Diferente susceptibilidad de ratones endocriados libres de patógenos específicos a la inoculación experimental de Serpulina hyodysenteriae

• Materiales y métodos
• Resultados
• Discusión
• Resumen
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SUMMARY: Different susceptibility of inbred specific pathogen free strains of mice to experimental inoculation with Serpulina hyodysenteriae.

In order to determine susceptibility to Serpulina hyodysenteriae infection four inbred strains of SPF mice (Balb/cAnN, Balb/J, C57BL/6J and C57BL/6N) were inoculated with a single intragastric dose of 107 to 108 colony forming units (CFU) Serpulina hyodysenteriae DJ 70 strain (S.h). The criteria used to evaluate the infection were shedding of bacteria, in faeces at 3, 5, and 7 days post-inoculation (d.p.i), CFU per gram of cecum, cecal macroscopic changes and histopathological lesions at 14 d.p.i. According to the bacteriological counts and the degree of macroscopic changes the C57BL/6J mice strain seemed to be the most susceptible. Globlet cell hyperplasia, mononuclear cell infiltration of lamina propria and inflammatory oedema of submucosa membrane were the most remarkable changes. No correlation between the lesions and the degree of macroscopic findings was observed. Histopathological changes found in mice were correlated with those reported previously in this species, but they differed from those found in pigs. However, progressive bacteriological counts and gross changes of cecum appeared to be a good indicators of S.h infection in C57BL/6J mice and this strain may be a useful animal model in order to study the "in vivo" sensibility of S.h to different antibiotics and chemotherapeutic.

Palabras claves: Serpulina hyodysenteriae , inoculación experimental, cepas de ratones SPF. Bacteriología-Patología.

Keys words: Serpulina hyodysenteriae, experimental inoculation, SPF mice strains, bacteriology-pathology.

INTRODUCCIÓN

La disentería porcina (DP) es una enfermedad que afecta a los cerdos en las etapas de crecimiento y engorde y que se caracteriza por la presentación de una tiflitis y colitis que varía de mucohemorrágica a fibrinonecrótica (Harris y Lysons, 1992). El agente etiológico primario es una espiroqueta anaerobia reclasificada como Serpulina hyodysenteriae (S.h) (Stanton y col., 1991; Stanton, 1992). Más recientemente se han caracterizado 2 nuevas especies dentro del género: Serpulina innocens (S.i) (Kinyon y Harris, 1979) y Serpulina pilosicoli (Trott y col. 1996).

Se han utilizado diferentes modelos experimentales en animales de laboratorio (Joens y col., 1978; Sueyoshi y col., 1987) para el estudio de la patogenicidad de las cepas de S.h aisladas (Kinyon y col., 1977) así como para el estudio de la patogenia de la infección. De ellos el más extensamente probado es el ratón; sin embargo la evaluación de los resultados en esta especie es difícil debido a que en los mismos influyen la cepa de ratón utilizada, su origen genético así como el laboratorio de origen (Nibbelink y Wannemuehler, 1991; Suenaga y Yamazaki, 1984).

El objetivo de este trabajo fue estudiar la susceptibilidad de diferentes cepas de ratones libres de patógenos específicos (SPF) a la inoculación experimental de S.h mediante el estudio bacteriológico y anatomopatológico secuencial. El comportamiento de esta bacteria en el modelo murino aportará información para la comprensión de la patogénesis de la infección por S.h en el cerdo y su aplicación para estudios in vivo de antibióticos y quimioterápicos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Animales de experimentación. Se utilizaron las siguientes cepas de ratones SPF Balb /cJ, Balb/cAnN, C57BL/6J y C57BL/6N, del Bioterio de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la UNLP. Los animales de 4 a 6 semanas de edad y de ambos sexos se alojaron en miniaisladores (cajas de policarbonato de 20 cm x 30 cm, con cama, agua y cobertor estéril y alimento irradiado).

Diseño experimental. Se utilizó un modelo de diseño de bloques aleatorizados, en total 3 (Lison, 1976). Cada bloque estuvo compuesto por 20 animales, 5 de cada cepa de ratón. De ellos, se inocularon 3 animales con la cepa DJ70 de S.h y dos testigos alojados en cajas separadas.

