valle del Cauca sobre todo de Cali, en el período entre enero, 2001 y mayo, 2004 (41 meses). Se tomaron en cuenta los resultados de cultivo microbiológico de pacientes con diagnóstico de periodontitis crónica (PC), periodontitis agresiva (PA) e individuos periodontalmente sanos, de acuerdo con los criterios de inclusión de la Academia Americana de Periodoncia (AAP) 38. El diagnóstico clínico fue establecido por parte de periodoncistas previamente calibrados. Las variables estudiadas fueron: diagnóstico periodontal, recuento total de colonias (TCC), porcentaje de aislamiento de los microorganismos A. actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia/nigrescens, Tannerella forsythia, Campylobacter spp, Eubacterium spp, Fusobacterium spp, Peptostreptococcus micros, Eikenella corrodens, Dialister pneumosintes, y microorganismos inusuales como bacilos Gram negativos pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae, especies de Pseudomonas, Acinetobacter, otros bacilos Gram negativos no fermentadores y levaduras.

Aislamiento e identificación de organismos periodontopáticos e inusuales por el laboratorio de microbiología. A partir de las muestras subgingivales se hicieron cultivos microbiológicos en agar TSBV 39 y en agar Brucella suplementado con sangre de cordero al 5%, hemina y menadiona 40. Las cajas de agar TSBV se incubaron en una atmósfera al 5% de CO2 entre 3 y 5 días (este agar permite la recuperación de A. actinomycetemcomitans y también el crecimiento de bacilos entéricos Gram negativos y levaduras). Las cajas de agar Brucella se incubaron en anaerobiosis por 7 días para la recuperación de los demás patógenos periodontales. La identificación se hizo al tener en cuenta las características morfológicas de las colonias y pruebas bioquímicas adicionales 40.

Las colonias presuntivas de microorganismos entéricos en TSBV se subcultivaron en agar sangre y agar Mac-Conkey para obtener colonias puras que permitieran determinar las características morfológicas distintivas de estos microorganismos. En agar Cetrimide, se subcultivaron todas las colonias sospechosas de pertenecer al género Pseudomonas. La identificación primaria de las colonias aisladas se realizó por pruebas bioquímicas manuales como oxidasa, citrato, MIO (Movilidad-Indol-Ornitina), lisina, urea de Christensen, TSI (agar hierro triple azúcar), malonato, DNAsa. En el caso de los microorganismos no fermentadores de la glucosa, se utilizaron pruebas adicionales como la oxidación-fermentación (OF) de glucosa, movilidad en gota pendiente y crecimiento a 42ºC 41.

La identificación de la especie bacteriana se efectuó al comparar los resultados de las pruebas bioquímicas de cada microorganismo con los datos suministrados por las tablas de identificación de la Sociedad Americana de Microbiología 10. Muchos de los bacilos Gram negativos no fermentadores no se identificaron completamente porque se necesitaban pruebas bioquímicas adicionales no disponibles.

Para identificar las levaduras se subcultivó la colonia presuntiva en agar TSBV al agar sangre, se evaluaron el aspecto de la colonia y la morfología microscópica correspondiente a blastoconidias en la preparación con azul de lactofenol 41.

Análisis de datos. Se hizo una estadística descriptiva de los datos mediante el programa SPSS ver 10.0. Se incluyó análisis de frecuencia, análisis de datos cruzados, tablas de contingencia y pruebas de c2 para buscar asociación estadística en los porcentajes de aislamiento estratificados por diagnósticos. También se tuvo en cuenta el parámetro presencia/ausencia del microorganismo, presencia si se encontraba un microorganismo con un porcentaje de aislamiento mayor de 0. Se consideró una diferencia estadísticamente significante cuando p<0.05.

RESULTADOS

De los 356 informes microbiológicos analizados, 204 (57.3%) correspondieron a mujeres y 152 (42.7%) a hombres. La distribución de la muestra según el diagnóstico periodontal se presenta en el Cuadro 1, donde se aprecia un mayor número de pacientes con enfermedad periodontal crónica, seguidos de enfermedad periodontal agresiva e individuos sanos.

En el Cuadro 2, se presentan los porcentajes de aislamiento promedio de cada uno de los microorganismos periodontopáticos y superinfectantes y su desviación estándar estratificados por diagnóstico periodontal. En los enfermos con compromiso periodontal el porcentaje promedio de colonias aisladas fue similar tanto en periodontitis crónica (X = 262.9 colonias dilución 10-5, rango entre 24 y 600, DE = 143.7) como en periodontitis agresiva (X = 262.2 colonias dilución 10-5, rangos desde 20 hasta 600, DE = 130). En los individuos sanos, el promedio de colonias aisladas fue menor (182.7 colonias dilución 10-5, rango de 80 a 350, DE = 85.6).

Dentro de los microorganismos inusuales, el porcentaje promedio de aislamiento de los entéricos fue más alto que el de las levaduras en los tres tipos de diagnóstico.

Las prevalencias de los microorganismos inusuales presentes según el diagnóstico periodontal aparecen en el Cuadro 3. En éstas no hubo diferencias significativas para la frecuencia entre los grupos. Como la mayor prevalencia de microorganismos inusuales corresponde a enterobacterias, la distribución de bacilos Gram negativos entéricos se presenta en el Cuadro 4. Organismos pertenecientes a los géneros Klebsiella, Enterobacter y las especies P. aeruginosa y Escherichia coli se mostraron como los más frecuentes entre los pacientes con enfermedad periodontal, mientras que en los sanos hubo dos aislamientos de especies del género Klebsiella. También se encontraron bacilos gramnegativos no fermentadores en una alta proporción en personas con enfermedad periodontal crónica o agresiva, no así en individuos sanos.

En el Cuadro 5 se presentan las asociaciones entre microorganismos inusuales con algunas bacterias periodontopáticas, en los grupos de pacientes con periodontitis. En ambos, se encontró una relación estadísticamente significativa entre la presencia de enterobacterias y la ausencia de A. actinomycetemcomitans, mientras que en ausencia de entéricos hubo mayor presencia de especies de Fusobacterium. También se encontró en estos grupos una asociación estadísticamente significativa entre la ausencia de levaduras y la presencia de P. intermedia/nigrescens.

 DISCUSIÓN

La prevalencia de microorganismos inusuales encontrada en este estudio mostró 36% de microorganismos entéricos y 7% de levaduras en 356 perfiles microbiológicos de personas con diversos grados de enfermedad periodontal. Se han presentado resultados similares con respecto a los microorganismos entéricos en pacientes de Brasil 27 con periodontitis crónica (31.2%) y en colombianos 28 con periodontitis crónica severa (39.2%).Los microorganismos inusuales tienen bajas proporciones en la cavidad oral 11, sin embargo, diversas circunstancias pueden generar cambios en las condiciones del microambiente oral que facilitan el sobrecrecimiento de estos patógenos oportunistas. Dentro de ellas, se mencionan hábitos higiénicos deficientes, enfermedades de base como diabetes, cáncer, factores ambientales (tabaquismo o alcoholismo) y terapias antimicrobianas previas que permitirían el establecimiento de una microbiota oportunista.

Los microorganismos inusuales, al encontrarse junto con los organismos periodontopáticos en el microambiente de la bolsa periodontal pueden aprovecharse de condiciones como nutrientes, protección ante la respuesta inmune y economía en el gasto energético 42. Sin embargo, no se han descrito con claridad los tipos de interrelaciones microbianas que pueden existir entre microorganismos periodontopáticos y superinfectantes a nivel de la microbiota subgingival.

En este trabajo se encontraron microorganismos de los géneros Klebsiella en 35.9%, Enterobacter 10.9% y Pseudomonas en 8.6% de 128 pacientes con presencia de entéricos (Cuadro 4). Estos organismos se caracterizan por contar con factores de resistencia a los antibióticos lo cual les da la oportunidad de permanecer por largo tiempo en los tejidos que infectan 9,12. Actualmente la epidemiología de la resistencia de los bacilos Gram negativos tiene su más grande implicación a nivel hospitalario; sin embargo, como hipótesis, se puede decir que los microorganismos superinfectantes en personas con enfermedad periodontal pueden compartir factores de resistencia a los antibióticos en el microambiente subgingival.

Hubo 28.1% de bacilos Gram negativos no fermentadores en los 128 pacientes, cifra que fue el segundo porcentaje más alto entre los bacilos entéricos (Cuadro 4).

Los no fermentadores incluyen un amplio grupo de microorganismos que por lo general son saprofitos, pero que en enfermos inmunosuprimidos pueden desempeñar un papel significativo 43. Es importante identificar mediante pruebas bioquímicas adicionales los géneros bacterianos de este grupo y establecer sus frecuencias en individuos periodontalmente comprometidos.

