Explicaciones sobre los cultivos de referencia según la ISO 17025

Breve introducción

Breve sinopsis en la que se recogen, definen y se dan a conocer los requisitos que se deben dar en los cultivos de referencia según marca la norma ISO 17025 y que queda desarrollado en ''Aseguramiento de Calidad. Cultivo de referencia''. Asimismo conocer recomendaciones como las señaladas por la Entidad Nacional de Acreditación en su anexo IV y V de la GUIA PARA LA ACREDITACION DE LABORATORIOS QUE REALIZAN ANALISIS MICROBIOLOGICOS (G-ENAC-2004. Rev.3 noviembre 2002) o sobre el control de calidad interno en microbiología clínica.

Sobre los cultivos de referencia cultivos de referencia

(Ref. Norma ISO 17025)

Los cultivos de referencia

Es el conjunto constituido por cepas de referencia, cepas de reserva y cepas de trabajo.

Un laboratorio de microbiología cuenta con cultivos de referencia, a fin de acreditar o conservar la acreditación de un ensayo. Así, el número, la elección del género y su especie son dependientes de los ensayos que se elaboran y de las necesidades que asumen estos.

La necesidad de los cultivos de referencia:

La necesidad de los cultivos de referencia parte de demostrar una "trazabilidad". Para que ello se lleve a cabo, se diseña y se sigue un protocolo documental a fin de que se mantenga un buen uso y manejo de dichos cultivos.

Los procedimientos que han de observarse de forma estricta son:

· La evaluación de la calidad de los medios de cultivo.

· La práctica de controles de calidad interno durante la ejecución de los ensayos.

· La realización de controles de calidad de reactivos.

· Pruebas confirmatorias, tales como la "prueba de CAMP"

· La validación de métodos.

Requisitos de los cultivos de referencia

Para que se cumpla un cultivo de referencia debe darse una serie de requisitos. Estos son:

· Células microbianas capaces de crecer; dándose una viabilidad.

· Cepas de referencia. Las colecciones aprovisionarán las cepas con instrucciones para su recuperación.

· Debe tratarse de un cultivo puro. Ha de observarse la pureza de la misma.

· La estabilidad genética. Es requisito fundamenta el que se de la estabilidad y el mantenimiento de características genotípicas y fenotípicas.

En todos los casos la manipulació ny modo de conservaciónde las cepas debe tener especial prevención sobre:

· El deterioro de las cepas.

· La contaminación cruzada.

· Mutaciones, deterioro o alteración de las características típicas de las cepas.

Asimismo, su crecimiento característico debe ser documentado en lo que respecta a cada medio sobre el que se manipula como cepa control.

El material de referencia

Se denomina material de referencia al material o sustancia que ostenta valores de una o más propiedades suficientemente homogéneas y bien conocidas que permite su uso en la calibración de aparatos, la evaluación de un método de medición o la atribución de valores a estos materiales.

Las cepas de referencia

A fin de demostrar la trazabilidad, las cepas de referencia deben obtenerse directamente de una colección con la reseña nacional o internacional de cultivo de referencia reconocido.

Según la "ISO 11133-1:2000", son:

· microorganismos definidos, por lo menos a nivel de género y especie

· catalogados

· muy caracterizados

· de origen conocido

Dichas cepas son distribuidas y presentadas comercialmente liofilizadas; asimismo, los organismos de acreditación son los encargados de considerar válida la fuente de procedencia de la cepa a fin de que se cumpla con el requisito de prevenir mutaciones, deterioro o alteración de las características típicas de las cepas.

El número de repiques a partir de la cepa de referencia a de ser limitado, aceptándose hasta cinco repiques como máximo a partir de dicha cepa de referencia.

Asimismo, toda cepa adquirida por una vía que no sea la propia colección, no podrá mencionarse utilizando el número que tienen en esa colección, sino únicamente como derivada de la cepa de colección.

Adquisición de las cepas de referencia

La adquisición de las cepas de referencia pueden provenir de:

· Obtención directa a partir de una colección nacional e internacional reconocida.

· Proveedores comerciales certificados por ISO que 9001. Comercializan repiques de cepas de referencia adquiridas en una colección reconocida. Generalmente el 3er o 4º repique.

En dicha adquisición se debe mantener sus recipientes originales; siendo de obligado requerimiento en la recepción o compra de insumo, el certificado de origen, donde conste el número de repique y el origen entre otros.

Proveedores de cepas de referencia

1ª. Opción:

· ATCC (American Type Culture Collection).

· SVM (Foundation for the Advancement of Public and Environmental Protection)

· CECT (Colección española de cultivos tipos).

· CNCM. (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) Institut Pasteur

· Etc.

2ª. Opción:

Los proveedores acreditados por ISO 9001 que llevan a cabo repiques a partir cepas adquiridas en la colección reconocida.

Oxoid Companie.

Sobre cepas de colección de referencia

Cepas de colección de referencia

Material de referencia certificado.

