Inmunogenicidad diferencial de dominios de las glicoproteínas de la envoltura del HTLV-I (página 2)

Figura 1. Diagrama esquemático de las proteínas recombinantes de la glicoproteína de la envoltura de HTLV-I. Se detalla la secuencia señal y los productos del procesamiento de la gp 62. La glicoproteína de superficie gp46 y la proteína transmembranal gp 21.

RESULTADOS

Con las pruebas ELISA y Western Blot se realizó un filtrado inicial a fin de determinar la seropositividad para HTLV-I en los sueros de individuos de Tumaco; todas las muestras seropositivas presentaban títulos altos. Los resultados de los ensayos con las diferentes proteínas recombinantes empleadas se resumen en el Cuadro 1.

Cuadro 1. Reactividad de los Sueros Tanto de Pacientes Como de Individuos Seropositivos a las Proteínas Recombinantes de la Envoltura del HTLV-I

De las muestras de los pacientes con PET 31.4% (15/35) y 27.3% (6/22) de los portadores sanos reaccionaron con la PR-A; 89.2% (33/37) de los sueros de los individuos con PET y 94.3% de los portadores, reaccionaron con la PR-B; 100% (37/37) y 80% (28/35) de los sueros de los enfermos y portadores respectivamente, reaccionaron con la PR-B1; 100% (37/37) de los sueros de los sujetos con PET y 97.1% (34/35) de los portadores, reaccionan con la PR-C; 62.2% (23/37) y 47.0% (16/34) de los sueros obtenidos de enfermos con PET y portadores sanos respectivamente, reaccionaron con la PR-D.

Cuando se compararon los resultados de la reactividad en los sueros de los pacientes con PET y en los portadores sanos a las diversas proteínas, se determinó que los sueros de los pacientes con PET/MAH son más reactivos a la PR-B1 que los sueros de portadores asintomáticos (p = 0.004). Además, al analizar los valores obtenidos de reactividad a la porción carboxiloterminal de la gp-46 (PR- B+PR-C) con los de la porción aminoterminal (PR-A) se encontró una diferencia significativa de p < 0.001. Se obtuvieron resultados de significancia similares (p < 0.001) cuando se confrontó la reactividad a PR- B1+PR-C vs. PR-A. De otra parte, al comparar la reactividad de anticuerpos con la gp46 (PR A+B+C) vs. la p 21 (PR-D) se demostró que hay una diferencia significativa (p < 0.002).

DISCUSIÓN

Tumaco es un municipio marítimo ubicado en el Pacífico Sur de Colombia, donde la prevalencia de anticuerpos a HTLV-I es mediana si se compara con la que hay en otras regiones del mundo5; sin embargo, la prevalencia de PET es una de las más altas del globo22. Estos antecedentes hacen válido el análisis de aislados de HTLV-I para estudiar no sólo la variabilidad genética sino la reactividad de los anticuerpos a las proteínas de la envoltura del virus. Uno de los objetivos del presente estudio fue evaluar la reactividad de los anticuerpos presentes en los individuos con PET/HAM y en los portadores seropositivos para el HTLV-I de Tumaco contra diferentes proteínas recombinantes de la gp62.

Aunque la técnica de Western Blot permite identificar sólo anticuerpos que reaccionan a epítopes lineales, de acuerdo con Baba et al.23 más de 60% de los anticuerpos neutralizantes que reaccionan in vivo se dirigen contra epítopes lineales presentes en la gp46 del HTLV-I y menos de 40% de estos anticuerpos están ligados a epítopes conformacionales discontinuos. Este hecho sustenta el objetivo que se plantea en el presente trabajo, en el sentido de valorar inicialmente las regiones inmunodominantes y luego la determinación de epítopes neutralizantes en los aislados de Tumaco.

La región carboxiloterminal de la gp46 incluida dentro de las proteínas recombinantes B, B1 y C fue la más inmunorreactiva en las muestras analizadas siendo reconocida en 91.7%, 90.3% y 98.6% respectivamente por los anticuerpos anti-HTLV-I presentes en los individuos estudiados. Estos resultados concuerdan con los informes de Chen et al.14, aunque los datos de reactividad a estas proteínas son un poco más bajos (89.6%, 70.2% y 92.9% respectivamente); estas diferencias se pueden explicar si se incluyen varios aspectos: primero, uno de ellos, que los individuos del estudio de Chen et al.14, eran enfermos con ATL; segundo, que había un número mayor de individuos; y, tercero, que se trataba de aspectos meramente genéticos.

