Aspectos bioquímicos de la fitohemaglutinina. Aplicaciones en terapéutica médica

INTRODUCCIÓN.

Desde hace algún tiempo existe la certeza, al menos teórica, de que algunos mitógenos derivados de plantas podrían actuar sobre el sistema inmunológico modulando su respuesta (Wimer, 1996, 1998). Estos mitógenos pertenecen a las lectinas, una clase de proteínas bastante heterogéneas en cuanto estructura cuaternaria, que poseen como rasgos comunes la capacidad para unirse específica y reversiblemente a determinados carbohidratos y la posibilidad de aglutinar células. Algunas pueden ser agrupadas en familias sobre la base de determinadas características. Así aparecen, por ejemplo, las lectinas de las legumbres o los cereales, estructuralmente bastante parecidas a las lectinas tipo C (Ca2+ dependientes) de los animales y que contienen dominios homólogos de reconocimiento a carbohidratos (Sharon, 1993).

Dentro de las fitolectinas o lectinas de las legumbres o los cereales, que como familia muchas de ellas comparten también la propiedad de inducir mitosis en algunos tipos de células; se encuentra la lectina de la semilla del guisante, la lectina de la lenteja, la aglutinina del frijol de soya, la aglutinina del germen del trigo, el mitógeno de la hierba carmín, la aglutinina del maní, la concanavalina A y la fitohemaglutinina (PHA, siglas en inglés), entre otras (Sharon, Lis & Lotan, 1974). De todas ellas una de las más estudiadas y una de las que mayor interés despierta en investigaciones es la fitohemaglutinina por la amplia gama de aplicaciones que se le atribuyen.

FITOHEMAGLUTININA. PROPIEDADES BIOLÓGICAS. CARACTERÍSTICAS ESTRUCTURALES.

La PHA integra la fracción proteica de las semillas del frijol colorado común Phaseolus vulgaris, aglutina tanto hematíes como leucocitos, se une a determinados oligosacáridos y estimula la mitosis en diferentes estirpes celulares, dentro de ellas los linfocitos (Hamelryck et al, 1996). Es la lectina más abundante en estas semillas, donde alcanza entre el 5 y el 10% del contenido proteico total (Staswick & Chrispeels, 1984) y comprende cinco glicoproteínas tetraméricas (isolectinas) (PM=115000±4130 D, por ultracentrifugación), muy estables sobre todo en medio ácido (Biswas & Kayastha, 2004) y formadas por dos polipéptidos (L=leucocito y E=hematíe) (Leavitt, Felsted & Bachur, 1977) en las combinaciones (L4, L3E1, L2E2, L1E3, E4) (Hamelryck et al, 1996). Las subunidades E (PM=31700±600 D) son responsables de la eritroaglutinación, pero muestran poca o ninguna actividad mitogénica, mientras que las subunidades L (PM=29900±200 D) confieren propiedades leucoaglutinantes a la proteína nativa y tienen la máxima actividad estimulante de la mitosis (Felsted, Leavitt, Chen & Bachur, 1981; Monsigny, Jeune-Chung & Perrodon, 1978).

Las dos subunidades difieren en la secuencia de aminoácidos desde el residuo 1 al 7, pero son idénticas en las posiciones 8 a la 24. Los residuos 12 y 60 de cada subunidad son una asparagina glicosilada con igual composición en. Los últimos tres residuos de las subunidades son también semejantes (Millar, Hsu, Heinrikson & Yachnin, 1975).

Las isolectinas tienen una composición aminoacídica muy semejante; sólo difieren en los aminoácidos treonina, lisina y arginina y carecen de aminoácidos azufrados (Leavitt et al, 1977). Los oligosacáridos presentes en la proteína tienen un alto contenido de manosa (4 %) y N-acetil-D-glucosamina (2,2 %) (digestión con a -manosidasa y endo-b -N-acetilglucosaminidasa H). Aparecen también otros carbohidratos como fucosa y xilosa (Staswick & Chrispeels, 1984; Vitale, Ceriotti, Bollini & Chrispeels, 1984).