Cepa de Serpulina hyodysenteriae (S.h) y medios de cultivo. Se utilizó la cepa DJ70 de S.h (National Health Institute, Japón) cuya patogenicidad fue demostrada en cerdos SPF (Suenaga y Yamazaki, 1983).

Para el cultivo y determinación del conteo total de viables de la cepa DJ70 se utilizó agar tripticasa soya (ATS) suplementado con 5% de sangre ovina desfibrinada. El aislamiento de S.h de materia fecal y de ciego se realizó en ATS adicionado de espectinomicina 400 mg/l, colistina 25 mg/l y vancomicina 25 mg/l. (Jenkinson y Wingar, 1981). La incubación fue en atmósfera anaeróbica (N2 85%, CO2 15%) durante 72 horas (Anaeroincubator Hirayama).

Inoculación de los ratones. Los ratones se inocularon previo ayuno de 48 horas, con sonda rígida intragástricamente. El inóculo consistió en 1 ml de una suspensión al 50% (vol/vol) de la cepa bacteriana cultivada en ATS y caldo tripticasa soya (TS). El inóculo final se estandarizó en 107-108 UFC por ml determinado por siembras en placas de ATS en diluciones seriadas de base 10. Los animales testigos se inocularon con caldo TS sin sembrar. A las 3 horas post-inoculación se les ofreció alimento y agua a voluntad hasta la finalización de la experiencia.

Estudios bacteriológicos. Para el aislamiento de S.h se extrajo materia fecal de todos los ratones a los 3, 5 y 7 días postinoculación (d.p.i). Las muestras se pesaron y diluyeron al 10% (p/v) con diluyente estéril (4.5 g KH2PO4; 6.0 g Na2HPO4; 0.5 g L-cisteína HCl.H2O; 0.5 g Tween 80, 1.0 g agar y 1000 ml de agua destilada, pH 7.0). Este homogeneizado se sembró en placas de ATS y se incubó en anaerobiosis durante 72 horas y a 42°C. Para confirmar el aislamiento de las espiroquetas las colonias que presentaron marcada hemólisis b se tiñeron con Victoria Blue 4-R (Olson, 1978).

Las observaciones realizadas se expresaron como porcentaje de recuperación de S.h en materia fecal (n= 360).

El aislamiento de S.h del ciego se realizó el día 14 p.i. Los ciegos se extrajeron en forma aséptica, se pesaron en morteros estériles y se homogeneizaron con el mismo diluyente utilizado para la materia fecal. Estas suspensiones se diluyeron con solución fisiológica en forma seriada de base 10 y se sembró 0.1 ml de cada una de ellas en placas de ATS. Se contaron las zonas de hemólisis b fuerte y se calculó el número de S.h por g de ciego luego de la incubación a 42 °C en atmósfera anaeróbica durante 72 horas.

El análisis de los datos se basó en las observaciones de los conteos de S.h en contenido cecal y de su pared a los 14 d.p.i (n=120).

Estudios anatomopatológicos. Los animales se sacrificaron el día 14 p.i. En la observación macroscópica de los ciegos se consideró: grado de distensión del órgano, características del contenido cecal (gas, mucus), adelgazamiento de la pared y visualización o no de los vasos sanguíneos a través de la serosa.

En base a los cambios mencionados y su comparación entre ratones inoculados y testigos no inoculados con S.h, los hallazgos macroscópicos del ciego se clasificaron en: 0 = sin lesiones aparentes; 1 = con lesiones leves; 2 = con lesiones moderadas y 3 = con lesiones severas. Las observaciones macroscópicas fueron expresadas en porcentaje (n=120).

Los ápices de los ciegos se fijaron en formol neutro al 10%, se incluyeron en parafina y los cortes se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & E) y Warthin Starry (W.S).

Análisis estadístico. Se utilizó el análisis de varianza, prueba de Fisher, para contrastar el conteo total de S.h. con los hallazgos macroscópicos en las cuatro cepas de ratones estudiadas. El nivel de significación elegido fue del 5% (Lizasoain y Joaristi, 1995).