Organismos genéticamente modificados (OGMS): detección y cuantificación (página 2)

Detección de OGMs.

El aprovechamiento en campo de los beneficios de la biotecnología vegetal implicó inmediatamente la necesidad de implementar procedimientos de campo y laboratorio para poder discriminar mercaderías conteniendo un nivel de OGM superior a un umbral determinado, de aquellas que estaban por debajo. Con el paso del tiempo se ha avanzado sensiblemente en una serie de aspectos que han hecho evolucionar en este sentido (http://www.acpa.org):

• Se han desarrollado protocolos de purificación de ADN y de PCR para aplicar a gran escala.
• Los métodos de PCR han evolucionado hacia técnicas cuantitativas (PCR en Tiempo Real).
• Se han desarrollado técnicas inmunológicas y juegos diagnósticos específicos de fácil aplicación.
• Existe más información molecular sobre los eventos y los cebadores específicos correspondientes.
• Se han desarrollado y aplicado programas de trazabilidad e identidad preservada para la característica ¨genéticamente modificado¨.
• Se discuten protocolos y materiales de referencia a nivel de normas de CODEX Alimentario, ISO (Internacional Standards Organization) e ISTA (Internacional Seed Testing Asociation), entre otras.

La detección de OGMs o derivados de OGMs puede ser realizada detectando una molécula (ADN, ARN o proteína) que esté asociada específicamente o derivada de una modificación genética de interés (Van den Eede y cols., 2000).

Sin embargo, la mayoría de los métodos no están dirigidos a detectar proteínas o ARN. Esto tiene varias razones:

1. El ADN puede ser purificado y multiplicado en millones de copias en pocas horas, mediante la PCR.
2. La multiplicación del ARN y proteínas es un proceso más complicado y lento.
3. El ADN es una molécula muy estable, mientras que el ARN es inestable.
4. La estabilidad de una proteína varía y depende del tipo de proteína.
5. Normalmente existe una correlación linear entre la cantidad de OGM y ADN, si el ADN genéticamente modificado es nuclear, pero no, si este es extranuclear.
6. Normalmente no existe esta correlación entre la cantidad de OGM y proteína/ARN.
7. La modificación genética se realiza a nivel de ADN y hasta el presente, el ADN modificado genéticamente es nuclear en todos los OGM comercializados.

Los protocolos analíticos son muy sensibles, ya que detectan un gen en decenas de miles de genes del genoma, o una nueva proteína entre varios miles de proteínas. Actualmente, los protocolos pueden detectar un evento o grupo de eventos en un cultivo en particular, pero ninguno puede detectar en un único ensayo todos los eventos, por eso no se puede asegurar que una muestra está libre de OGM, sólo se puede asegurar que está libre de los eventos para los cuales se hayan realizado los análisis pertinentes (Tozzini, 2004).

La base de cada tipo de tecnología de detección de OGM es buscar la diferencia entre la variedad no modificada y la planta transgénica. Existen tres metodologías para detectar modificaciones genéticas en los cultivos tales como soya, algodón, maíz, etc. Una es mediante la diferenciación fenotípica. La otra es a nivel de proteínas por técnicas inmunológicas (tiras reactivas o ELISA), las cuales detectan la presencia de proteínas específicas, por la unión específica entre el antígeno expresado y el anticuerpo blanco. El otro método está basado en la detección a nivel de ADN, mediante PCR. Estos dos últimos métodos muestran la ausencia o presencia de un OGM en la muestra, pero también pueden dar alguna indicación de cantidad (porcentaje) en una muestra tratada (Fagan y cols., 2001; Holst-Jensen y cols., 2003).

Detección fenotípica.

Por lo general, las plantas genéticamente modificadas que se encuentran actualmente en campo presentan la característica de resistencia a herbicida y/o a insectos. La evaluación de la resistencia a insectos de una planta se realiza mediante ensayos biológicos complejos y de larga duración, por eso, esta no es una alternativa práctica para el análisis de granos. Sin embargo, la resistencia a herbicidas sí puede ser evaluada mediante ensayos sencillos en laboratorio y en campo (Tozzini, 2004), pudiendo observarse los resultados de la evaluación de la diferencia fenotípica entre una planta genéticamente modificada resistente a herbicida y la planta natural.

Detección inmunológica.

