Efecto de Inmersiones en Calcio Sobre Peteca en Limones Amarillos y Plateados, Cosechados Después de una Lluvia y Almacenados en Refrigeración (página 2)

MATERIALES Y MÉTODOS

Frutos de limonero cv. Génova, obtenidos del huerto "El Canelo", ubicado en la localidad de Mallarauco (33º45’ lat. Sur; 71º15’ long. Oeste), Región Metropolitana, Chile, se cosecharon con color amarillo y plateado, en  tres fechas consecutivas: 3, 6 y 9 días después de la primera  lluvia de la temporada, donde precipitaron 80 mm en 48 h.  La situación de cada una de estas fechas se analizó en forma separada.

Los limones se cosecharon al azar, con un calibre que fluctuó entre 125 y 140. La fruta se curó en el huerto durante dos días, y posteriormente se trasladó al Laboratorio de Poscosecha de la Facultad de Agronomía de la Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, donde se sometieron a una inmersión por 10 min en soluciones acuosas de Ca. Tanto los limones amarillos como los plateados se dividieron en tres grupos, a cada uno se le aplicó una solución de: nitrato de Ca en una concentración de 0,8%, cloruro de Ca al 0,5% y al 1% de producto comercial (Basfoliar Ca SL®, cuyo ingrediente activo es Ca en una concentración de 170 g L-1).  El tratamiento testigo correspondió a la inmersión de los frutos en agua.

Los limones tratados se almacenaron a 7 ± 1ºC con 95% de humedad relativa, por 0, 15, 30 y 45 días, evaluándose la presencia de peteca (expresado como porcentaje de frutos con el daño), en 15 limones por tratamiento con cuatro repeticiones cada uno.

El contenido de calcio total en la cáscara, se analizó a los 7, 15 y 45 días de almacenaje a la misma temperatura, para dar tiempo a la absorción del producto. Esta última variable se analizó por digestión ácida (Kalra, 1998), con un espectroscopio de absorción atómica (GBC Modelo 903, Melbourne, Australia) y se expresó en porcentaje de peso seco.

Además, se efectuó un análisis histológico de los frutos que manifestaron peteca. Para ello, muestras de 2 mm2 de cáscara con daño, se fijaron con una mezcla de formalina al 37%, alcohol etílico al 95% y ácido glacial acético, y se sometieron a un proceso de deshidratación con soluciones alcohólicas y posterior inclusión en parafina sólida.  Las muestras obtenidas se tiñeron con safranina al 1% y verde luz 0,2%, analizándose por microscopía óptica, con aumentos de 2,5X y 10 X (Nikon, Modelo AFX-35, Tokio, Japón) (Undurraga et al., 2002).

Para probar normalidad de los datos obtenidos se utilizó la prueba de Kolmogorov-Smirnov (Ostle, 1979). Para el análisis de la incidencia de peteca se utilizó un análisis de varianza para experimentos unifactoriales. En caso de existir diferencias entre los tratamientos, éstas se determinaron mediante la prueba de intervalos múltiples de Duncan (p ≤ 0,05).

Los porcentajes de Ca determinados se compararon sin realizar análisis estadísticos debido al bajo número de muestras disponibles para ello, por lo que sólo corresponden a tendencias.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Al comparar los limones plateados y amarillos en cada fecha de cosecha por separado, se observó que siempre los limones amarillos presentaron mayor incidencia de peteca que los plateados (Cuadro 1), demostrando con ello que los frutos de menor madurez presentan menor sensibilidad a este desorden, lo que concuerda con lo observado por Palma et al. (1998) y Undurraga et al. (2002).

Cuadro 1. Efecto de los días de cosecha después de una lluvia sobre el porcentaje de limones plateados y amarillos cv. Génova, afectados por peteca. Table 1. Effect of harvest days after rain on peteca rind pitting percentage in yellow and green skin lemons cv. Genova.

Es posible que los limones plateados, al momento de la cosecha, al estar más distantes de la etapa de senescencia, tengan sus paredes con mayor firmeza que un limón amarillo, que puede haber comenzado los procesos de degradación propios de la madurez de la fruta, lo que explicaría la incidencia de la peteca. Según Silva (1991), el Ca juega un rol importante en el proceso de senescencia vegetal, proceso que ocurre por una ruptura de la estructura celular. Duarte y Guardiola (1995) agregan que bajos niveles de Ca en la pared reduce su resistencia a la degradación enzimática, lo que conlleva a una desorganización de las paredes celulares y colapso del tejido. Por otra parte, la alta proliferación de oxalato de calcio es uno de los puntos más concurrentes en la descripción de este desorden (Palma et al., 1998), habiéndose observado que niveles de mayor acidez tienden a mantener solubles al ión oxalato y al ión calcio por separado, reduciendo así la formación de los cristales de oxalato de calcio (Libert y Franceschi, 1987; Ilarslan et al., 1997). Esto podría ser una de las causas por las cuales los limones plateados presentan menos manifestación de peteca que los limones amarillos.

De este trabajo se puede inferir, además, que existe un menor número de limones que manifiesten el daño a medida que la cosecha se realiza varios días después de la lluvia. Esto coincidiría con lo señalado por Razeto (1987; 2001), en el sentido que el desorden se induciría por efecto de la lluvia sobre la fruta, e iría disminuyendo en la medida que transcurre más tiempo entre la lluvia y la cosecha.

Comparando los limones plateados y amarillos en cada fecha de cosecha y tiempo de almacenaje por separado (Cuadro 2), se observó que, en general, no existe efecto significativo de la aplicación de las distintas soluciones de calcio sobre la presencia de peteca. Sin embargo, en el segundo período de almacenaje (día 15), en los limones amarillos cosechados tres días después de la lluvia, existió una diferencia significativa entre los limones tratados con solución de calcio al 1% de producto comercial que no presentaron peteca y el  testigo, que a esa fecha presentaba  casi el 27% de los limones afectados.

Cuadro 2. Porcentaje de peteca en limons cv. Génova sometidos a inmersión en distintas soluciones de calcio y almacenados a 7ºC por 0,15, 30 y 45 días. Table 2. Percentage of peteca rind pitting in lemon cv. Genova dipped in different calcium solution and stored at 7ºC for 0, 15, 30 and 45 days.

Sin embargo, este efecto no perduró en el tiempo, y finalmente, al día 45, no hubo diferencias entre los tratamientos. No obstante lo anterior, se puede observar que el tratamiento con solución de calcio al 1% de producto comercial presentó el menor número de limones afectados al día 45, aunque al nivel de significancia que se trabajó en este ensayo no resultó significativo. Es posible que la distribución del Ca dentro del fruto tenga que ver con la respuesta errática que muestra el desarrollo de la peteca (Retamales et al., 2000).

La falta de claridad del efecto del Ca podría deberse también, a que al ser un desorden fisiológico que comienza en precosecha, las aplicaciones de poscosecha serían tardías para detener el desarrollo de la peteca, la cual generalmente comienza en el albedo y posteriormente afecta al flavedo, momento en que el daño se hace visible en la superficie de la corteza del fruto (Khalidy et al., 1969).

Otra causa para la falta de efecto de los tratamientos podría ser que el tiempo de inmersión no haya sido suficiente para lograr una absorción efectiva, toda vez que la epidermis del limón presenta un alto contenido de sustancias oleosas hidrofóbicas como son los aceites esenciales (Seymour et al., 1993).

Del Cuadro 2 también se podría inferir que a medida que transcurre más tiempo entre la cosecha y la lluvia, es menor la incidencia de peteca, por lo cual éste sería un elemento que podría estar determinando la expresión de este desorden fisiológico, que aparece relacionado con condiciones de baja temperatura y tal vez elevada humedad del aire durante el período de maduración del fruto (Razeto, 1987, 2001). Se puede visualizar además, que al igual que en el Cuadro 1, los limones plateados manifiestan un menor desarrollo de este desorden.

El análisis del porcentaje de Ca en la cáscara del fruto (Cuadro 3) no sigue un patrón definido, no pudiendo asociarse con el desarrollo de la peteca.

Cuadro 3. Porcentaje de calcio en la cáscara de limones cv. Génova cosechados 3, 6 y 9 días, después de una lluvia. Table 3. Percentage of calcium in the rind of lemons cv. Genova harvested at 3, 6, 9 days after rain.

El contenido de Ca en los frutos testigos, tendió a aumentar principalmente en los limones amarillos, a medida que las fechas de cosecha se distancian  de la lluvia. Esto podría ratificar lo señalado por Hanson (1995), quien indica que la pérdida de agua en los frutos tiende a generar mayores concentraciones de calcio en los tejidos.

Esto pudo haber ocurrido en este ensayo, donde la cáscara de los frutos testigos cosechados cerca de la lluvia tuvo un mayor nivel de humedad, lo que diluyó el calcio presente. Este comportamiento no ocurrió en los otros tratamientos, por cuanto ellos recibieron aportes de Ca.

Los limones plateados se vieron poco afectados por la peteca (Cuadro 1). Al comparar el contenido de Ca de la corteza (Cuadro 3), se observó que en la mayoría de los casos, sobretodo en la segunda y tercera cosecha, los limones plateados tenían un menor contenido que los amarillos. Estos resultados concuerdan con otros reportados por la literatura (Undurraga et al., 2002).  Storey y Treeby (2002) encontraron que el nivel de Ca en la corteza de limones cv. Lisbon, fue significativamente más alto en las zonas del fruto afectadas por peteca que en regiones no afectadas. Esto podría ser la explicación de por qué los frutos amarillos tienen más propensión a este desorden. Sin embargo, los mismos autores señalan que no queda claro si el desarrollo de la peteca en el tejido podría ser la causa del incremento del Ca, o bien, que un aumento de este elemento sea la causa del desorden.

En el caso de los limones plateados, se puede observar que los frutos más afectados por peteca fueron los provenientes de la primera cosecha tratados con CaCl2 1% PC (Cuadro 2), a los 15, 30 y 45 días de almacenaje. El porcentaje de Ca de la cáscara de los limones plateados de este mismo tratamiento alcanza, en promedio, su valor más alto en la segunda cosecha, donde no se observó peteca, y los valores más bajos en frutos cosechados tres y nueve días después de la lluvia, a los 45 días de almacenaje, donde los valores de porcentaje de Ca fueron 0,63 y 0,67, respectivamente.  Es por esto que no es posible asociar claramente el nivel de Ca en la corteza con el desarrollo de peteca, toda vez que en el caso del CaCl2 1% PC, el valor más bajo de Ca en la corteza lo poseen limones que no presentaron peteca en la segunda cosecha.

Análisis histológico

En la Figura 1a se aprecia que en el tejido afectado con peteca las glándulas de aceite aparecen absolutamente destruidas y lignificadas.  El epicarpio también se encuentra fuertemente lignificado al igual que las células del mesocarpio. Las células que se encuentran entre ambos tejidos están absolutamente normales y son de formas muy regulares. No hay presencia de cristales d oxalato de Ca. En el tejido sano en tanto (Figura 1b), la glándula aparece intacta y las células presentan escasos síntomas de lignificación.

Figura 1 Corte histológico en cáscara de limones amarillos cv. Génova. Las flechas muestran: a) Glándula de aceite en tejido afectado por peteca; b) Glándula de aceite en tejido sano (2,5X – Tinción: safranina al 1% y fast green al 0,2%). Figure 1. Histological view of rind yellow lemons cv. Genova. The arrows show: a) Oil gland in rind affected with peteca rind pitting; b) Oil gland in normal tissue (2.5X – Dye: safranin 1% y fast green 0.2%).

En general, los tres tratamientos con soluciones cálcicas en limones amarillos mostraron una lignificación y destrucción de células del epicarpio o del flavedo y la formación de cristales de oxalato de Ca, principalmente drusas asociadas especialmente al sistema conductor floemático próximo al endocarpio, además las células del flavedo se encuentran invadidas de cristales romboidales y cilíndricos (Figura 2). Los limones plateados en tanto, también presentaron un grado de lignificación de las células vecinas a las glándulas de aceite y del epicarpio, sin embargo, los cristales de oxalato de Ca se encontraron repartidos en el mesocarpio (Figura 3).

Figura 2. Cristales de oxalatos de calcio (ver flecha) en limones amarillos tratados con nitrato de calcio 0,8% (10X – Tinción: safranina al 1%). Figure 2. Calcium oxalate crystals (see arrow) in yellow lemons treated with calcium nitrate 0.8% (10X – Dye: safranin 1%).

Figura 3. Células sanas ubicadas entre el mesocarpio y el epicarpio con escasa presencia de oxalatos. (2,5X – Tinción: safranina al 1% y fast green al 0,2%). Figure 3. Non damaged cells between mesocarp and epicarp, with few oxalates crystals (2.5 X – Dye: safranin 1% y fast green 0.2%).

En limones amarillos, las glándulas de aceite están destruidas y rodeadas de tejido lignificado, lo que es característico de presencia de peteca. En limones plateados se muestra que también las glándulas de aceite están destruidas, sin embargo, el grado de desorganización celular y de lignificación fue menor y por ello la manifestación de peteca también lo fue (Figuras 4, 5 y 6).

Figura 4. Glándulas afectadas por peteca (flecha entera) y lignificación (flecha punteada) en limones tratados con CaCl2 1% PC. a) Limón amarillo (10 X); b) Limón plateado (2,5X – Tinción: safranina al 1% y fast green al 0,2%). Figure 4. Oil gland affected with peteca rind pitting (entire arrow) and lignin (dotted arrow) in lemons treated with CaCl2 1% PC. a) Yellow rind lemon (10 X); b) Green rind lemon (2.5 X – Dye: safranin 1% y fast green 0.2%).

Figura 5. Glándulas afectadas por peteca (flecha entera) y lignificación (flecha punteada) en limones tratados con CaCl2  0,5% PC. a) Limón amarillo (2,5X); b) Limón plateado (2,5X) Tinción: safranina al 1% y fast green al 0,2%. Figure 5. Oil gland affected with peteca rind pitting (entire arrow) and lignin (dotted arrow) in lemons treated with CaCl2 0,5% PC. a) Yellow rind lemon (2.5 X); b) Green rind lemon (2.5 X) Dye: safranin 1% y fast green 0.2%.

 Figura 6. Glándulas afectadas por peteca (flecha entera) y lignificación (flecha punteada) en limones tratados con nitrato de calcio 0,8%. a) Limón amarillo (2,5 X); b) Limón plateado (2,5X) Tinción: safranina al 1% y fast green al 0,2%. Figure 6. Oil gland affected with peteca rind pitting (entire arrow) and lignin (dotted arrow) in lemons treated with calcium nitrate 0.8%. a) Yellow rind lemon (2.5 X); b) Green rind lemon (2.5 X Dye: safranin 1% y fast green 0.2%).

Los cristales de oxalato de Ca son compuestos que la planta elabora en forma natural para poder metabolizar elementos nocivos para ella como el ácido oxálico (Carvalhâo, 1997).  La formación de estos cristales utilizando Ca es la manera más eficaz de hacerlo, debido a que es un proceso físico que no requiere gasto de energía (Khalidy et al., 1969). Storey y Treeby (2002) no pudieron demostrar evidencia directa de que la frecuencia de cristales de oxalato de Ca fuera un factor causal del desorden peteca. Sin embargo, bajo estrés, cristales tipo rafídios aparecieron en células del flavedo en limones (Underhill et al., 1998), siendo similar a lo encontrado en el presente trabajo.

En el caso del "bitter pit" en manzanas, el desorden se produce cuando la cantidad de Ca disuelto no es suficiente para neutralizar los ácidos, por lo que requiere obtenerlo a partir del que se encuentra en membranas y paredes celulares, con la consecuente desorganización y posterior ruptura celular (Steenkamp, 1983, citado por Carvalhâo, 1997). Esto puede ser una situación similar para el caso de la peteca, en que el Ca de membranas y paredes contribuyan a neutralizar el ácido oxálico en las células generando el aumento de estos cristales de oxalato de Ca.

Es importante destacar que en ningún tratamiento del presente trabajo, incluyendo el testigo, se encontró lignificación en las células del albedo como sintomatología de peteca. Toda la lignificación se observó a nivel de glándulas de aceite y paredes epidérmicas. En la zona del albedo, en lugar de producirse la lignificación típica de una peteca se formaron grandes cantidades de cristales de oxalato de Ca.

CONCLUSIONES

Limones plateados cv. Génova cosechados a los 3, 6 y 9 días después de una lluvia son menos susceptibles a manifestar peteca que los limones amarillos.

Los tratamientos con solución de calcio no impiden la generación de peteca en limones amarillos cv. Génova al ser aplicados por inmersión en frutos cosechados a los 3 y 6 días después de una lluvia.

En esta investigación no fue posible determinar una relación entre la concentración de calcio en la cáscara de los limones y el desarrollo de peteca.

En los análisis histológicos de cáscara de limones, se observó que los frutos afectados por peteca mostraron sus glándulas oleosas lignificadas, desorganizadas y colapsadas.

Se observó también que limones tratados con soluciones de calcio presentan desorganización celular y formación de cristales de oxalato de calcio en forma de drusas; esta desorganización es mayor en los limones amarillos.

RECONOCIMIENTO

Esta investigación fue financiada por el Proyecto FONDECYT 1020 546.

LITERATURA CITADA

Bramlage, W. 1995. Calcio y desórdenes fisiológicos.p. 73-81. Symposio Internacional Calcio en Fruticultura, Talca, Chile. 17-18 octubre 1995. Universidad de Talca, Escuela de Agronomía, Talca, Chile.

Carvalhâo, F. 1997. El bitter pit de las manzanas, desarrollo y control. Fruticultura Profesional 86:12-20.

Casero, T. 1995. La nutrición cálcica en frutales. Fruticultura Profesional 71:45-55.

Comway, W.S., C.E. Samus, Ch. Wang, and J. Abbot. 1994. Additive effects of postharvest calcium and heat treatments on reducing decay and maintaining quality in apples. J. Am. Soc. Hortic. Sci. 119:49-53.

Duarte, A.M., y J.L. Guardiola. 1995. Aplicaciones del calcio en citricultura. Levante Agrícola 34(331):11-14.

Ferguson, I., and B. Drobak. 1988. Calcium and the regulation of plant growth and senescence. Hortscience 23:262-266.

Hanson, E. 1995. Translocación/Distribución del calcio en las plantas. p. 37-45. Symposio Internacional Calcio en Fruticultura, Talca, Chile. 17-18 octubre 1995. Universidad de Talca, Escuela de Agronomía, Talca, Chile.

Himmelrick, G., and R. McDuffie. 1983. The calcium cycle: uptake and distribution in apple trees. HortScience 18:147-151.

Ilarslan, H., G. Palmer, J. Imsande, and T. Horner. 1997. Quantitative determination of calcium oxalate in developing seeds of soybean. Am. J. Bot. 84:1042-1046.

Kader, A. 1992. Postharvest biology and technology: an overview. p. 15-21. In Kader, A. (ed.). Postharvest technology of horticultural crops. 2nd ed.  University of California, Davis, California, USA.

Kalra, Y.P. (ed.) 1998. Handbook of reference methods for plant analysis. 300 p. Soil and plant analysis council, Inc. CRC Press, New York, USA.

Khalidy, R., A. Jamali, and H. Bolkan. 1969. Causes of the peteca disease of lemons as occurring in Lebanon.  Proceedings First International Citrus Symposium 3:1253-1260.

Latorre, B. 1992. Enfermedades de las plantas cultivadas. 626 p. Universidad Católica de Chile, Santiago, Chile.

Libert, B., and V.R. Franceschi. 1987. Oxalate in cross plant. J. Agric. Food Chem. 35:926-938.

Madrid, R., F. Romojaro, E. Molina, F. Sánchez, y A. Alarcón. 1997. La vitrescencia del melón. Agrícola Vergel 17(194):90-96.

Ostle, B. 1979. Estadística aplicada. Técnicas de la estadística moderna, cuándo y dónde aplicarlas. 629 p. Limusa, Mexico Distrito Federal, México.

Palma, B., P. Undurraga, y J. Olaeta. 1998. Caracterización histológica como afección no parasitaria en frutos de limoneros. VII Congreso Latinoamericano de Botánica, México, Distrito.Federal. 18-24 de octubre. Sociedad Latinoamericana de Botánica, Ciudad de México, México.

Razeto, B. 1987. Desórdenes fisiológicos en cítricos.  ACONEX Nº 17 p.13-17.

Razeto, B. 2001. Lemon spot (Peteca) and its weather relationship. ACONEX Nº 70 p.31-32.

Retamales, J.B., C. Valdes, D.R. Dilley, L. Leon, and V.P Lepe. 2000. Bitter pit prediction in apple through Mg infiltration. Acta Hortic. 512:169-179.

Seymour, G.B., J.E. Taylor, and G.A. Tucker. 1993. Biochemistry of fruit ripening. 454 p. Chapman & Hall, London, UK.

Silva, B. 1991. Calcio, un problema nutricional frecuente en numerosas especies frutales y hortalizas. ACONEX Nº 33 p.17-20.

Storey, R., and M.T. Treeby. 2002. Cryo-SEM study of the early symptoms of peteca in "Lisbon" lemon. Hortic. Sci. Biotechnology 77:551-556.

Underhill, S.J.R, R. Mc.Lauchlan, and J.M. Dahler. 1998. Flavedo and albedo changes in "Eureka" lemons caused by static compression and impact loading. J. Texture Studies 29:437-52.

Undurraga, P, J. Olaeta, C. Luttges, y R. Suárez. 2002. Efectos del calibre y madurez de limones cv. Fino 49, sobre el desarrollo de Peteca en almacenaje refrigerado. Simiente 72:35-36.

Valverde, M., R. Madrid, I. Cabrera, y F. Romojaro. 1998. Influencia de los niveles de calcio en la corrección del "blossom end rot" en variedades de pimiento. Agrícola Vergel 93:117.

Yuri, J. 1995. Aspectos fundamentales de la bioquímica y fisiología del calcio. p. 25-36. Symposio Internacional Calcio en Fruticultura, Talca, Chile. 17-18 octubre 1995. Universidad de Talca, Escuela de Agronomía, Talca, Chile.

Pedro Undurraga M.1, José A. Olaeta C.1, Jorge Retamales A.2 y Alejandra Brito P.1 1 Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, Facultad de Agronomía, Casilla 4-D, Quillota, Chile. 2 Universidad de Talca, Facultad de Ciencias Agrarias, Casilla 747, Talca, Chile.