Material o sustancia acompañado de un certificado, que posee valores de una o más propiedades, certificados por un procedimiento que establece su trazabibilidad a una realización exacta de la unidad en la cual se expresan los valores de dichas propiedades, para el cual cada valor certificado está acompañado por su incertidumbre, con un nivel de confianza establecido.

Cepas de referencia certificadas:

La cepas de referencia certificadas es un material de referencia certificado biológico.

La colección certifica que se suministra una determinada cepa, que es un cultivo puro, y que se han observado las convenientes pruebas morfológicas, bioquímicas y moleculares acomodadas.

Asimismo, al tratarse de un material biológico puede darse dificultades de certificación.

Reconstitución de las cepas de referencia

· Las Cepas de referencia adquiridas por el laboratorio de microbiología son registradas en planilla como marca el procedimiento.

· Las Cepas de referencia son almacenadas entre 0-5 º C hasta su uso.

· En la reconstitución y siembra de la Cepas de referencia, se utiliza el medio de cultivo, las condiciones de incubación y el procedimiento indicado en las disposiciones para cada tipo de microorganismo del organismo proveedor de las cepas.

· Las Cepas de referencia serán sometidas a un control de calidad de pureza y viabilidad, así se le dará registro.

Registro de cepas de referencia

· Identificación de la cepa.

· Género y especie del microorganismo

· TIPO y Nº de colección.

· Nº de lote.

· Fecha de recepción.

· Control de calidad de la cepa de referencia Conforme (SI/NO).

· Fecha de caducidad de la cepa.

· Personal responsable.

Control de calidad de pureza y viabilidad:

Este control se realiza a diferentes niveles del proceso; asimismo, se desempeña cada vez que se realiza un replique. El objetivo de dicho control es el de asegurarse que las cepas conservan su viabilidad y sus caracteres bioquímicos.

Frecuencia de realización de este control:

· Es el laboratorio el que establece en cada caso la frecuencia de realización del control de calidad de pureza y viabilidad para las cepas de reserva almacenadas.

· En caso de no ostentar las características establecidas se ejecuta la "acciones correctivas" que se establecen en el procedimiento.

Registro de Control de calidad de pureza y viabilidad de las cepas:

· Fecha del control.

· Identificación de la cepa. Género y especie del microorganismo. TIPO y Nº de colección.

· Tipo de cepa (Cepa de referencia, reserva o trabajo).

Pruebas a realizar (depende del microorganismo):

1. Coloración de Gram

2. Características de las colonias en medios selectivos

3. Pruebas bioquímicas y serológicas

Sobre cepas de reserva

Las cepas de reserva

Se considera cepas de reserva, aquellas cepas idénticas logradas mediante un único subcultivo de una cepa de referencia, o lo que es lo mismo, una serie de alícuotas de cultivos idénticos elaboradas en el

laboratorio por subcultivo de la cepa de referencia.

Las cepas de reserva son preparadas y conservadas en el laboratorio, dentro del cual se destina un luga r para su almacenaje, señalando claramente de que se trata de cepas potencialmente peligrosas y cuya manipulación queda exclusivamente restringida al personal autorizado.

Métodos para la preservación y mantenimiento de las cepas de reserva

Los métodos para la preservación y mantenimiento de cepas de reserva obtenidas a partir de cepas de referencia son la LIOFILIZACIÓN y la CONGELACIÓN A BAJAS TEMPERATURAS.

Se da el uso de agentes Crioprotectores

La Liofilización

Esta se define como el proceso de desecación desde el estado congelado.

Los Agentes Crioprotectores:

· Leche descremada de calidad microbiológica, con proceso de esterilización por vapor fluente, al 10% o 20% P/V. Asimismo, puede añadirse aditivos tales como el inositol.

· Dicho producto puede conservarse en refrigeración o a temperatura ambiente por años.

Congelación a baja temperaturas

· Agentes Crioprotectores:

1. Leche descremada de calidad microbiológica (esterilización por vapor fluente) al 10% o 20% P/V.

2. Aditivos, del tipo del Inositol.

3. Glicerol al 10%.

4. Caldo BHI con glicerol 20%.

· Proceso de congelación:

a. Equipamiento o insumos para lograr la congelación

· Congelador o cámara o uso de Nitrógeno líquido.

b. Proceso de congelación

· Temperaturas de congelación:

La temperatura de congelación ideal es de -70° o -80° C, e incluso menor temperatura. En el caso de temperaturas superiores, como los -20° C, se considera como no ideal aunque podría ser la única forma posible; no obstante es preferible -40° C.

· Envases:

Los envases utilizados son el criovial o tubo estéril.

· Conservación del producto:

Su conservación puede darse a temperatura congelación por años.

· Posibles inconveniente:

Los inconvenientes que se puede encontrar en el proceso de congelación son entre otros:

1. problemas y pérdida de las cepas,

2. la falta de suministro de energía,

3. falta de insumos,

4. avería del equipamiento.