Los OGMs están caracterizados por un genoma alterado, el cual puede llevar a la expresión de una nueva proteína; por lo tanto, los alimentos modificados genéticamente pueden ser identificados detectando la presencia de la nueva proteína expresada, codificada por el material genético (Lipp y cols., 2001).

Los ensayos inmunológicos para la detección de OGM, básicamente se desarrollan con dos formatos: las tiras reactivas o strips de flujo lateral y el ELISA (ensayo de inmunodetección ligado a enzima).

Flujo lateral o lateral flow

En este formato se reúnen todos los reactivos en un soporte sólido y mediante el flujo por capilaridad de la muestra en solución se logra determinar la presencia o ausencia de una determinada proteína (análisis cualitativo). Este formato se ha aplicado exitosamente para la detección de un sinnúmero de moléculas de importancia en el diagnóstico veterinario y humano. El resultado de estas tiras es cualitativo (positivo o negativo) y la sensibilidad (o límite de detección) oscila entre 0.5% y 2% para determinados eventos y de 0.1% y 0.3% para otros.

En la banda de flujo lateral el anticuerpo de captura está unido directamente a uno de los extremos de la banda, mientras que el anticuerpo detector se encuentra sobre el extremo opuesto (seco, pero no unido de manera directa a la superficie de la banda). En este último extremo se adiciona la muestra de interés, la cual fluye junto con el anticuerpo detector en la dirección contraria. Si la proteína transgénica, a la cual reconoce de manera específica el anticuerpo de captura, se encuentra presente, los tres elementos reaccionan entre sí (el anticuerpo de captura con la proteína de interés y con el anticuerpo detector) formándose una banda colorida donde el anticuerpo detector se acumula. Si no es así, sólo reacciona el anticuerpo de captura con el anticuerpo detector, en una región más alejada, indicando que la prueba fue realizada correctamente (Stave, 1999).

A pesar de ser un ensayo cualitativo, a partir de los resultados se pueden hacer cálculos estadísticos para determinar la probabilidad de que la muestra tenga un contenido de granos genéticamente modificados (GM), inferior a un determinado valor para un nivel de confianza dado. Para esto, es imprescindible conocer la sensibilidad del strip expresada en granos GM/granos no GM y trabajar con submuestras que no excedan este número para evitar resultados falsos negativos (http://www.acpa.org).

Obviamente la gran ventaja de esta metodología de análisis radica en su simplicidad y rapidez, (Tabla 1), por eso se le utiliza en campo como control inicial en la conformación de conjuntos, que luego serán analizados por algún método cuantitativo, o como primer control a la entrada de un proceso o industria (http://www.acpa.org).

Table 1: Características de las tiras de flujo lateral (Stave, 1999; Lin y cols., 2001; Spiegelhalter y cols., 2001; Ahmed, 2002).

Ensayo de inmunodetección ligado a enzima (ELISA).

El método de ELISA se fundamenta en el uso de anticuerpos específicos para capturar a la proteína de interés. Este procedimiento es capaz de discriminar proteínas específicas presentes en el producto bajo análisis, de entre cientos de proteínas distintas presentes en la misma muestra. El método de ELISA es extremadamente sensible, versátil y cuantitativo. En general, este procedimiento, incluye el uso de anticuerpos que se unen de manera específica a las proteínas de interés (llamados anticuerpos primarios), por ejemplo a aquellas que son sintetizadas como resultado de la introducción del nuevo ADN (llamadas proteínas transgénicas). Una reacción colorimétrica o fluorimétrica desencadenada por un segundo anticuerpo (o anticuerpo secundario) permite visualizar y medir la cantidad de la proteína de interés. El resultado se compara con la señal emitida por concentraciones conocidas de la misma proteína, por lo que el ensayo no solo es cualitativo, si no también cuantitativo. Una restricción para el uso de pruebas de ELISA en la detección de proteínas transgénicas es la desnaturalización de estas durante el procesamiento del alimento. Los resultados de esta prueba se estima que son confiables en un 95% de los casos sometidos (Ausubel y cols., 1995). Todos los ELISAs detectan un rasgo genéticamente modificado, pero no todos los rasgos pueden ser detectados o diferenciados por un ELISA (Tabla 2) (Griffiths y cols., 2002).

Tabla 2: Características de los métodos ELISA en la detección de OGM (Stave, 1999; Lin y cols., 2001; Spiegelhalter y cols., 2001; Ahmed, 2002).

