La eficiencia de fagocitosis de trombocitos In Vitro en aves ante bacterias (página 2)

Morfología

Los TBCs son células de forma ovoide o discoide, algo menores y más redondeados que los eritrocitos (8 x 5 µm). El núcleo es redondo u oval de cromatina condensada de citoplasma azulado o transparente de aspecto reticular o vacuolado con gránulos que pueden variar en coloración se dificulta su reconocimiento al parecerse con los linfocitos pequeños (figura 1). Al análisis ultraestructural poseen un complejo de Golgi bien desarrollado, mitocondrias, granulaciones de glucógeno, lisosomas, escaso retículo endoplásmico y un sistema de vesículas conectado con la membrana (Sweeny Carlson, 1968) En la superficie de los TBCs se observan seudópodos, lobópodos e invaginaciones de la membrana; el contorno del trombocito muestra la presencia de un cinturón periférico de micro túbulos que parecen contribuir ala fagocitosis (Campbell, 1988)

(Fig1) trombocitos aviares células ovoides redondeadas con citoplasma azulado trasparente algo menores a los eritrocitos

Ontogenia

No existen megacariocitos en la médula ósea, por lo que se originan a partir de precursores mononucleados, aparecen en la sangre a partir del día 2 de incubación, siendo el segundo componente celular, después de los eritrocitos (20.000 y 40.000 TBCs x mm3) (Campbell 1988). El sitio de producción son los islotes sanguíneos del saco vitelino

Al parecer en la médula ósea comienzan a aparecer a partir del día 12 de incubación 28. Se han descripto estadios de tromboblasto y de TBCs inmaduros,. Aunque no se sabe cuales son sus precursores. (Campbell 1988).

Función hemostática

Los TBCs juegan un rol similar a las plaquetas de mamíferos en los procesos hemostáticos ya que se adhieren y agregan en el sitio de una injuria vascular formando un tapón hemostático desencadenado más por factores extrínsecos que intrínsecos ya que se agregan en respuesta al agregado de trombina, colágeno y serotonina pero sin necesidad de ADP ni ATP Una de las sustancias liberadas es la serotonina, Localizada casi exclusivamente en los trombocitos estos a su vez expresan un homólogo de la glicoproteína IIb IIIa que actúa como receptor de fibrinógeno para producir la hemostasia (Sweeny y Carlson, 1968)

Función inmunológica

Las propiedades fagocíticas de los TBCs han Sido reportadas desde hace tiempo. Los TBCs Tanto de pollos como de embriones Tienen actividad fagocítica hacia colorantes (Al Awadhiya et al., 1980) y también sobre bacterias y virus. La fagocitosis en los TBCs no se inhibe con las aflatoxinas, como sí ocurre con las demás células fagociticas Se ha reportado que los TBCs pueden fagocitar en la sangre 1,7 más bacterias y hacerlo 3 veces más rápido que heterófilos y monocitos juntos No está clara la participación del complemento sigue siendo un factor desconocido del suero de pollo se cree que puede se liga a ellos .Los TBCs podrían manifestar quimiotaxis en los procesos inflamatorios En las aves, el rol fagocítico tiene significancia por el aparato lisosomal y parecen constituir un vestigio ancestral del comportamiento de los primitivos leucocitos muestran que inmediatamente luego de inyectar Carbón coloidal en pollos se produce agregación trombocítica y que el porcentaje de TBCs con partículas de carbón llega hasta un 50% en los primeros 5 minutos para luego decrecer progresivamente a dife- rencia de los macrófagos (Al Awadhiya et al., 1980), los TBCs no presentan receptores Fc para inmunoglobulinas ni poseen res- puesta oxidativa aparentemente por lo que juegan un papel en la inmunidad innata. Los TBCs de las aves expresan el complejo mayor de histocompatibilidad de clase IV (solo en aves ) lo que permite suponer en los TBCs alguna función en reacciones de tipo Inmunológico aunque algunos autores niegan su función en procesos inflamatorios Los trombocitos son capaces de migrar por tubos capilares, y esta actividad migratoria puede inhibirse por factores solubles liberados por linfocitos T y B activados pero los TBC pueden mediar procesos de cicatrización y actividad fibroblastica (Sweeny , Carlson, 1968)

