Nuevos enfoques en el estudio de la interacción rhizobium-leguminosa. El papel de la trehalosa

Enviado por syanez

Resumen.

La relación de Rhizobium y las leguminosas normalmente se establece en función del nivel de nitrógeno disponible en suelo el cual dispara una serie de genes complementarios en ambos asociados para la fijación del nitrógeno molecular que satisface la demanda de este elemento en la planta, sin embargo investigación señala que esta interacción no solo es dependiente del nivel de nitrógeno disponible, también que la humedad en el suelo o ambiente disponible para la planta regula la producción de un amortiguador bioquímico que evita la muerte celular por desecación la trealosa acumulada en los nódulos y que previene en otros forma de vida la lisis por falta de agua.

El objetivo de esta revisión es mostrar un nuevo enfoque de la interacción Rhizobium y las leguminosas para entender que la nódulación es más compleja de lo que se asume hasta hoy que se deriva de un solo modulador el nitrógeno, e involucrar al agua como otro factor determinante de la relación entre este género bacteriano y las leguminosas.

Palabras clave. Fijación biológica de nitrógeno, agua, leguminosas, trealosa. Nódulos.

1. INTRODUCCION

Una de las principales características de la mayoría de las leguminosas estriba en su capacidad para asociarse con bacterias del género Rhizobium, lo cual resulta en la formación de nódulos en su sistema radical en cuyo interior se realiza la fijación biológica de nitrógeno -FBN- (Allen y Allen, 1981). Así las leguminosas en su asociación con Rhizobium tienen una gran importancia agrícola y ecológica debido a que son responsables de una parte sustancial. quizá de la mayoría, del f1ujo global de nitrógeno atmosférico a formas "fijadas", tales como el amonio, nitratos y compuestos orgánicos (Young y Hauka, 1996).

Por este motivo. por muchos años los estudios de la simbiosis entre las leguminosas y Rhizobium han girado alrededor de la FBN (Bergensen et al., 1987; Bordeleau et al., 1994; Elkan, 1992; Greenland, 1977; Guerin et al., 1990; Long, 1989; Postgate, 1982; Quispel, 1988; Sprent, 1989). Diferentes factores condujeron a la revalorización de la FBN hacia 1970: la creciente demanda de nitrógeno en la agricultura. el incremento de los precios de los fertilizantes comerciales durante la crisis del petróleo y las especulaciones basadas en las posibilidades de la biología molecular (Quispel, 1998).

En años recientes, se inició la investigación sobre otras actividades que ocurren durante la simbiosis y que pueden incidir en el desarrollo vegetal, como la disponibilidad de otros nutrientes (Guerinot et al., 1990), antagonismo contra patógenos (Fuhrmann y Wollum, 1989; Hynes et al., 2000), síntesis de reguladores de crecimiento (Azcón en Farías-Rodríguez, 1998) y la resistencia a condiciones adversas (Mellor, 1992).

A través de diversos estudios se conoce que durante la simbiosis, después de la formación del nódulo, se sintetiza un disacárido conocido como trehalosa, el cual se acumula en el nódulo en altas concentraciones. La síntesis de la trehalosa se lleva a cabo por los bacteroides y la mayor proporción se almacena en el citoplasma vegetal (Mellor, 1992). La trehalosa no parece ser una fuente importante de energía para apoyar la FBN, ya que su concentración aumenta a medida que el nódulo envejece (Streeter. 1985).

La trehalosa es producida además, por otros microorganismos fijadores de nitrógeno tales como cianobacterias y Frankia, pero el posible papel de este disacárido en los sistemas simbióticos no ha sido claramente entendido (Streeter, 1999). La ubicua presencia de la trehalosa está acompañada por una diversidad de funciones: ha sido relacionada en osmoprotección (E. coli), tolerancia a la desecación (S. cerevisiae); plantas de la resurrección, nemátodos (Artemia), osmotolerancia, termotolerancia (levaduras) y reserva de carbono (hongos) (Araujo, 1996; Breedveld et al., 1991; Burleigh et al., 1994; Crowe et al., 1984 a,b,c; Goddijn et al., 2000; Mellor, 1991; Potts, 1994; Welsh et al., 1991).

En cuanto a su función en la simbiosis, recientemente se demostró que la acumulación de este disacárido en nódulos de frijol está correlacionada con la tolerancia a la sequía (Farías-Rodríguez, 1998). Sin embargo este conocimiento proviene de plantas y microorganismos cultivados bajo condiciones de laboratorio, a través de los cuales han comenzado diversos proyectos encaminados a generar cultivos resistentes a la sequía mediante ingeniería genética.

No obstante, es de vital importancia conocer los factores que en la naturaleza determinan la dinámica de acumulación de trehalosa, para en un futuro esclarecer el papel de la trehalosa en la simbiosis y su significado ecológico y su posterior aprovechamiento.

TREHALOSA EN LA NATURALEZA:

La trehalosa es un azúcar no reductor con una estructura única: α-D-glucopiranosil-( 1-1 )-α –D-glucopiranósido, el cual se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza. Se ha encontrado en todos los hongos y en muchos animales y bacterias, pero no se ha reportado en plantas. Sin embargo, se encuentra en los nódulos de las leguminosas, por lo general como el carbohidrato principal (Streeter, 1999).

11.2. Trehalosa en Microorganismos

La trehalosa se ha detectado en todos los grupos microbianos analizados (Elbein, 1974). En los microorganismos el papel de la trehalosa se ha relacionado con la resistencia a la sequía y proviene de una serie de estudios en los que se ha demostrado que organismos tales como hongos, levaduras, bacterias y semillas de plantas son capaces de vivir por largos períodos en condiciones de deshidratación casi completa (Crowe et al., 1984)

Leslie et al. (1995) demostró que células de Escherichia coli y Bacillus thuringiensis deshidratadas en presencia de trehalosa y sacarosa, tienen un alto porcentaje de sobrevivencia en comparación a aquellas deshidratadas sin estos azúcares.

La sobrevivencia de E. coli deshidratada en presencia de trehalosa fue del 70 % y con sacarosa, de 56 %, mientras que el control la sobrevivencia fue solo de 8 %. De manera similar, en B. thuringiensis la sobrevivencia en presencia de trehalosa fue de 57% y con sacarosa de 44% concluyendo que la adición de trehalosa o sacarosa incrementa de manera significativa la sobrevivencia, teniendo la trehalosa un mejor rendimiento, y esto puede deberse a la capacidad de estos azúcares para disminuir la fase de transición en membranas deshidratadas y mantener la estructura de las proteínas durante la deshidratación.

En S. cerevisiae se demostró que la sobrevivencia a condiciones de deshidratación se correlaciona con las concentraciones de trehalosa sintetizadas por las células (Eleutherio, et al., 1993). Por ejemplo, las cepas 1412-4 D Y 311 tienen diferente capacidad de síntesis y acumulación de trehalosa. siendo de 40 mg.g-1 de células y 75 mg.g-1 de células, respectivamente.

La sobrevivencia después de la deshidratación fue de un 40% para la cepa 1412-4D y 90% para la cepa 311.

Las cepas incapaces de sintetizar trehalosa no sobrevivieron a la deshidratación, sin embargo al adicionarles 10% de trehalosa en el medio, la sobrevivencia se incrementó a un 40%. Las cepas de S. uvarllm var carlsbergensis acumulan poca trehalosa y son sensibles a la deshidratación. Sin embargo sometiendo a éstas a un ligero tratamiento osmótico (20% sorbitol o dextrina) se favorece la acumulación de trehalosa. Después del tratamiento osmótico se pudo reproducir la resistencia a la deshidratación, con una sobrevivencia de hasta 60% (Eleutherio et al., 1997), es decir, la presencia de trehalosa se requirió en todos los casos para poder tolerar la deshidratación.

Mediante la sobreexpresión del gen tps 1 (el cual codifica para la trehalosa-6-fosfato sintasa) en S. pombe, se observaron resultados similares a los de Eleuterio, et al (1993, 1997; Soto et al., 1999). Las cepas de S. pombe responden a diferentes tipos de estrés acumulando trehalosa. Las cepas recombinantes que sobreexpresan tps 1 acumularon más trehalosa, mostrando una mayor sobrevivencia (con diferencias de 2 á 3 unidades logarítmicas). Se demostró que la síntesis de trehalosa, y no la síntesis de la enzima trehalosa-6-fosfato sintasa, es el principal mecanismo de resistencia a diversos tipos de estrés, como el osmótico, la temperatura y la deshidratación.

