Separación por electroforesis

Enviado por mireya XXX

Práctica No. 2

Resumen

La finalidad de esta práctica fue lograr la separación del DNA a partir de un vegetal (brócoli), por medio del método de electroforesis.

Las proteínas tienen la propiedad de ser anfotéricas; es decir, son aquellas moléculas que poseen un extremo hidrofílico, o sea, que es soluble en agua, y otro hidrófobo, o sea que rechaza el agua.

La electroforesis es un método empleado para separar de proteínas por medio de su tipo de carga; basado en su punto isoeléctrico, haciendo migrar las proteínas a través de un campo electromagnético regulado por el voltaje del equipo.

Se combinan con los iones hidrógeno y con otros iones presentes en la disolución, dando lugar a la carga neta de la molécula. A la concentración de iones hidrógeno, o al pH, para el cual la concentración del ion híbrido de una proteína es máxima y el movimiento neto de las moléculas de soluto en un campo eléctrico es prácticamente nulo se denomina punto isoeléctrico.

No se pudieron obtener los resultados deseados ya que no sé mostró en la cámara de correr de electroforesis ningún tipo de movimiento hacia el polo positivo,( que era al que se esperaba el sentido del movimiento); Debido a que la muestra de brócoli era un poco vieja, lo que interfirió en la elaboración de la practica para poderse llevar a cabo correctamente.

Introducción

El gran número de proteínas que existen, su gran variedad de actividades biológicas y las diferencias químicas existentes entre las proteínas homólogas de los distintos organismos determinan que la extracción, la purificación y la caracterización de las proteínas constituyan un punto central en toda investigación bioquímica.

Los métodos iniciales de aislamiento de las proteínas fueron empíricos, lentos y muy laboriosos; sin embargo, con los nuevos métodos asequibles en la actualidad. No existe un procedimiento único, o un conjunto de procedimientos mediante los cuales todas y cada una las proteínas puedan aislarse, sino que normalmente se sigue una secuencia de etapas de separación para cualquiera proteína, que dará por resultado un grado de purificación elevado y un alto rendimiento.

También es necesario un procedimiento para liberar las proteínas en forma soluble de la célula intacta o de la estructura de tejido sin provocar pérdidas de actividad. Normalmente se emplea la trituración mecánica u homogenización de los tejidos vegetales para romper la pared celular y liberar los contenidos celulares, los cuales pueden ser valorados después para determinar su contenido en la proteína deseada. A veces la pared celular puede ser debilitada o lisada por tratamientos con ciertas enzimas. Si la proteína deseada se halla por casualidad asociada a una membrana o un orgánulo membranoso, debe ser extraída de allí en forma soluble, lo cual puede conseguirse, frecuentemente, por simple extracción con agua o bien por una ruptura mecánica o sónica de las membranas, y también mediante el empleo de detergentes para lograr la desintegración de la estructura membranosa

La separación de proteínas sobre la base de su carga eléctrica dependen en último término de sus propiedades ácido-básicas, las cuales se hayan determinadas en gran medida por el numero y el tipo de grupo R ionizables de sus cadenas polipeptídicas. Puesto que las proteínas difieren en composición aminoácido y secuencia, cada proteína posee propiedades ácido-básicas características. Los principios implicados en la separación electroforética de las proteínas son mejor comprendidos si en primer lugar se consideran la curva de valoración ácido-básica de una proteína globular de contenido aminoácido conocido.

Hay varias formas diferentes de electroforesis, también llamada ionoforesis, útiles para el análisis y la separación de proteínas. El prototipo de todos los métodos modernos es la electroforesis libre o de frente móvil, desarrollada en primer lugar por A. Tiselius, en Suecia, en los años 1930. Las proteínas por tanto emigran mucho más lentamente en un campo eléctrico que los iones pequeños tales como Na + o Cl-, simplemente debido a que posee una relación mucho más pequeña de la carga o masa (1). En la electroforesis, libre, una disolución tamponada de la mezcla de proteínas se coloca en una célula de observación de forma de U mayúscula, depositando una capa de tampón puro sobre la disolución de proteína. La célula se mantiene sumergida en un baño a temperatura constante, aislada de vibraciones, y se establece un campo eléctrico entre los electrodos; Las proteínas cargadas negativamente se desplazan hacia el ánodo y las que poseen carga positiva hacia el cátodo. (2)

Objetivo General

Lograr llevar a cabo la electroforesis con el DNA de la muestra de brócoli.

Objetivos Específicos

Conseguir la extracción del DNA del brócoli.
Observar si la muestra se movió al polo negativo de los electrodos (que en este caso es lo que se espera).
Aprender a usar el equipo de electroforesis.

Material y Métodos

A) Materias Primas

Espinacas (1/2 taza), cebolla o brócoli.

Agua de la llave (la necesaria).

B) Material De Laboratorio

1 licuadora.

1 colador.