Materiales y métodos

Se utilizaron 4 pollos de corral cercanos a los 40 dias de edad libres de signos patológicos aparentes, criadas en jaulas de angeo en un ambiente adecuado en el municipio de Ibagué y suministrando dietas adecuadas según su edad (levante, engorde), se extrajeron muestras de 2-3 ml de sangre por animal en tubos de ensayo con solución de heparina sódica 0.2 ml (151.8 mg x 5 mL ) (lo suficiente para inhibir la agregación plaquetaría y que no disminuya la actividad celular) las muestras fueron trasladadas al laboratorio de patología clínica y microbiología de la universidad del Tolima.

Se utilizaron tres tipos de soluciones para realizar el experimento; entre ellas una solución de PBS para mantener el pH adecuado simulando los niveles de neutralidad de la sangre lo cual facilita el desarrollo de los procesos de fagocitosis, se utilizo un total de 0.3 ml de sangre por ave para el desarrollo del experimento. En una placa multipozos de terminación en u se adicionaron 0.1 ml de solución PBS con 0.1 ml de sangre seguidamente del inocuo con bacterias del genero Staphylococcus a la misma cantidad (0.1ml) con ayuda de una micropipeta, las bacterias fueron facilitadas por el laboratorio de microbiología en tubos de ensayo con agua destilada para usarlo como inocuo.

Por cada muestra se hicieron tres replicas a las cuales se les aplico el mismo procedimiento. Hubo 4 muestras distintas cada una con 3 repeticiones para un total de 12 pozos utilizados correspondientes a las 4 aves, seguidamente se procedió a mezclar la solución de PBS + sangre + staphylococcos, durante 30 minutos para así estimular la fagocitosis en los trombocitos aviares.

Se utilizaron 0.03 ml de la mezcla de (PBS + sangre + staphylococcos) para realizar los frotis sanguíneos, (se uso tal cantidad solo por que se requería muestras homogéneas (eritrocitos, heterofilos, linfocitos y trombocitos) con el fin de posibilitar y facilitar la identificación de los trombocitos que habían fagocitado las bacterias y las que no lo habían hecho durante tal periodo.

Seguidamente se dejaron secar por 10 minutos a temperatura ambiente para la fijación para luego agregar tinsion Wright dejando teñir por 7 minutos y ser lavadas en agua, al estar completamente secas las placas se procedió a realizar el conteo de los trombocitos que habían fagocitado bacterias como los que no lo habían hecho en un microscopio óptico a 100 x con aceite de inmersión.

Para la identificación de los trombocitos se recorrió la placa en forma de eles (Figura 2) y así obtener valores más cercanos a la realidad, con el fin de realizar las pruebas estadísticas y determinar el índice fagocítico de los trombocitos aviares.

Figura 2: recorrido que muestra como se observo la placa al microscopio (100X) para determinar el índice fagocítico de los trombocitos

Para las pruebas estadísticas se uso el análisis de varianza con un nivel de significancia del 95%, se tabulo la tabla anova para discutir los resultados y comparar si había diferencias significativas entre las muestras.

Resultados

Los valores de los indicadores del sistema de defensa inespecífica las muestra con staphilococos dan por echo la actividad fagocítica de los trombocitos aviares ante bacterias del genero Staphylococcus

Se observa claramente (tabla 1) que el porcentaje de fagocitosis varia según la muestra y la repetición estudiada, fue un poco menos variable el porcentaje cuando se hallo el promedio de fagocitosis de las muestras estudiadas (tabla 2), el promedio total de fagocitosis en trombocitos aviares fue igual al 32,81% de las plaquetas vistas al microscopio, lo que refuerza el planteamiento de que los trombocitos aviares son células activas de la inmunidad innata, ayudando a otros fagocitos en la eliminación de agentes patógenos.