En un estudio realizado en las arqueobacterias Natronococcus y Natronobacterium (las cuales crecen en condiciones de alta salinidad y elevado pH), se encontraron resultados muy interesantes (Desmarais et al., 1997), Se creía originalmente que este tipo de arqueobacterias usaban iones inorgánicos, por ejemplo: el potasio, como solutos para balancear la presión osmótica externa, pero al estudiar la estrategia de estas arqueobacterias para sobrevivir al este estrés osmótico, se encontró que el principal soluto era un compuesto orgánico, el cual resultó ser la 2-sulfotrehalosa, cuyas concentraciones se incrementan al aumentar las concentraciones de NaCl externas.

La sultotrehalosa es el primer (quizás el único) osmolito orgánico detectado en arqueobacterias halofílicas alcalifílicas.

La biosíntesis de trehalosaha sido estudiada en detalle en S. cerevisiae y E. coli. Comprende la formación de la trehalosa-6-fosfato a partir de UDP-glucosa y glucosa-6-fosfato, reacción catalizada por la enzima trehalosa-6-fosfato sintasa (TPS), posteriormente este metabolito es desfosforilado por la enzima trehalosa-6-fosfato fosfatasa (TPP) para generar trehalosa libre (Figura 1 a) (Elbein, 1974). Adicionalmente se ha reportado los genes dt, una nueva ruta en Rhizobium. La cual consiste en la utilización de maltoheptosa como sustrato (Figura 1 b). La reacción es catalizada por la maltoologosil y la trehalosa sintasa (MTS) y la maltoologosil trehalosa hidrolasa (MTH). La MTS cataliza por una transglucosilación intramolecular la formación de uniones glicosídicas α-α ( 1-1). La MTH hidroliza el producto de la reacción de la MTSasa en la unión α(1-4)entre el grupo maltoologosil y la trehalosa, liberarando así el disacárido (De Smet et al.,2000; Maruta et al., 1996).

La hidrólisis de la trehalosa puede ocurrir en diferentes formas, en Euglena gracilis y Pichia fermentans es realizada por la enzima trehalosa fosforilasa, en Escherichia coli por una fosforilación y seguida de la hidrólisis por acción de la enzima trehalosa-6-fosfato hidrolasa. En plantas, hongos, animales y bacterias la hidrólisis se realiza por la enzima trehalasa (αα-trehalosa 1- D-glucohidrolasa) (Figura 1 a).

II.3. TREHALOSA EN LAS PLANTAS

En plantas la trehalosa fue aislada por primera vez en Selaginella lepidophylla y subsecuentemente ha sido encontrada en otras pteridofitas investigadas. S. lepidophylla entra en dormancia durante períodos de sequía y revive cuando el agua es nuevamente disponible. Durante la sequía extrema, los niveles de trehalosa alcanzan el 20% del peso seco en las hojas, posiblemente protegiendo las estructuras celulares y sus componentes de la desnaturalización (Goddijn y Smeekens, 1998).

Se ha demostrado claramente que el papel de la trehalosa en estas plantas cryptobióticas es la tolerancia al estrés, en particular a la sequía (Goddijn et al., 1999) La ausencia general de trehalosa en las semillas y polen resistentes a la desecación, ha sugerido que las plantas superiores han perdido la capacidad para producir trehalosa (Crowe et al., 1992).

La presencia de trehalosa en angiospermas ha sido cuestionada, ya que sólo se ha detectado en hojas de plantas tolerantes a la desecación tales como Myrothamus flabellifolius y Sporobolus stapjianus. llamadas plantas de la resurrección (Müller et al., 1995; Goddijn et al., 1998), en donde, en las hojas de M. flabellifolius se ha encontrado que representa hasta el 19% de los azúcares después de 4 días de deshidratación (Bianchi et al., 1993).

En las espermatofitas la presencia de trehalosa no ha sido comprobada, pues ha sido atribuida a contaminación de las muestras por microorganismos (Elbein, 1974). Para excluir la posibilidad de contaminación, se ha utilizado la biología molecular para detectarla en las plantas. Recientemente la presencia de los genes para la síntesis de trehalosa ha sido reportada en Arabidopsis thaliana (Blázquez et al., 1988; Goddijn et al., 1998; Vogel et al., 1998).

El gen para la trehalosa-6-fosfato sintasa fue detectado por complementación en una cepa mutante de S. cereviciae TPS l' con una librería de cDNA de Arabidopsis, sin embargo, en las transformantes, la síntesis de trehalosa no alcanzó los valores del tipo silvestre durante la fase estacionaria. El análisis de secuencia del inserto, reveló que el marco de lectura abierto más grande codifica para una proteína de 942 aminoácidos, la cual es 45% mayor que cualquier trehalosa-6- fosfato sintasa de otros organismos. Los primeros 500 aa muestran una similitud entre e1 35% y el 70% con otras TPS. La posición C terminal de la proteína no tiene similitud con otra secuencia conocida.