Otros organismos como Candida se han encontrado en personas con periodontitis 13,15. Aunque se ha establecido que las especies de Candida son superinfectantes, también se proponen mecanismos patógenos de C. albicans en el proceso destructivo de la enfermedad periodontal 13. En el presente estudio la prevalencia de levaduras fue similar entre los grupos de pacientes con periodontitis crónica y agresiva (Cuadro 3) mientras que no se encontraron en los sanos.

El papel que pueden tener los microorganismos inusuales en individuos sanos aún no se ha establecido y en Colombia se desconoce su prevalencia en personas sin compromisos patológicos a nivel de la cavidad oral. En las dos últimas décadas se ha visto que organismos superinfectantes de las familias Enterobacteriaceae y Pseudomonadaceae parecen agravar el pronóstico y los cuadros clínicos en las periodontitis destructivas. Las bacterias entéricas Gram negativas y Pseudomonas se presentan en la placa subgingival de pacientes con periodontitis crónica en rangos entre 14% y 57% en las diversas poblaciones de Europa, Estados Unidos y China 44, pero ningún estudio establece su presencia en personas sanas. Aunque el presente artículo incluye una menor proporción de sanos debido a que no es común la solicitud de un perfil microbiológico en ausencia de alguna enfermedad, es necesario determinar en futuros estudios la microbiota subgingival de estas personas, y establecer qué significa para los individuos sanos ser portadores de esta clase de microorganismos.

El crecimiento de los microorganismos inusuales en los medios de cultivo puede darse con colonias grandes y mucosas en su morfología, que cubren las colonias de periodontopáticos y dificultan su caracterización, como también podrían disminuir los requerimientos nutricionales necesarios para el crecimiento de los anaerobios. Esto podría explicar la asociación estadística que se observó entre la mayor presencia de enterobacterias y la menor presencia de A. actinomycetemcomitans (Cuadro 5). De igual manera el crecimiento de algunos periodontopáticos como Fusobacterium y Prevotella se favorece al no encontrar microorganismos inusuales que compitan con ellos por los factores nutricionales que el medio les brinda. Estos hallazgos in vitro no reflejan las condiciones que ocurren exactamente in vivo en el microambiente subgingival, y por tanto, las asociaciones en este estudio podrían ser un evento casual que no necesariamente implica la ausencia de una de las especies periodontopáticas cuando la microbiota inusual se encuentra presente. Determinar las relaciones entre estos grupos de microorganismos y lo que tienen que ver con los hallazgos clínicos de personas periodontalmente comprometidas, y la comparación con individuos sanos, deben ser puntos que se han de tratar en futuros estudios, que ayuden a comprender la verdadera implicación de la microbiota inusual en la enfermedad periodontal.

CONCLUSIONES

. Este estudio determinó que 36% de los pacientes con periodontitis poseen en su microbiota subgingival microorganismos inusuales tipo bacilos Gram negativos conformados en su gran mayoría por bacterias de las familias Enterobacteriaceae y Pseudomonadaceae. También se aislaron en gran proporción bacilos Gram negativos no fermentadores, agentes que se consideran saprofitos para los pacientes inmunocompetentes pero que podrían comportarse como oportunistas en personas inmunodeprimidas.

. Aunque la prevalencia de levaduras fue 7%, cifra más baja que otros estudios en personas con periodontitis 13,15; se ha reconocido que la presencia de especies como C. albicans podría tener un papel patogénico en el desarrollo de la enfermedad periodontal 13.

. El tipo de microbiota inusuales presente en individuos sanos aún está por determinarse, pero es importante saber si los mismos organismos que se aíslan en los casos de periodontitis se podrían hallar como microbiota normal en personas periodontalmente sanas.

. Las asociaciones entre los periodontopáticos y los microorganismos inusuales que se vieron en este estudio, pueden ser el reflejo de procesos in vitro en los medios de cultivo, y no necesariamente los que se dan in vivo en la microbiota subgingival, donde otros parámetros, como la interacción con las células del hospedero, podrían determinar la presencia o no de ciertas bacterias. Se deben realizar más estudios para comprender las interacciones entre la microbiota inusuales y los patógenos periodontales.

REFERENCIAS

1. Albandar JM, Brunelle JA, Kingman A. Destructive periodontal disease in adults 30 years of age and older in the United States, 1988-1994. J Periodontol 1999; 70: 13-29.

2. Albandar JM. Periodontal diseases in North America. Periodontol 2000 2002; 29: 31-69.

3. Gjermo P, Rosing CK, Susin C, Oppermann R. Periodontal diseases in Central and South America. Periodontol 2000 2002; 29: 70-78.

