Diferente susceptibilidad de ratones endocriados libres de patógenos específicos a la inoculación experimental de Serpulina hyodysenteriae (página 2)

RESULTADOS

En la tabla 1 se consignan los resultados correspondientes a la sumatoria de la excreción de S.h en materia fecal por los animales a los 3, 5 y 7 d.p.i El porcentaje de recuperación de S.h aisladas en las heces de los ratones de la cepa C57BL/6J fue significativamente mayor, 46.7 % (p<0.05), que en las otras 3 cepas de ratones endocriados (Balb/cJ 40.0%; C57BL/6N 36.4% y Balb/cAnN 33.3%).

La tabla 2 expresa las medias de las UFC de S.h por g de ciego a los 14 d.p.i. Las cepas de ratones C57BL/6J y C57BL/6N contenían S.h en un número significativamente mayor que la cepa de ratón Balb/cAnN (p < 0.05). A su vez, la cepa Balb/cJ excretó S.h en un número significativamente menor que las otras 3 cepas de ratones estudiadas (p < 0.05).

El análisis de los resultados de los hallazgos macroscópicos clasificados en un rango creciente de severidad de 0 a 3 se expresan en la tabla 3. En función de los mismos, su distribución comprendió 2 grupos, el primero con un porcentaje de las lesiones macroscópicas significativamente mayor (p < 0.05) estuvo conformado por las cepas C57BL/6J y C57BL/6N (foto 1) y el segundo grupo, con lesiones leves, conformado por las cepas Balb/cAnN y Balb/cJ. La mayor significación estadística resultó de la comparación entre las cepas de ratones Balb/cJ vs C57BL/6J.

Tabla 1.Análisis de la excreción de S.h en MF, en los días 3, 5 y 7 postinoculación. Analysis of excretion of S.h in the feces at 3, 5 and 7 days postinoculation

Referencias: cr: cepa de ratón, n: número de observaciones, s: excreción de S.h correspondiente a cada cepa de ratón consignado con diferente letra fue significativamente diferente (p<0.05). A: aislamientos positivos; N: aislamientos negativos. References: cr: strain of mice, n: number of observations, s: excretion of S.h by different strains of mice indicated with different letters was statistically significant (p<0.05). A: positive isolation; N: negative isolation.

Tabla 2.Análisis de la cantidad de S.h por gramo de ciego, expresada en media y desvío estándar. Analysis of concentration of S.h per gram of cecum. Values are expresed in mean and standard deviation

Referencias: cr: cepa de ratón, n: número de observaciones (120), m: media, ds: desvío estándar, s: concentración de S.h por gramo de ciego correspondiente a cada cepa de ratón consignado con diferente letra fue significativamente diferente (p<0.05). References: cr: strain of mice, n: number of observations (120), m: mean, ds: standard deviation, s: concentration of S.h per gram of cecum in different strains of mice indicated with different letters was statistically significant (p< 0.05).

Tabla 3.Análisis de lesiones macroscópicas del ciego en el día 14 postinoculación. Analysis of macroscopic cecal lesions at 14 days postinoculation

Referencias: cr: cepa de ratón, n: número de observaciones (120), s: porcentaje de lesiones macroscópicas dentro de la misma fila con diferente letra son significativamente diferentes, (p<0.05). References: cr: strain of mice, n: number of observations (120), : s: percentage of macroscopic lesions with different letters differ significanty (p< 0.05).

Los hallazgos microscópicos más importantes se observaron en las cepas C57BL/6J y C57BL/6N, y consistieron en infiltración de células inflamatorias mononucleares en la lámina propia, hiperplasia de las células caliciformes a nivel de las criptas, dilatación de los vasos linfáticos y edema en la submucosa. Cuando la dilatación macroscópica fue muy marcada, las criptas se observaron más cortas y planas (foto 2). En las cepas Balb/cAnN y Balb/c J se consignó: edema e infiltración celular mononuclear en la lámina propia con dilatación del quilífero central. Las células epiteliales se observaron en algunos cortes descamadas hacia la luz (foto 3) y en donde persistieron, en el borde de las mismas, se observó la presencia de focos de bacterias W.S positivas adheridas a las mismas (foto 4), hallazgo que no fue observado en los intestinos controles. Desde el punto de vista microscópico, no hubo diferencias significativas, en las lesiones observadas, como para cuantificarlas y compararlas por grado de severidad.

DISCUSIÓN

Sobre la base de los resultados de los estudios bacteriológicos, excreción de S.h en materia fecal y UFC por g de ciego, y por los hallazgos anatomopatológicos macroscópicos, la cepa de ratón C57BL/6J demostró ser la más susceptible a la inoculación experimental de S.h., exhibiendo las cepas C57BL/6N, Balb/cJ y Balb/cAnN menor susceptibilidad. Dentro de los parámetros establecidos para definirlo, los resultados de la colonización del ciego por S.h y los hallazgos macroscópicos en este estudio fueron equiparables a los obtenidos por Nibbelink y Wannemuehler (1991), en la cepa de ratón C3H/HeN, en su ensayo, la más susceptible. Otras cepas de ratones que han demostrado ser susceptibles son la CF#1 (Joens y Glock, 1979; Suenaga y Yamazaki, 1984), y la cepa ICR (Adachi y col., 1992).

En el presente estudio, realizado con las 4 cepas de ratones, no se consignaron signos clínicos compatibles con los de la D.P y/o con un cuadro entérico, a diferencia de lo observado por Joens y Glock (1979), con la cepa CF#1, quienes consignaron heces mucoides en el 68% de los animales inoculados con 2 dosis consecutivas. Ello se debería al hecho de que en el ratón, a diferencia de lo que ocurre en el cerdo, las lesiones están localizadas sólo a nivel del ciego, por lo que los trastornos fisiopatológicos que allí se producen, como por ejemplo, falla en la reabsorción de agua, podrían compensarse a nivel del colon distal en el cual no se observan cambios (Mysore y Duhamel 1994). Sin embargo, en nuestro trabajo y en concordancia con otros autores (Adachi y col., 1992, Nibbelink y Wannemuehler, 1991, Mysore y Duhamel, 1994 y Suenaga y Yamazaki, 1984) una sola dosis de 107 UFC/ml de S.h fue suficiente para observar cambios macroscópicos y lesiones microscópicas en el ciego. Los primeros se caracterizaron por distensión por mucus y/o gas del órgano, adelgazamiento de sus paredes y remarcación de los vasos sanguíneos; sin embargo, otros autores describieron inflamación catarral y hemorragias del ciego (Joens y Glock, 1979, Joens y col., 1981), no observadas en este estudio.

Foto 1. Aspecto macroscópico de los ciego del grupo control vs. grupo inoculado. Se observa distensión, cambio de color del contenido cecal y remarcación de los vasos sanguíneos de la serosa Gross changes seen on cecum from control group vs. inoculated group. The affected cecum was distended with colour changes in the lumen contents and with congestive serosal blood vessels.

Foto 2. Ratón cepa C57BL/6N. Se observa aplanamiento de las criptas epiteliales del ciego (flecha) H&E 100x Flattening of cecum cryptal epithelia is observed. (arrow) H&E 100 x.

Las lesiones microscópicas se caracterizaron por hiperplasia de las células caliciformes, edema e infiltración de células mononucleares en la lámina propia con dilatación del quilífero central. En la luz del ciego, se observaron masas compactas de bacterias en parte libres y en parte adheridas a las células epiteliales de las criptas. Con la coloración de W. S, se observaron bacterias adheridas al glicocalix de los enterocitos. Los resultados de los estudios histopatológicos obtenidos en otros trabajos, describen edema, hiperemia con dilatación de las criptas en donde se observan S.h así como cierto grado de erosión, necrosis y descamación epitelial (Joens y Glock, 1979, Suenaga y Yamazaki, 1984). En la cepa de ratón ICR, Adachi y col. (1992) constataron erosión, necrosis y descamación epitelial, hiperplasia de las células caliciformes con numerosas figuras mitóticas e infiltración de la lámina propia por células plasmáticas y células acidófilas. Estudios morfométricos utilizando como parámetros longitud y diámetro de las criptas, número de células epiteliales y relación enterocitos/células caliciformes por cripta, hallaron diferencias estadísticamente significativas entre los diversos tratamientos sólo en el ciego a los 7 y 14 d.p.i. (Mysore y Duhamel, 1994).

A diferencia de lo que ocurre en la D.P, no se consignó en el trabajo realizado necrosis coagulativa superficial de la mucosa ni exudado fibrinonecrótico (Harris y Lysons, 1992). Sin embargo, se ha sugerido que el aumento de la media porcentual del índice mitótico sin una correlación significativa en la relación enterocitos/células caliciformes observado a los 14 d.p.i podría deberse a un recambio acelerado de las células epiteliales como resultante de la degeneración y necrosis celular (Mysore y Duhamel, 1994).

Las diferencias en la susceptibilidad a la infección por S.h entre las distintas cepas de ratones estarían ligadas a factores genéticos (Nibbelink y Wannemuehler, 1991), al laboratorio de origen de las colonias utilizadas e íntimamente relacionadas con la flora bacteriana normal del intestino (Itoh y col.,1983)

En el estudio realizado, los hallazgos histopatológicos no guardaron relación con la categorización utilizada macroscópicamente, así como no se apreciaron en forma constante diferencias marcadas entre las distintas cepas de ratones utilizadas. Estos hallazgos concuerdan con los resultados obtenidos por otros autores con otras cepas de ratones. Sólo Adachi y col. (1992), Joens y Glock (1979) y Suenaga y Yamazaki (1984) constataron necrosis, descamación y denudación del epitelio del ciego.

Se concluye que de los parámetros utilizados, la excreción de S.h a los 3, 5, y 7 d.p.i., las UFC por g de ciego y los hallazgos macroscópicos en ciego, hacen de la cepa de ratón C57BL/6J un modelo de laboratorio válido para el estudio de la infección de S.h y de su posible aplicación para estudios in vivo de antibióticos y quimioterápicos.

RESUMEN

Se inocularon 4 cepas de ratones SPF (Balb/cAnN, Balb/cJ, C57BL/6J y C57BL/6N) con una sola dosis intragástrica de Serpulina hyodysenteriae (S.h). DJ70 (10 7 a 10 8 UFC/ml) para determinar la cepa de ratón más susceptible a la infección experimental. El criterio utilizado para evaluar la infección comprendió los siguientes parámetros: bacteriológicos, descarga de S.h en materia fecal a los 3, 5 y 7 d.p.i, conteo de UFC por g de ciego, cambios anatomopatológicos macroscópicos y lesiones histopatológicas a los 14 d.p.i. En base a los resultados de los conteos bacteriológicos y el grado de los cambios macroscópicos, la cepa de ratón C57BL/6J demostró ser la más susceptible a la infección experimental. Las observaciones histopatológicas más remarcables fueron hiperplasia de células caliciformes, infiltración mononuclear de la lámina propia y edema de la membrana submucosa. La severidad de las lesiones mencionadas no se correlacionaron con los hallazgos macroscópicos y difirieron de aquellos encontrados en los cerdos con cuadros de disentería porcina. Sin embargo, fueron equiparables a los descritos en el ratón por otros autores.

Foto 3. Ratón cepa Balb/cJ. Ciego. a) dilatación del quilífero central. b) descamación del epitelio y detritus celulares en la luz. c) infiltración mononuclear. d) agregado linfocitario. H&E 100x. Strain of mice Balb/cJ. Cecum. a) distended central lymph-vessels. b) sloughing of epithelial cells with cellular debris. c) mononuclear cell infiltration. d) lymphoid cells aggregate.

Foto 4. Ratón cepa Balb/cAnN. a) se observan bacterias adheridas a los enterocitos de las criptas. H&E 400x. Strain of mice Balb/cAnN. a) Foci of adherent bacterial to cryptal epithelium are observed. H&E 400x.

Se concluye que los conteos bacteriológicos progresivos y los cambios macroscópicos registrados en el ciego de la cepa de ratones C57BL/6J a los 14 d.p.i constituyen un buen indicador de infección de S.h y por lo tanto un modelo útil para futuros estudios de sensibilidad in vivo de diferentes antibióticos y quimioterápicos. ___________________________________  * Este trabajo forma parte del plan de tesis para obtener el título de Doctor en Ciencias Veterinarias

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G. Giacoboni, M.V., Bact./1; M.A. Risso, M.V., Dr. med. vet./2; A.R. Massone, M.V./2; C.J. Perfumo, M.V. Dr. med. vet./2.1Laboratorio de Diagnóstico e Investigaciones Bacteriológicas. Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional de La Plata (UNLP). 60 y 118 C.C 296, La Plata, Argentina. 2 Instituto de Patología Dr. "B. Epstein", Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Nacional de La Plata.