Posteriormente se detectaron en la planta únicamente poly (A) RNAm de TPS 1 en todos los tejidos de la planta, siendo baja su expresión, sin embargo no se observó la acumulación de trehalosa (Blázquez et al., 1988). El gen de la trehalosa-6-fosfato fosfatasa en Arabidopsis fue detectado usando la técnica anterior en una cepa de levadura TPS2', observándose dos transcritos que complementaron dichas mutantes, y que a través del análisis de secuencia se obtuvo una alta homología con otras reportadas para la TPP en microorganismos. Los polipéptidos codificados por estos dos cDNA de Arabidopsis tiene en la parte N terminal una extensión de 100 aa que se asemejan al péptido señal requerido para la importación al cloroplasto. La región N terminal en levadura es de 500 aa, la cual tiene homología con la TPS, pero carece de actividad (Vogel et al., 1998).

En vista de la presencia de los genes que codifican para las enzimas de la biosíntesis de trehalosa en plantas, es probable que esta se produzca. Sin embargo, aún queda por demostrar si estas enzimas son funcionalmente activas en la planta. Sobre todo, donde y cuando las enzimas, así como su producto están presentes en los tejidos de la planta (Vogel et al., 1998).

II.4. TREHALOSA EN SISTEMAS SIMBIOTICOS:

En un dramático contraste, la trehalosa es muy común en plantas en simbiosis con microorganismos, aunque la acción de la trehalosa en plantas superiores no ha sido bien entendida (Mellor, 1992).

II.4.1. Actinorrizas.

Frankia, es un actinomyceto que puede formar nódulos con 22 géneros de plantas entre las que se encuentran: Casuarinaceae, Alloeasuarina, Casuarina; Coriariaceae, Coriartia; Betulaceae, Alnus; Dastiscaceae, Dastiea; Myricaceae, Myriea, Comptonia; Rosaceae, Rubus, Dryas, Purshia, Cereoearpus, etc. Económica y ecológicamente las especies más importantes son Alnus y Casuarina (Mellor, 1994). Frankia almacena carbohidratos en forma de glucógeno y trehalosa. La cantidad de trehalosa se relaciona inversamente con la fijación de nitrógeno. Se cree que esto se debe principalmente a una disminución en la síntesis de trehalosa más que a su hidrólisis. Los nódulos actinorrícicos contiene grandes cantidades de sacarosa, que junto con la fructosa son capaces de mantener la fijación de nitrógeno.

El conocimiento de la trehalosa y la trehalasa en los nódulos es escaso (Mellor, 1992). En otros estudios, se demostró que la concentración intracelular de trehalosa en Frankia se incrementó de O ng.μg-1 proteína hasta 612 ng.μg-1 proteína cuando se sometió a esta a diferentes condiciones osmóticas. Además la concentración de trehalosa interna se relacionó de manera directa con la habilidad de sobrevivir a la desecación, asumiendo que esta puede ser un agente osmoprotector (Burleigh y Dawson, 1994)

II. 4.2. Micorrizas.

Las micorrizas son las simbiosis más comunes que se establecen con plantas vasculares. Se ha observado en cortes de ectomicorrizas que la glucosa y la fructosa pueden ser convertidas en trehalosa y manitol. La trehalosa puede ser transportada al citoplasma de la célula vegetal. Se ha propuesto que la concentración de trehalosa en raíces es proporcional al grado de micorrización (Niederer, 1989 en Mellor, 1992). En las raíces de soya infectadas con Glomus mosseae, una micorriza vesículo-arbuscular, se incrementaron significativamente los niveles de trehalosa, así como la actividad de trehalasa. En estos casos, la trehalosa de origen fungal puede entrar a los tejidos de la planta debido a la íntima relación de la endosimbiosis, en donde el contacto célula-célula es más estrecho que en las ectomicorrizas, por lo cual las micorrizas vesículoarbusculares son comparadas regularmente con la simbiosis de Rhizobium (Mellor, 1992).