4. Ministerio de Salud. Estudio Nacional de Salud Oral ENSAB III. Extensión y severidad de la enfermedad periodontal. Bogotá: Ministerio de Salud; 1999.

5. Baelum V, Scheutz F. Periodontal diseases in Africa. Periodontol 2000 2002; 29: 79-103.

6. Maiden MFJ, Cohee P, Tanner ACR. Proposal to conserve the adjectival form of the specific epithet in the reclassification of Bacteroides forsythus. Tanner et al. 1986 to the genus Tannerella Sakamoto et al. 2002 as Tannerella forsythia corrig., gen. nov., comb. nov. Request for an opinion. Int J Syst Evol Microbiol 2003; 53: 2111-2112.

7. Socransky SS, Haffajee AD. Microbiología de la enfermedad periodontal. En: Lindhe J (ed.). Periodontología clínica e implantología. 3ª ed. Barcelona: Editorial Médica Panamericana; 2001. p. 138-190.

8. Colombo AP, Haffajee AD, Dewhirst FE, Paster BJ, Smith CM, Socransky SS, et al. Clinical and microbiological features of refractory periodontitis subjects. J Clin Periodontol 1998; 25: 169-180.

9. Eisenstein BI, Zaleznik DF. Enterobacteriaceae. In: Mandell G, Bennett JE, Dolin R (ed.). Principles and practice of infectious diseases. 5a ed. Philadelphia: Churchill Livingstone; 2000. p. 2294-2310.

10. Farmer III JJ. Enterobacteriaceae: Introduction and identification. In: Murray P, Baron E, Pfaller M, Tenover F, Yolken R (eds.). Manual of clinical microbiology. 7th ed. Washington: American Society for Microbiology Press; 1999. p. 442-464.

11. Chow AW, Roser SM, Brady FA. Orofacial odontogenic infections. Ann Intern Med 1978; 88: 392-402.

12. Pollack M. Pseudomonas aeruginosa. In: Mandell G, Bennett JE, Dolin R (eds.). Principles and practice of infectious diseases. 5th ed. Philadelphia: Churchill Livingstone; 2000. p. 2311-2338.

13. Järvensivu A, Hietanen J, Rautemaa R, Sorsa T, Richardson M. Candida yeasts in chronic periodontitis tissues and subgingival microbial biofilms in vivo. Oral Dis 2004; 10: 106-112.

14. Slots J, Rams TE, Listgarten MA. Yeasts, enteric rods and pseudomonads in the subgingival flora of severe adult periodontitis. Oral Microbiol Immunol 1988; 3: 47-52.

15. Reynaud AH, Nygaard-Ostby B, Boygard GK, Eribe ER, Olsen I, Gjermo P. Yeasts in periodontal pockets. J Clin Periodontol 2001; 28: 860-864.

16. Rams TE, Babalola OO, Slots J. Subgingival occurrence of enteric rods, yeasts and staphylococci after systemic doxycycline therapy. Oral Microbiol Immunol 1990; 5: 166-168.

17. Ali RW, Bakken V, Nilsen R, Skaug N. Comparative detection frequency of 6 putative periodontal pathogens in Sudanese and Norwegian adult periodontitis patients. J Periodontol 1994; 65: 1046-1052.

18. Ali RW, Velcescu C, Jivanescu MC, Lofthus B, Skaug N. Prevalence of 6 putative periodontal pathogens in subgingival plaque samples from Romanian adult periodontitis patients. J Clin Periodontol 1996; 23: 133-139.

19. Ali RW, Johannessen AC, Dahlen G, Socransky SS, Skaug N. Comparison of the subgingival microbiota of periodontally healthy and diseased adults in northern Cameroon. J Clin Periodontol 1997; 24: 830-835.

20. Slots J, Feik D, Rams TE. Age and sex relationships of superinfecting microorganisms in periodontitis patients. Oral Microbiol Immunol 1990; 5: 305-308.

21. Slots J, Feik D, Rams TE. In vitro antimicrobial sensitivity of enteric rods and pseudomonads from advanced adult periodontitis. Oral Microbiol Immunol 1990; 5: 298-301.

22. Slots J, Feik D, Rams TE. Prevalence and antimicrobial susceptibility of Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae and Acinetobacter in human periodontitis. Oral Microbiol Immunol 1990; 5: 149-154.

23. Slots J, Rams TE, Feik D, Taveras HD, Gillespie GM. Subgingival microflora of advanced periodontitis in the Dominican Republic. J Periodontol 1991; 62: 543-547.