Otro formato para inmunoensayos

Otro formato para inmunoensayos es el uso de partículas magnéticas como superficie sólida de soporte. Las partículas magnéticas están cubiertas con un anticuerpo de captura y la reacción es llevada a cabo en un tubo de ensayo. Las partículas con las proteínas unidas se separan de las proteínas no unidas en solución, utilizando un magneto. La ventaja de este método está dada por una cinética superior, pues las partículas quedan libres para moverse en la solución y se incrementa la precisión, permitiendo la uniformidad de las partículas (Ahmed, 2002).

Métodos basados en la detección del ADN introducido

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): La PCR permite la amplificación de un fragmento de ADN de interés con una alta sensibilidad y especificidad. Fragmentos de ADN con una longitud de 100pb hasta 1000pb son amplificados con la ayuda de una enzima polimerasa y dos cebadores. A través de una serie de ciclos térmicos diferenciales la enzima ayuda a la replicación y amplificación exponencial de la secuencia flanqueada por los cebadores. Finalmente el fragmento amplificado está sujeto a un gel estándar de electroforesis, cuya presencia puede ser detectada basada en la determinación de su talla (Atlas y Bej, 1994).

El blanco más prometedor para el análisis del material transgénico es el ADN insertado. Esta molécula es mucho más estable que las proteínas y está presente en las mismas concentraciones en todo el OGM. Aunque es imposible detectar a moléculas individuales de ADN, estas pueden ser amplificadas usando la técnica de la PCR. Este método permite la amplificación de secuencias específicas del ADN en pocas horas, facilitando el análisis cualitativo y cuantitativo de dichas secuencias por medio de técnicas de laboratorio comunes (http://www.bio.davidson.edu).

Cada estrategia basada en la detección por PCR depende de un conocimiento detallado de la secuencia del ADN transgénico y de la estructura molecular del OGM, con el objetivo de seleccionar los cebadores apropiados (Roux, 1995). Varios ingredientes de alimentos, modificados genéticamente, han sido analizados utilizando PCR: soya (Meyer y cols., 1996); trigo (Allman y cols., 1993); canola y papa (Jongedijk y cols., 1992); arroz y papaya (Yang y cols., 1996); alfalfa (Blake y cols., 1991); maíz, azúcar de remolacha y tomate (Waiblinger y cols., 1997).

El ADN que ha sido introducido en el cultivo transgénico contiene tres elementos: El promotor, el gen que confiere el nuevo rasgo de interés agronómico y la señal de paro de este gen. La PCR puede usarse para detectar a cualquiera de estos elementos, siempre y cuando el cebador utilizado (cuya secuencia se diseña a partir de una secuencia conocida de los elementos indicados) sea complementario a las secuencias buscadas. El primer ciclo de la PCR "fabrica" así la secuencia deseada. Los ciclos subsecuentes multiplican esta secuencia. Los fragmentos de ADN amplificados son separados en un gel por tamaño, el cual se tiñe con un compuesto que fluoresce cuando se expone a la luz ultravioleta, lo que permite visualizar a los fragmentos de DNA obtenidos (http://www.bio.davidson.edu, http://people.ne.mediaone.net).

El procedimiento de la PCR se aplica rutinariamente en el caso de alimentos no procesados, en los que el material genético se encuentra intacto. Su selección se fundamenta en su extrema sensibilidad que, bajo condiciones experimentales óptimas, permite la amplificación de más de un billón de copias de la secuencia deseada a partir de una sola copia del ADN original (Tabla 3). En ocasiones su uso se puede ver limitado en el caso de los alimentos procesados, donde es más difícil aislar cantidades suficientes del ADN intacto y donde el material genéticamente modificado de distintas variedades pudiera encontrarse mezclado entre sí. Los resultados de esta prueba se estima que son confiables en un 99.9% de los casos sometidos (http://www.bio.davidson.edu).

Existen tres factores esenciales que determinan el éxito del método de detección de OGM mediante PCR. Estos son la cantidad de ADN extraído, la calidad, la cual se relaciona con la cantidad de daño que ha sufrido el ADN durante los pasos de procesamiento del alimento, antes de la purificación y la pureza, la cual refleja la cantidad de contaminantes purificados con el ADN (Griffiths y cols., 1992).