1 cuchara.

1 matraz Erlenmeyer.

1 micropipeta.

3 tubos de 50 ml.

1 palito de madera.

Sustancia

Alcohol (etanol 96% o isopropanol 96%)

Detergente (30 ml).

Enzimas (pizca de ablandador de carne).

Sal de mesa

C) Equipo

Equipo de Electroforesis. Se uso para separar las proteínas del DNA.

D) Métodos

Los pasos que realizamos para la elaboración de electroforesis fueron necesarios en la medida de que eran estrictamente indispensables, todos y cada uno, por ejemplo; Al licuar la muestra de brócoli (trituración mecánica), lo que se pretendió realizar fue un rompimiento de la pared celular para liberar los contenidos celulares al medio. Se añadió una pizca de sal, ya que era necesaria para formar el efecto buffer, cuyo objetivo es la unión al dominio hidrofílico de las proteínas, permitiendo la resolubilización al aumentar la carga de las proteínas, lo que ocasiona un término de repulsión electrostática proteína-proteína elevado (3), asi como evitar el cambio de PH. A continuación se añadió 10 ml aproximadamente de detergente, el cual precipita las poteínas (histonas) que estan unidas al DNA. El alcohol es para desnaturalizar las proteínas. El siguiente paso fue añadir una pizca de ablandador de carne para separar las histonas del resto de la cadena de DNA y finalmente se añadió alcohol a la solución, ayudando a que las proteínas se precipitaran, dejando en la superficie el DNA libre.

Desarrollo Experimental

1.- Cortar en pequeños trozos el brócoli.

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2.- Licuar a máxima velocidad por 15 segundos:

½ taza de muestra (brócoli).

1 taza de agua fría (200 ml).

Una pizca de sal (media cucharadita).

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3.- Colar la mezcla.

4.- Verificar cuánto volumen se obtuvo y agregar 1/6 de este volumen de detergente (para 150 ml de muestra, 30 ml de detergente). Revolver la mezcla con la cuchara.

5.- Dejar reposar por 10 min.

6.- Pasar la mezcla a tubos de ensayo (1/3 del volumen en cada tubo).

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7.- Añadir una pizca de ablandador a cada tubo.

8.- Agitar suavemente (por inversión 4 o 5 veces).

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9.- Añadir el alcohol lentamente por las paredes del tubo hasta que se formen dos fases iguales (v/v, 1:1).

10.- El DNA formará una hebra transparente. Usar un palito de madera para sacar las hebras de DNA del tubo.

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Diagrama De Flujo Para la electroforesis

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Procedimiento para electroforesis de DNA en gel de Agarosa (1%)

1.- Pesar 0.3 g. en matraz Erlenmeyer

2.- Añadir 30 ml de solución amortiguadora Tris Acetato EDTA (TAE) 1X

3.- Calentar en horno microondas hasta que se disuelva la agarosa totalmente (solución totalmente transparente).

4.- Dejar enfriar hasta 50 ºC.

5.- Colocar el peine en la charola y vaciar la agarosa evitando la formación de burbujas.

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6.- Dejar que el gel se solidifique a temperatura ambiente (˜ 30 minutos) el gel tomará una apariencia opaca.

Diagrama De Flujo Para la electroforesis

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Para cargar el gel:

1.- Colocar el gel dentro de la cámara de correr la electroforesis.

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2.- Añadir suficiente TAE 1X hasta cubrir completamente aproximadamente 0.5 cm sobre el gel.

3.- Cargar el equipo de electroforesis. Conectar los electrodos positivos (rojos) y negativos (negros) a los terminales correspondientes.

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5.- Prender el equipo, seleccionar el voltaje deseado (˜ 100 voltios). Si el equipo esta funcionando bien, entonces se podrá observar burbujas saliendo de los electrodos. Asegurarse de que las muestras están corriendo en la dirección correcta, hacia el electrodo positivo.

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6.- Correr la electroforesis hasta que las muestras se hayan movido entre la mitad y tres cuartos del plato de gelatina.

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Diagrama De Flujo Para la electroforesis

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Resultados y Discusión

La extracción del DNA del brócoli se logró llevar a cabo con éxito, ya que en la muestra se observaron las hebras de DNA suspendidas en la solución. De la muestra que se obtuvo de DNA se realizó la electroforesis dando resultados negativos, donde se observó que no fue posible la separación.

Esto se pudo deberse a que la muestra ya era muy vieja.

Conclusiones

Se pudo decir que el objetivo general no se cumplió debido a que la muestra de DNA que se uso fue muy pequeña, por lo cual el traslado de las proteínas al polo negativo del equipo de electroforesis nunca se ejecutó. Aunque a pesar de todo se lograron cumplir algunos objetivos específicos como fueron la extracción de DNA de la muestra de brócoli, así como se aprendió a utilizar el equipo y todos sus componentes, para la separación por medio de electroforesis.