En todas las lectinas derivadas de plantas existen dos iones metálicos por monómero (un ión Ca2+ y un ión de un metal de transición, fundamentalmente Mn2+) situados en la vecindad del sitio de unión a los carbohidratos. La PHA posee estos mismos iones y su presencia es esencial tanto para la unión a los carbohidratos como para la mitogenicidad de la proteína. Los dos iones metálicos están ligados por cuatro moléculas de agua y seis residuos de aminoácidos (una histidina, un glutámico, una asparagina, dos aspártico y un residuo hidrofóbico) (Hamelryck et al, 1996).

Además del sitio de unión a los carbohidratos, un grupo de lectinas, dentro de ellas también la PHA, poseen sitios hidrofóbicos de unión, que pueden ser divididos en tres grupos. El primero está adyacente al sitio de unión a los carbohidratos y es el responsable de la afinidad 10 veces mayor de estas lectinas por los monosacáridos que contienen sustituyentes hidrofóbicos, que por aquellos que no los poseen. El segundo, situado a una distancia aproximada de 30 Å del sitio de unión a los azúcares, tiene una baja afinidad por los ligandos hidrofóbicos. Y el tercero es un sitio de alta afinidad por la adenina y sus derivados N-6 (incluidas un número de hormonas derivadas de adenina, presentes en las plantas) (Hamelryck et al, 1996).

LOCALIZACIÓN Y FUNCIÓN DE LA FITOHEMAGLUTININA EN LA PLANTA.

La PHA se acumula, sobre todo, en las vacuolas de almacenamiento del parénquima de los cotiledones de las semillas, pero también se concentra en las raíces de la planta, específicamente en las vacuolas de los meristemas de las raíces primarias y en las paredes celulares de las raíces elongadas. Mediante PCR reversotranscriptasa se ha demostrado la existencia casi exclusiva de ARNm de la isoforma PHA-E en estos últimos sitios (Chrispeels, 1995).

Se presume que la PHA junto con la arcelina y el inhibidor de la a amilasa participa en mecanismos de defensa en la planta. Estas últimas dos proteínas son consideradas formas truncadas de la PHA en las cuales se han perdido, una y dos de las vueltas o lazos necesarios para unirse a carbohidratos, respectivamente, aboliendo de ellas esta propiedad (Hamelryck et al, 1996; Mirkov et al, 1994).

La PHA actúa protegiendo las semillas contra virus, bacterias, hongos y herbívoros invertebrados, papel determinado en gran medida, por la capacidad de reconocer y unirse a glicanos extraños a la planta (Peumans & Damme, 1995; Rudiger, 1998).

GENÉTICA Y BIOSÍNTESIS DE LA FITOHEMAGLUTININA.

Las subunidades E y L son miembros de una familia de cuatro polipéptidos codificados por igual número de genes estrechamente relacionados y a los que se hace referencia como familia de la PHA del frijol. Esta familia, además de la PHA-E y la PHA-L, también contiene a la arcelina y al inhibidor de la a amilasa (Hamelryck et al, 1996).

Durante el desarrollo de las semillas, no todas las variedades de Phaseolus vulgaris, sintetizan PHA en la misma proporción. Se han encontrado reducidos niveles de ARNm para PHA en aquellas plantas que producen la proteína en menor medida (Staswick & Chrispeels, 1984). Se responsabiliza de este hecho a la presencia de codones de terminación prematuros que desestabilizan el ARNm. Estos ARNms desestabilizados son reconocidos y rápidamente degradados como mecanismo que le evita a la planta la producción de moléculas de proteína truncadas, hipo o afuncionales. La desestabilización es dependiente de la posición de los codones sin sentido. Hay indicios de que los transcriptos con codones sin sentido situados en aproximadamente el 20, el 40 ó el 60 % de la secuencia a lo largo de la región codificante normal, producen ARNms altamente inestables, mientras que un transcripto con un codón sin sentido al 80 % es tan estable como el tipo salvaje (van Hoof & Green, 1996).

En la biosíntesis los glicopéptidos sufren modificaciones tanto cotraduccionales como postraduccionales. Los polipéptidos se sintetizan mediante polisomas unidos al retículo endoplásmico. La glicosilación va sucediendo al mismo tiempo de la traducción y en este proceso cada cadena polipeptídica adquiere las dos cadenas laterales de oligosacáridos. La de la posición asparagina 12 tiene un alto contenido de manosa, mientras que la de la asparagina 60 contiene mucho menos manosa pero adicionalmente posee fucosa y xilosa (Faye, Sturm, Bollini, Vitale & Chrispeels, 1986).

El transporte de la proteína hacia las vacuolas de almacenamiento es mediado por el aparato de Golgi, donde al menos una porción de las cadenas de oligosacáridos sufre modificaciones. Estas modificaciones producen un gradual acortamiento de las cadenas de carbohidratos hasta alcanzar el pequeño tamaño que tienen cuando ya las glicoproteínas están en las vacuolas (Vitale et al, 1984).

Se ha llegado a la conclusión de que las dos cadenas de carbohidratos adicionadas a los residuos 12 y 60 tienen un alto contenido de manosa cuando son recién sintetizadas; pero la unida a la posición 60 es la que sufre fundamentalmente las transformaciones, lo cual puede deberse a que las enzimas responsables de este proceso tienen un mayor acceso a esta cadena que a la de la posición 12 (Faye et al, 1986). La importancia biológica de este procesamiento no está muy clara, aunque sí se conoce que no está relacionado con las señales que marcan a la molécula como una proteína vacuolar, sino que tal información está contenida en el dominio polipeptídico de la proteína (Voelker, Herman & Chrispeels, 1989), entre los residuos 14 y 23 de la PHA madura, más específicamente cerca de la posición 19. No se descarta la posibilidad de un segundo dominio que puede funcionar conjuntamente con el primero para un correcto marcaje de la proteína (Tague, Dickinson & Chrispeels, 1990).

BASES ESTRUCTURALES DEL RECONOCIMIENTO E INTERACCIÓN DE LA FITOHEMAGLUTININA CON LOS CARBOHIDRATOS.

La gran mayoría de las propiedades biológicas de las lectinas estudiadas hasta el momento se basan en la capacidad para reconocer e interactuar con diferentes carbohidratos (Sharma & Surolia, 1997). La especificidad para estas moléculas varía ampliamente entre las diferentes lectinas (Sharma & Surolia), condicionado por la variabilidad estructural de los sitios de unión (Sharon, 1993), donde las interacciones hidrofóbicas, las modificaciones postraduccionales y la oligomerización juegan un papel esencial (Vijayan & Chandra, 1999). Los análisis extensivos de las secuencias y estructuras de varias lectinas muestran que a pesar de la hipervariabilidad de sus regiones de combinación ellas exhiben un significativo patrón de uniformidad (Sharma & Surolia) y la especificidad por los diferentes monosacáridos parece depender de un núcleo conservado de residuos que forma puentes de hidrógeno con el azúcar y una vuelta o lazo variable que determina la forma exacta del sitio de unión. La alta afinidad por oligosacáridos y monosacáridos particulares que contienen sustituyentes hidrofóbicos resulta fundamentalmente de la existencia de distintos subsitios próximos al sitio de unión a los carbohidratos; subsitios que tienen un pequeño número de residuos y se encuentran tanto en sitios específicos para manosa como para galactosa (Loris, Hamelryck, Bouckert & Wyns, 1998).