En plantas inoculadas (Glycine max cv Maple arrowy Tagetes tenuigolia) el contenido de trehalosa en raíces incrementó a partir del día 10, alcanzando 32 mg g-1 de peso fresco al final del experimento. Se propuso que la trehalosa fue sintetizada por el hongo a partir del carbono proveniente de la planta. Por otra parte, en raíces sin inocular no se detectó trehalosa (Schubert et al., 1992).

En las micorrizas, el metabolismo de carbohidratos y su flujo entre el huésped y el hongo han recibido considerable atención. Aunque el movimiento de carbono ha sido demostrado, se conoce poco de la naturaleza de las moléculas que son intercambiadas. El concepto más simple de transporte bidireccional involucra Pi y carbohidratos solubles, con la adición de nitrógeno orgánico del hongo a la planta. Las moléculas transferidas tienen implicaciones importantes en el mecanismo de transporte que puede operar y en el movimiento simultáneo de otros iones.

La distribución de ATPasas en las membranas plasmáticas de las células de la raíz y los arbúsculos, apoyan el concepto de un transporte controlado en ambas direcciones (Schubert et al., 1992). En esporocarpos la trehalosa fue el principal carbohidrato soluble que se detectó y su concentración fue de 1.42 mg.g-1 de peso fresco, lo que representó el 94% del total de los carbohidratos. Asimismo, en raíces de otras plantas micorrizadas, el porcentaje de trehalosa fue de 4.4% del total de carbohidratos (Mellor, 1992).

II .4.3 Rhizobium /Leguminosa.

En los primeros estudios realizados en Bradyrhizobium japonicum se demostró que la trehalosa es uno de los principales carbohidratos (Streeter, 1985). Posteriormente se encontró que todas las especies de Rhizobium examinadas hasta ahora, acumulan este azúcar (Salminen et al., 1986; Müller et al., 1994).

La composición del medio de cultivo (diferentes fuentes de carbono y nitrógeno, como manitol, arabinosa y urea, glutamato respectivamente), el estado de crecimiento de la bacteria y la cepa, tiene influencia en la concentración de trehalosa en las células, alcanzando concentraciones mayores al 90% del total de mono y disacáridos presentes, entre los cuales detectaron arabitol, arabinosa, manitol, fructosa y glucosa. R. japonicum no creció en medios que contenían trehalosa, sin embargo, la marcada acumulación de este azúcar por la bacteria en otros medios sugiere que es utilizada para otros fines diferentes a la reserva de carbono (Streeter, 1985).

En R. leguminosarum sometido al 2% se observó un incremento significativo en las concentraciones de trehalosa (Hoelsle et al., 1990). El mecanismo bioquímico involucrado en la acumulación de trehalosa bajo condiciones limitantes de 2% no es aún claro, sin embargo se cree que la acumulación puede ser atribuida a un incremento en la síntesis o bien a una disminución en la degradación de trehalosa.

La trehalosa ha sido detectada en la simbiosis entre Rhizobium y leguminosas, y su síntesis la realizan exclusivamente los bacteroides. Sin embargo, la mayor parte de la trehalosa sintetizada es liberada al espacio peribacteroidal, de tal forma que puede ser encontrada en el citoplasma de las células huésped (Streeter, 1985). La concentración de trehalosa en los nódulos es 10 veces mayor que en cualquier otro órgano.

Se han encontrado cantidades de 2 á 14 mg de trehalosa . g-1 nódulo fresco (Streeter, 1980, 1984). Lo mismo sucede en el caso de los nódulos de Phaseollls vulgaris, Pisum sativum, Arachis hipogea, Medicago sativa, Trifolium repens, Lotus corniculatus y Sesbania rostrata (Streeter, 1985). A través de la familia Leguminosae, los nódulos de los miembros de Papilionaceae y Caeslpinaceae tienen trehalosa, no se han analizado miembros de Mimosoideae (Farías- Rodríguez, 1998a). Trazas de trehalosa (0.1 mg.g-1 peso seco) fueron encontrados en tallos y pecíolos (Streeter, 1980).

La velocidad de crecimiento de leguminosas en cultivo de tejidos a los que se les agregó trehalosa es pobre, si se compara con el crecimiento en sacarosa. Lo anterior indicaría que la trehalosa no es simplemente una reserva de carbono para cualquiera de los organismos involucrados en la simbiosis Leguminosa –Rhizobium (Mellor, 1992).

En los nódulos la trehalosa parece no ser una fuente de energía importante para la fijación de nitrógeno, ya que hasta el 80% de la trehalosa se recupera en la fracción citosólica vegetal Además, la gran variación en la acumulación de trehalosa por las diferentes cepas parece argumentar en contra del uso de este disacárido en el metabolismo energético del nódulo.

En plantas de alfalfa sometidas a estrés salino se encontró en las condiciones iniciales (0.0 M NaCl) que la concentración de trehalosa en el citosol de las células vegetales es de 101 nmol.g-1 peso fresco de nódulo; en el bacteroide de 8 nmol.g-1 peso fresco de nódulo e interesantemente, también en raíz se detectó trehalosa en una concentración de 83 nmol.g-1peso fresco.

Mientras que a mayores concentraciones de NaCl (0.15 M) se observó un incremento en las concentraciones de trehalosa, alcanzando en el citosol de las células vegetales 196 nmol.g-1peso fresco de nódulo; en el bacteroide 35 nmol. g-1 peso fresco de nódulo y en la raíz 288 nmol.g-1 peso fresco (Fougére et al., 1991). Es importante señalar que en condiciones de estrés la mayor acumulación de trehalosa se registró en la raíz. Así la trehalosa puede desempeñar un papel insospechado en la simbiosis.

Aunque el papel de la trehalosa en la simbiosis Rhizobium/leguminosa aún no es muy claro, basándose en las evidencias existentes es posible proponer un papel general de la trehalosa: como reserva o almacenamiento en forma de carbono reducido (Elbein, 1974; Inoue y Shimoda, 1981 ), tolerancia a condiciones adversa como el estrés hídrico (Burleigh y Dawson, 1994; Farías-Rodríguez et al., 1998b), la osmoregulación (Breedveld et al., 1991), recientemente se ha propuesto que la trehalosa puede estar involucrada en el proceso de infección de Rhizobium y el mantenimiento la integridad de la membrana peribacteroidal (Streeter, comunicación personal).

II.5 MECANISMO DE ACCION DE LA TREHALOSA.

Entre los diferentes tipos de estrés que pueden afrontar los organismos, la deshidratación es el más común y el mejor entendido. Los principios físicos del mecanismo del daño por una extrema deshidratación son los mismos, sin importar que el organismo sea un animal, microbio o planta. Por lo tanto, los mecanismos por los cuales los organismos sobreviven en anhidrobiosis (vida sin agua) tienen características comunes. Una de estas características es la acumulación de azúcares sobresaliendo la trehalosa (Araujo, 1996).

La trehalosa en un disacárido encontrado en altas concentraciones (>20 % del peso seco) en muchos organismos que naturalmente sobreviven a la deshidratación, fenómeno conocido como anhidrobiosis. Tales organismos incluyen, por ejemplo, levaduras, plantas de la resurrección, quistes de algunos crustáceos, muchas bacterias, y algunos animales microscópicos (Crowe y Crowe, 2000). La acumulación de grandes cantidades de trehalosa por las células anhidrobióticas se ha relacionado directamente con esta tolerancia.

El mecanismo por el cual la trehalosa media la tolerancia a la desecación no ha sido completamente determinado, pero parece involucrar efectos sobre proteínas y membranas (Guo et al., 2000). La "Hipótesis del reemplazo del agua", es la más aceptada para explicar el mecanismo de acción de la trehalosa (Crowe y Crowe, 2000). En general, se cree que la trehalosa reemplaza la cubierta de agua alrededor de las macromoléculas, previniendo el daño causado durante la deshidratación. En las membranas, la trehalosa reemplaza a las moléculas de agua alrededor de las cabezas polares de los fosfolípidos en el estado de desecación.

Los ocho grupos hidroxilo de la trehalosa son capaces de formar puentes de hidrógeno con los grupos carbonil o fosfato de los lípidos, de tal manera, se cree que este azúcar ocupa un espacio entre las moléculas de lípidos (Crowey y Crowe, 1984a, b; Crowe et al., 1992; Mazzobre et al 1997; Potts, 1994). La trehalosa puede disminuir la temperatura de la fase de transición de la membrana, de tal manera que permanece en un estado cristalino líquido.

Se supone que esto previene el rompimiento de la membrana durante la rehidratación, por lo tanto preservando la viabilidad de las células. Adicionalmente, la trehalosa tiene una alta temperatura de transición vítrea, lo que provoca al. 2000), el cual se define cuando la viscosidad del citosol alcanza un punto en el cual se evita la difusión del agua, y la solución asume las propiedades mecánicas de un plástico sólido.

Los beneficios de la formación de este estado para un organismo que enfrenta condiciones de deshidratación son muchos. Dicho estado excluye las reacciones químicas que requieren difusión. Lo anterior asegura la estabilidad de la célula durante el período de latencia, previene el colapso de las células, permiten la continuidad de los puentes de hidrógeno en la interfase entre el citosol vítreo y la membrana hidrofilica de las células (Koster, 1991 ;Mazzobre et al., 1997; Williams y Leopold, 1989).

La sequía incide directamente en la fusión y en la fase de transición lipídica. Se ha demostrado que la trehalosa inhibe la fusión entre vesículas, pero que dicha inhibición aparentemente no es suficiente para preservarlas. Por esta razón, se ha propuesto que la estabilización observada puede ser explicada si se analizan las fases de transición. Cuando las membranas fosfolipídicas están hidratadas, las moléculas de agua se intercalan entre los grupos fosfato.

Posteriormente, cuando el agua es removida se incrementa el contacto entre las cabezas polares, lo cual ocasiona que aumenten las interacciones de Van Der Waals, conduciendo a un incremento de la temperatura de la fase de transición (T m)'. Bajo estas condiciones, los lípidos se encuentran en una fase de gel, permitiendo que las membranas se dañen al momento de la rehidratación, ya que ocurre separación de ciertos constituyentes de éstas. Se ha demostrado que la trehalosa previene este rompimiento al evitar que se incremente la temperatura de la fase de transición, permitiendo así que los lípidos se mantengan en un estado cristalino en ausencia de agua (Crowe et al., 1992; Leslie et al., 1995; Potts, 1994).

Con respecto a las proteínas, se ha demostrado que la trehalosa inhibe su desnaturalización mediante la exclusión del agua de la superficie de la proteína cuando las células están deshidratadas, probablemente reemplazando las moléculas de agua que contribuyen al mantenimiento de un plegado adecuado en la estructura de la proteína, interactuando mediante puentes de hidrógeno de sus grupos OH y los residuos polares en las proteínas manteniendo la estructura terciaria de estas y evitando por lo tanto su desnaturalización.

Así, la trehalosa preserva las membranas y proteínas en un estado físico similar alas condiciones cuando están completamente hidratadas, sugiriendo que los grupos hidroxilos de la trehalosa pueden interactuar físicamente con los residuos polares de estos componentes celulares (Crowe y Crowe, 2000)

II. 5 LA TREHALOSA EN LA TOLERANCIA AL ESTRÉS HIDRICO EN LAS PLANTAS.

Muchas plantas, durante su desarrollo se enfrentan a diversos tipos de estrés, dentro de los cuales destaca la sequía. El tipo de estrés hídrico puede variar desde pequeñas fluctuaciones en la humedad atmosférica hasta un déficit extremo de agua en el suelo. Con excepción de las plantas que toleran una extrema deshidratación celular, la adaptación al estrés hídrico involucra la reducción de la deshidratación celular mediante mecanismos de prevención o tolerancia.

El estrés hídrico en la planta es el resultado de la reducción en el potencial hídrico del suelo, el cual usualmente ocurre progresivamente y la fluctuación en la velocidad de evaporación, la cual ocurre con cambios diarios en radiación neta y humedad. El mantenimiento de la turgencia ha sido observado como una respuesta a cambios en el potencial hídrico.

Existe una acumulación de solutos durante la reducción del potencial hídrico, cuyas concentraciones varían de acuerdo a la especie y el tejido de la planta y tienen un papel importante en la osmoregulación. Los principales constituyentes son los azúcares y los aminoácidos (Morgan, 1984). Se ha demostrado que ciertos azúcares tienen un papel central .en la protección contra las sequías. La importancia de azúcares solubles en la tolerancia a este tipo de estrés en las plantas, ha sido sugerida por estudios en los cuales la presencia de azúcares particulares se correlacionan con el incremento de la tolerancia a la desecación (Ingram y Bartels, 1996).