La preservación y mantenimiento de cepas de reserva

En la conservación y modo de mantener los microorganismos vivos, puros y la cepa microbiana auténtica, es primordial tener en cuenta los conocimientos fundamentales microbiológicos, suministrar condiciones ajustadas para cada tipo de microorganismo, así mismo, tener en cuenta que con cada subcultivo, existe un riesgo de mutación de la cepa y para ello debe evitarse el crecimiento.

Factores determinantes de la viabilidad de la cepa

Los factores que determinan la viabilidad de las cepas, la cuales están sometidas al proceso de congelación para su reserva, son:

· el tipo de cepa, así por ejemplo que la resistencia de las bacterias Gram positivas es mayor que en el caso de las Gram negativas, y

· las óptimas condiciones del cultivo antes de someterse a bajas temperaturas.

Condiciones previas a la exposición de bajas temperaturas

Las condiciones previas que ha de tenerse en cuenta a la exposición de bajas temperaturas de las cepas son:

· La edad del cultivo

– la capacidad del microorganismo de sobrevivir puede verse afectada por la edad del cultivo.

– Los cultivos muy jóvenes o muy viejos muestran menor resistencia al shock térmico.

– La edad idónea corresponde con el fin de la etapa logarítmica, siendo el principio de la fase estacionaria la de mayor probabilidad de recuperación, siendo el de los microorganismos en general de 24 horas de incubación a 37º C.

· Las condiciones de desarrollo

Estas son consideradas primordiales. Así observamos, por ejemplo, como las levaduras que crecen

aireadas y agitadas gozan de una mayor resistencia a la temperatura que aquellas que desarrolladas en un medio sólido.

Igualmente, se deben respetar y observar las instrucciones dadas por los fabricantes de los sistemas de preservación de cepas disponibles comercialmente.

Como ejemplo, observamos la supervivencia de los microorganismos almacenados a -20º C en Mast Cryobank (Ref.: Mast Cryobank TM, ETICOR)

* Microorganismo…………………………………………………………………… Supervivencia

· Enterobacter aerogenes……………………………………………………………………… 48 meses

· Pseudomona aeruginosa……………………………………………………………………. 18 meses

· Salmonella typhimurium……………………………………………………………………… 48meses

· Staphylococcus aureus………………………………………………………………………..48meses

· Listeria monocytogenes…………………………………………………………………………48 meses

· Listeria ivanovii……………………………………………………………………………………48 meses

· Rhodococcus equi………………………………………………………………………………48 meses

· Bacillus cere us……………………………………………………………………………………24meses

· Clostridium perfringes………………………………………………………………………….48 meses

Procedimientos a seguir en las cepas de reserva

1. Previo a la inoculación, se rotulan los tubos o crioviales donde se almacenan las cepas reserva. En cada criovial queda la siguiente información:

· Identificación de la cepa

· Tipo y Nº de colección

· Nº de repique

· Fecha de realización del C. res. (cepa de reserva)

· Fecha de vencimiento del criovial

· Nº de tubo o criovial

2. El desarrollo microbiano logrado, se inocula asépticamente en el medio líquido sobrenadante que contienen los crioviales.

3. Congelar o liofilizar la cepas de reserva.

4. Manipulación de la cepa de reserva a fin de obtener cepas de trabajo. En el caso de las cepas congeladas de crioviales, se debe realizar este paso para prevenir el descongelamiento y la

contaminación del criovial a través del traslado en su propia caja termostatizada y que repique en campana de flujo laminar.

Asimismo, ha de observarse que

· En el caso de descongelamiento de las cepas de reserva, no se deben volver a congelarse.

· El criovial vencido es eliminado del cepario y se registra.

· Cuando se fracciona alícuotas en leche u otros agentes crioprotectores, se utilizan, se descongelan y no se volverá a congelar ni a usar.

· Las cepas liofilizadas una vez reconstituidas no se deben utilizar.

Registro de cepas de reserva

· Identificación de la cepa. Género y especie del microorganismo.

· TIPO y Nº de colección.

· Nº de Lote Cepa referencia.

· Nº de criovial o vial.

· Fecha de reconstitución de la Cepa referencia.

· Nº de repique.

· Frasco en uso.

· Fecha de baja criovial.

· Ubicación de almacenamiento.

· Observaciones

Las cepas de trabajo

Las cepas de trabajo son los Subcultivos de microorganismos obtenidos a partir de las cepas de reserva a fin de ser empleados en los ensayos que hagan falta.

Obtención de cepas de trabajo:

· Los cultivos de trabajo se consiguen a partir de la Cepas de reserva sobre un medio sólido o líquido no selectivo adecuado manejando un ansa estéril e incubando en condiciones adecuadas.

· Las cepas de trabajo no convienen ser subcultivadas.

Autor:

Carlos Rojas Maragoto.