Específicamente para la PHA-L, el cambio de la asparagina de la posición 128 por ácido aspártico, elimina completamente la capacidad de unión a los carbohidratos y con ello las actividades leucoaglutinantes y mitogénicas características. Esta mutación, sin embargo, no impide que los polipéptidos formen los tetrámeros normales y sean transportados hacia las vacuolas de almacenamiento de la célula (Mirkov & Chrispeels, 1993). El determinante estructural mínimo, altamente afín para la PHA-L es el pentasacárido Gal b 1® 4 GlcNAc b 1® 2 [Gal b 1® 4 GlcNAc b 1® 6] Man (Hamelryck et al, 1996).

APLICACIONES PRÁCTICAS DE LA FITOHEMAGLUTININA.

Dadas las propiedades de aglutinar células sanguíneas, la PHA se utilizó inicialmente como medio para separarlas de la sangre total (Li & Osgood, 1949). Al demostrarse posteriormente el efecto mitogénico, el espectro de aplicaciones se incrementó y actualmente se usa como factor estimulante de la proliferación en cultivos de diferentes estirpes celulares, incluidos los linfocitos (Buhring et al, 1999; Fukao et al, 1999; Kenan et al, 1992); en los que también actúa sobre los procesos bioquímicos relacionados con la respuesta inmune (Kawashima, Kawasaki, Kitamura Tnojima & Morimoto, 1998; Kunikata et al, 1998; Ohbo et al, 1995; Ryan, Vadas & Shannon, 1994). Otras aplicaciones incluyen el estudio in vitro de los mecanismos bioquímicos de la apoptosis (Posmantur, Wang & Gilbertsen, 1998; Wakamatsu, Makino, Tei & Baba, 1999) y de la proliferación celular en linfocitos (Emamghoreishi et al, 1997; Forcic & Mazuran, 1999; Jensen, Odum, Jorgensen, Christophersen & Olesen, 1999), su empleo como marcador histoquímico en estudios de neurofisiología, neuroanatomía y en el proceso de envejecimiento del SNC (Lanciego, Mengual, Erro & Gimenez-Amaya, 1999; Wouterlood & Groenewegen, 1991), como marcador farmacológico para el seguimiento de la respuesta al tratamiento y toxicidad de medicamentos (Stein

Murray & Word, 1999) y en la producción y mejora de medios diagnósticos y métodos analíticos (Delves, 2001; Hampel, Kottgen, Dudenhausen & Kottgen, 1999; Ijima, Kimura & Shiba, 1999). Todas estas aplicaciones se basan esencialmente en la propiedad de combinarse específicamente con determinados sacáridos.

POTENCIALIDADES TERAPÉUTICAS DE LA FITOHEMAGLUTININA.

Los resultados in vitro avalan el posible uso terapéutico de la PHA, sobre todo de la isoforma mitogénica L4. Se reconoce en esta proteína a un ideal modificador de la respuestas biológicas a causa de su extensivo estudio, su disponibilidad en forma pura y estable, convenientemente administrable por múltiples vías, aparentemente no sensibilizante, poco tóxica, con máxima efectividad a dosis relativamente bajas, no inductora de estrés, no oncogénica, no infecciosa, compatible con otras modalidades terapéuticas, probablemente compatible con el embarazo y con una adecuada relación costo-efectividad (Wimer, 1990).

La inmunoterapia sería uno de los campos más beneficiados con su uso debido a la capacidad de interacción rápida e irreversible con los linfocitos, uno de los principales efectores de la respuesta inmune (Wimer, 1990). Su potencial terapéutico también podría incluir áreas como la oncología, las infecciones críticas, los transplantes, las quemaduras extensivas, las aplasias medulares e incluso, ser utilizada como agente adyuvante en la producción de vacunas, pues ha resultado más efectiva de esta manera que como agente de inducción (Wimer, 1990, 2002).

EFECTO INMUNOMODULADOR DE LA FITOHEMAGLUTININA.