24. Slots J, Rams TE, Schonfeld SE. In vitro activity of chlorhexidine against enteric rods, pseudomonads and acinetobacter from human periodontitis. Oral Microbiol Immunol 1991; 6: 62-64.

25. Slots J, Ting M. Systemic antibiotics in the treatment of periodontal disease. Periodontol 2000 2002; 28: 106-176.

26. Dahlen G, Wikstrom M. Occurrence of enteric rods, staphylococci and Candida in subgingival samples. Oral Microbiol Immunol 1995; 10: 42-46.

27. Barbosa FC, Mayer MP, Saba-Chujfi E, Cai S. Subgingival occurrence and antimicrobial susceptibility of enteric rods and pseudomonads from Brazilian periodontitis patients. Oral Microbiol Immunol 2001; 16: 306-310.

28. Mayorga de Fayad I, Lafaurie G, Hurtado P, et al. Detección de Porphyromonas gingivalis y bacilos entéricos en pacientes con periodontitis crónica severa en una muestra de población de Bogotá, D.C. Rev Cient 2002; 8: 28-37.

29. Jaramillo A, Contreras A, Lafaurie G. Microbiota subgingival en pacientes con enfermedad periodontal agresiva y crónica en Colombia. Memorias Revista ACFO 2002 (Abstract) p. 22.

30. de Campos CM, Zelante F. Human oral microbiota. I. Occurrence of enteric bacteria in saliva, tongue and dental plaque. Rev Fac Odontol São Paulo 1978; 16: 77-86.

31. Scannapieco FA, Papandonatos GD, Dunford RG. Associations between oral conditions and respiratory disease in a national sample survey population. Ann Periodontol 1998; 3: 251-256.

32. Scannapieco FA. Role of oral bacteria in respiratory infection. J Periodontol 1999; 70: 793-802.

33. Scannapieco FA, Bush RB, Paju S. Associations between periodontal disease and risk for nosocomial bacterial pneumonia and chronic obstructive pulmonary disease. A systematic review. Ann Periodontol 2003; 8: 54-69.

34. Scannapieco FA, Rethman MP. The relationship between periodontal diseases and respiratory diseases. Dent Today 2003; 22: 79-83.

35. Scannapieco FA, Ho AW, DiTolla M, Chen C, Dentino AR. Exposure to the dental environment and prevalence of respiratory illness in dental student populations. J Can Dent Assoc 2004; 70: 170-174.

36. Sedgley CM, Samaranayake LP. Oral and oropharyngeal prevalence of Enterobacteriaceae in humans: a review. J Oral Pathol Med 1994; 23: 104-113.

37. Goldberg S, Cardash H, Browning H, III Sahly, Rosenberg M. Isolation of Enterobacteriaceae from the mouth and potential association with malodor. J Dent Res 1997; 76: 1770-1775.

38. 1999 International Workshop for a Classification of Periodontal Diseases and Conditions. Papers. Oak Brook, Illinois October 30-November 2, 1999. Ann Periodontol 1999; 4: 1-112.

39. Slots J. Selective medium for isolation of Actinobacillus actinomycetemcomitans. J Clin Microbiol 1982; 15: 606-609.

40. Slots J. Rapid identification of important periodontal microorganisms by cultivation. Oral Microbiol Immunol 1986; 1: 48-55.

41. Koneman EW. Diagnóstico microbiológico. Texto y Atlas color. 5a ed. Madrid: Editorial Médica Panamericana; 1999.

42. Socransky SS, Haffajee AD. Dental biofilms: difficult therapeutic targets. Periodontol 2000 2002; 28: 12-55.

43. Mandell G, Bennett JE, Dolin R. Principles and practice of infectious diseases. 5th ed. Vol I, II. Philadelphia: Churchill Livingstone; 2000.

44. Sedgley CM, Samaranayake LP, Chan JC, Wei SH. A 4-year longitudinal study of the oral prevalence of enteric Gram negative rods and yeasts in Chinese children. Oral Microbiol Immunol 1997; 12: 183-188.

* Este estudio fue financiado en parte por COLCIENCIAS (N° 13080413001) y por la Universidad del Valle, Cali, Colombia. 1. Profesora Auxiliar, Escuela de Bacteriología, Facultad de Salud, Universidad del Valle, Cali, Colombia. 2. Profesor Auxiliar, Escuela de Odontología, Facultad de Salud, Universidad del Valle, Cali, Colombia. 3. Profesor Titular, Escuela de Odontología. Facultad de Salud, Universidad del Valle, Cali, Colombia.