Los análisis estadísticos demuestran que no hay diferencias significativas entre los tratamientos lo cual nos hace pensar la estabilidad del experimento arrojándonos un valor de 4.45 en la tabla de Fisher (alfa de 0.5) en relación al 0.38 en la F de los análisis de varianza

Discusión

Quizás parezca muy poca la incidencia de estas células en la fagocitosis de microorganismos y sustancias nocivas para las aves si tenemos en cuenta que los Macrófagos tienen promedios de mas del 60% pero si comparamos las cantidades de estas células en sangre con respecto a otros fagocitos heterofilos 30-75%, eosinofilos 0-4% y basofilos 0-5%) notaremos que son muy importante en respuestas inmunes en las aves, su desarrollado aparato lisosomal les da capacidad para destruir los agentes invasores también han sido relacionados con reacciones inflamatorias ya que se sospecha que liberan sustancias que favorecen la migración linfocitaria.

En conclusión los trombocitos en las aves son muy importantes en procesos de inmunidad innata y son una primera línea de defensa contra los agentes patógenos debido a la cantidad que circulan en sangre 20.000-40.000 por mm3

Las propiedades fagocíticas de los TBCs en la sangre pueden ser mas rápida que los heterofilos juntos aunque no se realizaron pruebas para argumentar esto algunos estudios lo demuestran permite suponer en los TBCs alguna función en reacciones de tipo Inmunológico aunque algunos autores niegan su función en procesos inflamatorios

Tabla 1: porcentaje de fagocitosis según la muestra y la repetición estudiada

Tabla 2: porcentaje promedio de muestras con relación al porcentaje total de las muestras

Tabla anova en el que demuestra que no existen diferencias significativas entre los tratamientos

Agradecimientos

Cordiales agradecimientos al docente Iang Rondon Barragan (mvz), laboratorio de diagnostico clínico, al profesor Marco Ávila licenciado en biología y química, Msc por sus accesorias, a Liliana Francis Turner por sus conocimientos, a mi familia y a Dios por permitirnos progresar en la investigacion

Bibliografía

ADAIR, B.M. 2000: Immunopatho genesis of chicken anemia virus infection. 144 InVet. 2005

AQUILES Y M.L. HEVIA fisiología aviar revista facultad de veterinaria, universidad de Murcia 2005

AWADHIYA, R.; VEGAD, & KOLTE, G.N. 1980: Demonstration of the phagocytic activity of chicken thrombocytes using colloidal carbon.

Res. In Vet. Sci. 29: 120-122

Barrow, P.A. (1996). Immunity to Salmonella and other bacteria. Poultry Immunology (pp. 243±263 Abingdon: Carfax Publishing Company

BERTRAM, E.M.1998: Characteriza tion of duck thrombocytes. Res. in Vet. Sci. 64: 267-270

BRADLEY, B. 1937: Observations on the comparative anatomy of blood. Med. J. Austr. 24: 992-999.

CAMPBELL, T. W. 1988: Avian Hematology and Cytology. Iowa State Univ. Press, Ames

CHANG, C. & HAMILTON, P.B. 1979:

Refractory phagocytosis by chicken thrombocytes during aflatoxicosis. Poultry Science 58: 559-561.

CLAVER, ROSA, STANGENELLI, & CYMBERKNOP, D. C. 2004: The role of the mononuclear phagocytic system in chicken thrombocyte sequestration. Biocell 28

SWEENEY, CARLSON, J.M.1968: Demonstration of phagocytic and trephocytic activities of chicken thrombocytes by microscopy and vital staining techniques. Avian Dis. 12: 700-715.

U. ISPIR, M. E. YONAR 2007 Effects of Levamisole on Phagocytic Activity of Rainbow Trout

WIGLEYA;SCOTT.BARROWA Phago cytic and oxidative burst activity of chicken thrombocytes to Salmonella, Escherichia coli and other bacteria 2010

Autor:

Adriana Isabel Velásquez,

Albert Ávila,

Jamir Quiroga,

Ruby Esperanza Avila,

Sammer Yate,

Estudiantes de Biología y Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Del Tolima