La evaluación de las posibilidades de la PHA como modulador del sistema inmune ha estado comprometida debido al empleo de excesivas dosis de PHA eritroaglutinante, nocivas para el sistema circulatorio de los pequeños animales de laboratorio; mientras que en humanos el factor limitante ha sido la restringida disponibilidad del mitógeno en forma no aglutinante. Como consecuencia, la subestimación de su eficacia ha conspirado contra la producción industrial de las cantidades adecuadas para ensayos clínicos. No obstante, se han empleado los datos experimentales que existen para pronosticar a priori los efectos de la modulación mitogénica in vivo (Wimer, 1996).

La transformación linfocítica (blastogénesis) fue descrita por vez primera por Nowell en 1960. Usando PHA para separar las fracciones sanguíneas por aglutinación de glóbulos rojos y blancos, este autor observó que la PHA también estimulaba los linfocitos a una transformación tipo blastocito y división celular. Esta observación se aplicó rápidamente al estudio de los cromosomas humanos y se usó para medir el potencial de proliferación de los linfocitos, propiedad esencial para la inmunidad mediada por células. Se considera que la estimulación no específica y no inmunológica por la PHA, hace que del 65 al 90 % de los linfocitos presentes en el cultivo experimenten blastogénesis y división celular después de 2-3 días en cultivo (Cohen, 1983).

La mayoría de las observaciones apoyan la tesis de que la estimulación ocurre fundamentalmente sobre los linfocitos T (Bohnlein et al, 1989; Cohen, Ichikawa, Lavastida, Gonzalez & Daniela, 1983; Hernandez & Leavitt, 1984; Wimer, 1997), otros plantean que las poblaciones de linfocitos B también son estimuladas a proliferar y diferenciarse, aunque en menor proporción (Shankey, Daniele & Novell, 1981). Utsinger et al. (1977) encontraron incrementos en el contenido de ADN entre aproximadamente el 4 y el 8 % de las células B altamente purificadas, mientras que Knuutila y Kovanen (1987), hallaron una frecuencia de mitosis entre el 6 y el 20 % en estas células. No obstante, se considera que la proliferación y diferenciación de los linfocitos B necesita, en última instancia, de la presencia de subpoblaciones de linfocitos T auxiliadores que serían inducidos por la PHA (Clement, Dagg, Lehmeyer & Kiyotaki, 1983).

Otro aspecto relacionado con la acción inmunomoduladora de la PHA y que tendría un fuerte impacto en terapéutica es la también señalada posibilidad de suprimir la capacidad de respuesta del sistema inmune. Aunque no está muy claro aún el mecanismo por el cual se produce la inmunosupresión, ya desde los años 70s se plantea como posibilidad el hecho de que la PHA fuese capaz de activar células supresoras que secundariamente podrían inhibir la proliferación linfocitaria (Kurnick, Bell & Grey, 1976). También se señala como probable el hecho de que los linfocitos estimulados podrían liberar productos solubles capaces de activar las células supresoras y de esta manera inducir la inmunosupresión (Larsson & Blomgren, 1978;Mawas, Charmot, Comoy & Sasportes, 1977).

Sobre este tópico Wimer (1998) señala que además del efecto supresor inherente, esta sustancia también potencia la supresión generada por los agentes convencionales, tanto a nivel de la respuesta inmune celular como de la humoral. Borrebaeck y Schon (1987) en su estudio con diferentes líneas de células T de leucemia linfocítica humana, encontraron inhibición de la proliferación y la síntesis de ADN. Estos autores emplearon PHA-L y PHA-E y observaron que el grado de inhibición era dependiente de la dosis de la isolectina y que se necesitaban concentraciones considerablemente mayores (hasta 10 veces más) de la isolectina E que la necesaria para inducir la misma respuesta con la PHA-L.

POSIBLES BENEFICIOS DEL USO DE LA FITOHEMAGLUTININA EN ALGUNAS AFECCIONES ESPECÍFICAS.

Wimer es uno de los autores que más ha especulado sobre el posible uso de la PHA en terapéutica, tomando como base, principalmente, los hallazgos experimentales de otros investigadores. Según su parecer hay tres enfermedades que pueden recibir los supuestos beneficios de la PHA directamente: la anemia aplástica, el cáncer y la infección por VIH (Wimer, 1990, 1997, 1998, 2000, 2002).