Una extracción optimizada del ADN resulta fundamental para asegurar la presencia y calidad del material a amplificar por PCR (Fig. 1) (Tabla 3). Este aspecto resulta particularmente importante en el análisis de alimentos que han sido altamente procesados, pues el ADN puede degradarse durante el procesamiento, particularmente por tratamiento térmico en presencia de agua, por lo que la cantidad de fragmentos que aún contienen el blanco de interés intacto, puede decrecer a medida que el alimento es procesado. En adición el método de purificación de ADN utilizado debe remover todas las sustancias inhibidoras presentes en la muestra (Griffiths y cols., 1992).

Fig. 1: Organigrama de análisis de un OGM por PCR.

Table 3: Características generales del PCR en la detección de OGMs (Griffiths y cols., 1992).

Comparación de las técnicas de detección de proteínas y detección de ADN.

Las principales diferencias entre los métodos de detección de proteínas (ELISA), los cuales son preferidos en los Estados Unidos y las técnicas basadas en el ADN (PCR), las cuales son preferidas en Europa, se resumen en la Tabla 4.

Tabla 4: Principales diferencias de los ensayos basados en la detección de ADN y en la detección de proteínas (Gryson y cols., 2005).

Métodos cuantitativos utilizando PCR.

En principio la cuantificación basada en PCR puede ser desarrollada después de la culminación del PCR (análisis del punto final), mediante el llamado PCR cuantitativo (Raeymackers, 1993) o durante el PCR (análisis en tiempo real) que analiza la cantidad de producto sintetizado durante la PCR, estimado directamente por la medida de la fluorescencia en la reacción de PCR (Studer y cols., 1998; Jordan, 2002).

Con la introducción de la legislación sobre el mandato de marcaje de productos alimenticios que contengan OGMs se ha incrementado la demanda de laboratorios de testaje que desarrollen o adopten métodos cuantitativos de detección. A partir de los esfuerzos realizados para lograr el etiquetado de los alimentos genéticamente modificados, como ingredientes de los alimentos, los métodos de detección cuantitativa, tales como PCR cuantitativo (QC-PCR) y PCR en tiempo real (Real-Time PCR) se aplican en los laboratorios oficiales de control de alimentos (Hubner y cols., 2001). Aunque los OGMs aprobados para el consumo humano han sido analizados con pruebas científicas rigurosas y han sido fuertemente juzgados; el etiquetado permite que los consumidores tengan la opción de seleccionar el alimento que deseen (Ahmed, 2002).

¿Cómo detectar OGMs en el futuro?

En un futuro cercano serán muchos los eventos aprobados y liberados en el mundo. En diversos ámbitos se está discutiendo la posibilidad de introducir secuencias no codificantes en el genoma de las plantas junto con los genes de interés de una modificación genética, para generar blancos de detección universales frente a la diversidad de eventos que habrá en el futuro (Van den Eede y cols., 2002).

Frente a esta perspectiva de diversidad de modificación genética y tan heterogénea mundialmente, la nueva tecnología de los microchips, microarrays o micromatrices, podría permitir detectar y cuantificar en un solo ensayo la presencia de cientos o miles de secuencias.

A grandes rasgos, un microchip es un soporte sólido de pequeño tamaño, en el cual se han fijado puntos ordenados y microscópicos de secuencias de simple cadena conocidas. Estas secuencias tienen la capacidad de hibridar con su ADN complementario, y si este está marcado con un fluoróforo, el punto de la micromatriz quedará marcado. Luego de la hibridación con la muestra de ADN marcado, un aparato de barrido especial realiza la lectura punto por punto, identificando los puntos marcados y por lo tanto las secuencias que están presentes en la muestra bajo análisis.

Finalmente hay que mencionar que los materiales genéticamente modificados que no mantengan una equivalencia sustancial con los materiales tradicionales, por definición, van a ser segregados e identificados de acuerdo a la nueva característica de valor y serán producidos y etiquetados de manera tal que se asegure su pureza, calidad y su valor de uso diferencial.

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Autor:

Belkis Corona,

País y ciudad de nacimiento: La Habana, Cuba

Estudios realizados: Licenciatura en Microbiología, Master en Microbiología Veterinaria, PhD en Microbiología Veterinaria.

Profesión: Investigador, Biología Molecular

Odalys Uffo, Siomara Martínez

Grupo de Biología Molecular, División de Microbiología.

Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria, Apartado 10, San José de las Lajas, La Habana, Cuba.

La Habana, Cuba, Septiembre 2007