In vitro, la trehalosa es un protector efectivo contra el estrés y reduce el daño por congelamiento de células de plantas criopreservadas (Bhandal, 1985 en MüIler et al., 1995). En vista del bien documentado potencial de la trehalosa para proteger las proteínas y membranas (Crowe et al., 1992; Mazzobre et al., 1996), y el hecho que muchos grupos de organismos incapaces de mantener un medio interno constante acumulen trehalosa bajo condiciones de estrés (Breedveld et al., 1991; Welsh et al., 1991; Potts, 1994), es intrigante que muchas plantas vasculares carezcan de trehalosa, aún cuando son sujetas a cambios severos de las condiciones externas o a una completa desecación (MüIler et al., 1995). La sacarosa, que se cree reemplaza a la trehalosa en las plantas superiores, se requiere en cantidades mucho más grandes para tener un efecto similar. Por lo tanto, probablemente las plantas con la capacidad de acumular trehalosa puedan tener una mayor resistencia bajo condiciones de estrés (MüIler et al., 1995). Por ejemplo, Mirothamus flabellifolia, una angiosperma tolerante a la sequía que acumula trehalosa.

En plantas transgénicas de tabaco, a las cuales se les insertó el gen de la trehalosa-6-fosfato sintasa, se observó una acumulación de trehalosa (0.17 mg . g-1) en las hojas, dicha acumulación se vio relacionada con un cambio dramático en la resistencia de las plantas a la sequía. Las bajas concentraciones del azúcar condujeron a postular que esta actúa dentro de un mecanismo de transducción de señales hasta ahora no identificado, pero que interviene con el metabolismo de los carbohidratos en la planta (Romero et al., 1997).

Por otra parte, la producción de fríjol en México se da principalmente bajo condiciones de temporal, donde se tienen altas posibilidades de que el cultivo se encuentre bajo sequía. Adicionalmente, el frijol es una planta C- 3 lo cual la ubica como altamente sensible a la sequía. Sin embargo, diferentes estudios en México sugieren que esta planta posee un mecanismo de tolerancia a la sequía (Farías-Rodríguez, 1998a). El frijol en México se cultiva desde hace 6000 á 7000 años y la evolución de esta especie probablemente ha sido paralela a la de su correspondiente microsimbionte, por lo cual existe gran diversidad de cepas nativas de Rhizobium. Además, el fríjol se cultiva prácticamente en todo el país y la población de cepas nativas es alta en casi todos los suelos de México, especialmente en las regiones productoras de frijol, donde las poblaciones de rizobios nativos ascienden hasta lOs células por gramo de suelo, con predominio de cepas inefectivas (Castellanos et al., 1995a).

Adicionalmente, estudios en donde se propuso la selección de cepas de alta competitividad, indican que solamente en cuatro de cada diez experimentos la inoculación tiene éxito, ya que al introducir al campo cepas de excelente comportamiento en condiciones controladas, no reproducen su alta competitividad y muestran un pobre comportamiento (Castellanos et al., 1995a). Una explicación a lo anterior es que la cooperación metabólica entre los simbiontes pueda ir más allá de la fijación biológica de nitrógeno (Quispel, 1988; Long, 1989).

Así, la indicación de que la nodulación y la acumulación de trehalosa en las leguminosas puede tener un papel en la tolerancia a la sequía, proviene de las observaciones de plantas sin inocular de varios cultivares de frijol, las cuales exhiben en comportamiento similar: una pobre tolerancia a la sequía. Sin embargo, los cultivares Canario y F38, al ser nodulados con cepas nativas, mostraron altas concentraciones de trehalosa (0.5 y 3.1 mg.g-1 nódulo respectivamente). Las concentraciones de trehalosa en los nódulos se incrementaron bajo condiciones de sequía (3.4 y 10.4 mg.g-1 nódulo) y estos cultivares mostraron una excelente resistencia a la sequía. Contrariamente, en los nódulos del cultivar Flor de Mayo Bajío la acumulación de trehalosa bajo riego fue de 0.9 mg.g-1 nódulo, estos niveles no aumentaron significativamente en la sequía (1.6 mg.g-1 nódulo) mostrando una alta sensibilidad al estrés. Esta es la mejor prueba hasta ahora, que producción simbiótica de trehalosa puede beneficiar a la planta hospedera incrementando su tolerancia al estrés (Farías-Rodríguez, 1998 a).

Agradecimientos. A la coordinación de la investigación científica de la UMSNH por el apoyo con el proyecto 2.7 (2005-2006) por las facilidades para su publicación.

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1Microbiologia ambiental Centro de Investigaciones y Estudios Avanzados. IPN, Unidad Irapuato, Irapuato, Guanajuato, México.

2Instituto de Ecología, Universidad Nacional Autónoma de México. México, D.F.

3Ecología microbiana

*autor correspondiente

Instituto de Investigaciones Químico Biológicas. Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, Morelia, Michoacán, México