En la anemia aplástica el mitógeno podría ser utilizado en tres formas diferentes: (1) En los tipos de anemias por citotoxicidad directa más benignos, se podría aplicar un régimen estimulante para incrementar la producción de factores de crecimiento y de esta manera acelerar la recuperación de la aplasia, (2) Donde es necesario un aloinjerto de células madres hematopoyéticas para reemplazar la médula ósea severamente dañada, se podría incluir el mitógeno en el régimen preparatorio, (3) En las anemias aplásticas de causa inmunológica en las que es necesario instaurar un protocolo de supresión, la PHA adicionada a un régimen de drogas como la ciclosporina y la globulina antilinfocito, podría, no sólo incrementar la supresión, sino también prevenir la reemergencia tardía del desorden clonal (Wimer, 1998).

En el tratamiento del cáncer, la PHA podría ser efectiva por la posibilidad de ayudar a la inducción de la remisión en ciertos tumores, por tener un efecto citotóxico antitumoral directo, por mejorar el efecto antineoplásico de las radiaciones y la quimioterapia, por disminuir el riesgo de transformación maligna, por promover la diferenciación y restaurar la respuesta de crecimiento normal en las células malignas, por manifestar un riesgo mínimo de suprimir la actividad citotóxica antitumoral, así como por amplificar la inmunogenicidad de las células tumorales (Wimer, 1990).

En la infección por VIH, administrada sistemáticamente, la PHA podría interferir con la invasión del virus a las células CD4+ al bloquear las moléculas de la glicoproteína 120 en la cubierta viral necesarias para este proceso; al mismo tiempo que activaría los linfocitos T como consecuencia de su unión a las proteínas CD2 y al receptor de los linfocitos T para antígenos. La naturaleza no específica de las células efectoras antivirales generadas por esta activación, impediría las mutaciones a la vez que se recuperarían las células T depletadas, se estimularía la mielopoyesis y se reforzaría la resistencia a las malignizaciones y las infecciones prevalentes en el estado de inmunodeficiencia. Estos efectos adecuadamente coordinados con una apropiada combinación de inhibidores de la proteasa y la reversotranscriptasa, podrían teóricamente, acelerar la completa eliminación del VIH, acortando así la duración del tratamiento requerido y eliminando los perjudiciales efectos de las mutaciones del virus en estos pacientes (Wimer, 1998, 2000, 2002).

CONCLUSIONES

Son evidentes las potencialidades de la PHA y su aplicación en terapéutica médica, avaladas por sus bien documentadas propiedades biológicas y una vasta utilización en estudios in vitro. Esto, unido a la posibilidad de su empleo en el tratamiento de enfermedades, hasta el momento incurables, como el SIDA y el cáncer, justificaría cualquier esfuerzo de la ciencia en investigaciones in vivo en este campo.

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Autor:

Vladimir Ruiz Álvarez, MD, MSc.

Especialista de Primer Grado en Laboratorio Clínico. Master en Bioquímica General. ProfesorAsistente de Bioquímica y Laboratorio Clínico, Dirección: Instituto de Nutrición e Higiene de los Alimentos, Laboratorio de Bioquímica y Fisiología, Calzada de Infanta 1158, Entre Clavel y Llinás, CP. 10300, Ciudad de La Habana, Cuba. Teléfono: (537) 879 5183

Manuel Hernández-Triana, MD, PhD.

Doctor en Ciencias Médicas, Especialista de Segundo Grado en Bioquímica Clínica, Profesor Auxiliar de Bioquímica, Investigador Titular, Dirección: Instituto de Nutrición e Higiene de los Alimentos, Laboratorio de Bioquímica y Fisiología, Calzada de Infanta 1158, Entre Clavel y Llinás, CP. 10300, Ciudad de La Habana, Cuba. Teléfono: (537) 879 5183