Al comparar los resultados del presente trabajo con los de Chen et al.14, hubo dos variaciones significativas; la primera de ellas que la proteína recombinante B1 exhibió diferencias estadísticamente significantes cuando se comparó la reactividad de los anticuerpos de portadores de HTLV-I con los de pacientes con PET/HAM, (p= 0.004); estos resultados permiten proponer probablemente, que en los individuos donde se desarrolló la enfermedad, pudo haber cambios en la reactividad de este epítope en la gp46 (a.a 166-201) o que se expondrían más regiones antigénicas que en el estadío de portador no se encuentran. Estos cambios podrían incluir alteraciones estructurales en la proteína o alguna variación en la secuencia de nucleótidos que puede afectar la antigenicidad de esta región (aminoácidos 166-201 de la gp46).

Con base en las consideraciones anteriores, se justifica entonces, realizar un análisis de secuencias de nucleótidos en aislados tanto de portadores como de pacientes con PET, con el objeto de evaluar si estos cambios de reactividad se asocian con mutaciones específicas en ciertas regiones de la gp62.

El otro aspecto en el que difiere el presente estudio del de Chen, et al.14, reside en los porcentajes de serorreactividad a la PR-D que fueron estadísticamente significativos (p < 0.01) entre pacientes con ATL y portadores; esta diferencia y la hallada en Cali en la B1 no permitió encontrar una relación directa con el desarrollo de la enfermedad.

Los resultados obtenidos en el presente trabajo sustentan la hipótesis general que la región carboxiloterminal de la gp46 es la más inmunorreactiva; en este sentido18 el uso de péptidos sintéticos, demostró que sueros provenientes de individuos seropositivos, enfermos con ATL y pacientes con PET/MAH, reaccionaban con regiones entre los aminoácidos 176-199 y 190-212 en 73% y 87% respectivamente. Además Palker et al.17, obtuvieron como resultado de un análisis similar, un péptido que comprendía los aminoácidos (a.a.) 190-209 que reaccionaban con 78% de los sueros de su población de estudio. Estas secuencias de a.a. se sobreponen con las incluidas en las proteínas recombinantes PR-B1 y PR-B.

La importancia de la inmunoreactividad de esta región radica en que se han determinado anticuerpos neutralizantes dirigidos contra epítopes en dicho sector; a.a. 175-19923, a.a. 187-19324 y a.a. 191-19625. Los porcentajes de reactividad contra péptidos sintéticos de la gp46 son más bajos que los obtenidos contra proteínas recombinantes, muy probablemente debido a que estas últimas tienen una extensión mayor y por ende mayor será la probabilidad de tener un mayor número de epítopes reunidos.

Un aspecto interesante, es que el mapeo de epítopes realizado sobre la glicoproteína de la envoltura de HTLV-II, señaló a la región comprendida entre los a.a. 173-209, como la más inmunoreactiva, 97% de los sueros ensayados reconocen este segmento16. Este hecho puede explicar en parte, el porqué de la reactividad cruzada entre los dos virus. Aunque esta región exhibe diferencias significativas en la secuencia de a.a. entre ellos, parece que estimula una fuerte respuesta humoral.

La proteína recombinante C, que comprende los a.a. 229-308, es la más inmunorreactiva a los anticuerpos hallados en los sueros de individuos incluidos en este estudio, 98.6%. Lal et al.18, restringieron más el epítope inmunodominante; estos autores obtuvieron una reactividad de 100% cuando enfrentaron sueros de 52 individuos (seropositivos, pacientes con ATL y PET/MAH) contra el péptido sintético Env5 a.a. 242- 257. Horal et al.19 obtuvieron porcentajes de seroreactividad más bajos cuando utilizaron péptidos sintéticos que comprendían los a.a. 240-262 (89%) y 292-314 (78%); de nuevo, la importancia de esta región inmunodominante radica en que se han podido producir anticuerpos neutralizantes contra epítopes localizados en esta región (a.a. 213-236 y 288-317)23. No sólo se ha obtenido una respuesta inmune de tipo humoral en individuos infectados con HTLV-I contra los epítopes antes descritos, sino que Jacobson et al.26 determinaron que hay una respuesta de tipo celular, montada contra estos mismos epítopes.

A 4 de los individuos seropositivos para HTLV-I, se les descubrió, amplificó y secuenció un fragmento de 383pb del gen ENV. Esta región que comprende los nucleótidos 5406-5789, codifica por un fragmento de a.a. de la gp46, que concuerda con las PR-B y PR-B1. A pesar de que se determinaron cambios de a.a. con propiedades químicas diferentes, éstos conservaban su capacidad para estimular una respuesta inmune humoral.

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Felipe García Vallejo, Ph.D.1, Norman Balcázar Morales, M.Sc.21. Profesor Titular, Departamento de Ciencias Fisiológicas, Escuela de Ciencias Básicas Médicas, Laboratorio de Biología Molecular y Patogénesis, Facultad de Salud, Universidad del Valle, Cali, Colombia. 2. Asistente 1 de Investigación, Unidad de Virología, Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT).