1.0 Generalidades El microscopio hizo posible conocer los mundos de dimensiones ínfimas, entre ellos la célula, base de la vida. Los microscopios son aparatos que, en virtud de las leyes de formación de imágenes ópticas aumentadas a través de lentes convergentes, permiten la observación de pequeños detalles de una muestra dada que a simple vista no se percibirían. Surge en el siglo XVII los microscopios compuestos, utilizados por el holandés Antonie van Leewenhock en el estudio de la microfauna de los estanques y charcas, unidas a las de Robert Hooke, establecieron la microscopia como poderosa herramienta científica. Zacharias y Hans Janssen construyeron en los años 1590's el primer microscopio registrado.
2.0 Tipos de Microscopios Optico Confocal Electrónico de Transmisión Electrónico de Barrido Microscopía de campo próximo – De barrido efecto túnel – De fuerzas atómicas Microscopio estereoscópico
Campo claro :La muestra se observa más oscura que el campo que la rodea. Campo oscuro: Posee un condensador paraboloide, hace que los rayos luminosos no penetren directamente en el objetivo, sino que iluminan oblicuamente la preparación. De contraste de fase: Se basa en modificaciones de la trayectoria de los rayos de luz, los cuales producen contrastes notables en la preparación. De fluorescencia: La fluorescencia es la propiedad que tienen algunas sustancias de emitir luz propia cuando inciden sobre ellas radiaciones energéticas, tratar el material biológico con flurocromos facilita la observación al microscopio . Tipos de Micoscropio óptico
La muestra se observa más oscura que el campo que lo rodea. Microscopio de campo claro
La muestra se observa brillantemente iluminada sobre un fondo oscuro. Microscopio de campo oscuro
Microscopio de contraste de fases Se observa una imagen con diferentes grados de brillo y oscuridad. El material denso aparece brillante, mientras que las partes de la célula que tienen una densidad cercana al agua (citoplasma) aparecen oscuras. Se utiliza para visualizar estructuras celulares sin necesidad de usar colorantes o matar microorganismos.
Microscopio óptico de fluorescencia Una molécula que fluorece emite luz de longitud de onda que se encuentra dentro del espectro visible, cuando es expuesta a una fuente de luz ultravioleta. Microscopio compuesto modificado con una fuente de radiaciones ultravioletas y un filtro. Se usan colorantes que emiten luz visible cuando se bombardean con rayos UV.
Microscopio confocal Se usa para estudiar la estructura de los materiales biológicos. Emplea un sistema de iluminación con rayo láser que es muy convergente y, en consecuencia produce un punto de barrido muy poco profundo. Se utiliza un sistema de espejos para mover el rayo láser a través del espécimen, iluminando un solo punto por vez. Se registran los datos de cada punto de la muestra recorrida con este rayo móvil y se guardan en una computadora. Luego se puede llevar la imagen a un monitor de alta resolución. Este método tiene la ventaja de que se pueden tomar imágenes de la muestra en cortes muy finos. Las regiones fuera de foco se restan de la imagen mediante un programa para dar una definición máxima a la imagen. Es posible también crear imágenes múltiples a diferentes profundidades dentro del espécimen y realizar reconstrucciones tridimensionales.
En 1932, Bruche y Johnsson construyen el primer microscopio electrónico a base de lentes electrostáticas, ese mismo año Knoll y Ruska dan a conocer los primeros resultados obtenidos con un microscopio electrónico Siemens, construido con lentes magnéticas. Así nace el microscopio electrónico, en 1936 ya se ha perfeccionado y se fabrican microscopios electrónicos que superan en resolución al microscopio óptico. Utiliza un flujo de electrones en lugar de luz. Consta fundamentalmente de un tubo de rayos catódicos, en el cual debe mantenerse el vacio. Microscopio Electrónico
Permiten estudiar la estrutura celular. La resolución y el aumento son mayores. Los virus, y los objetos más pequeños, como las macromoléculas solamente pueden verse a través del microscopio eléctronico. El Microscopio electrónico consta de: * Un filamento de tungsteno (cátodo) que emite electrones. * Condensador o lente electromagnética, que concentra el haz de electrones. * Objetivo o lente electromagnética, que amplía el cono de proyección del haz de luz. *Ocular o lente electromagnética, que aumenta la imagen. *Proyector o lente proyectora. que amplía la imagen. * Pantalla fluorescente, que recoge la imagen para hacerla visible al ojo humano. Aplicaciones
Microscopio Electrónico de Transmisión Utiliza un chorro de electrones en lugar de luz visible para definir el objeto. Requiere que se aumente el contraste por sombreado metálico utilizando un metal pesado. Pasos para la preparación de rutina de los especimenes en la microscopia electrónica de transmisión Fijación con glutaraldehído. Lavado con un buffer. Fijación con tetróxido de osmio. Fijar piezas de tejidos no mayores de 1mm 3 Microfotografía electrónica de Transmisión de paredes celulares.
Microscopio electrónico analítico de transmisión de alta resolución JEOL-2000 FXII Permite observaciones de hasta 0,28 nm. de resolución. Puede focalizar el haz de electrones hasta 2 nm. de diámetro y trabaja con voltajes de aceleración variables de 20 a 200 kV. Lleva acoplado un sistema computerizado de análisis de energía de rayos X dispersados eXL-10 de LINK ANALYTICAL que permite determinar la composición química de la microregión sobre la que se focaliza el haz electrónico. Aumentos entre 5 000X y 1 000 000X
Microscopio Electrónico de Barrido Bombardea la superficie del espécimen con un rayo de electrones. Produce imágenes con una profundidad aparentemente tridimensional. Técnica versátile para la visualización y el análisis de las características microestructurales de muestras sólidas(elevada resolución es 2nm y campo de resolución) . Técnica de interés en campos como :Medicina, Biología, Ciencias de Materiales, Metalurgia, Arqueología, etc. Microfotografía electrónica de Barrido de paredes celulares.
Microscopio de fuerzas atómicas Instrumento mecánico- óptico que detecta fuerzas a nivel atómico (del orden de los nanoNewton) a través de la medición óptica del movimiento sobre la superficie. Obtiene imágenes tridimensionales de la superficie de muestras (Sin preparación especial de las muestras). Lleva acoplado un microscopio óptico( permite la visualización del conjunto punta-muestra y poder situar la punta sobre una zona determinada de la muestra). Distingue detalles en la superficie de la muestra con una amplificación de varios millones( Resolución de menos de 1nm). Aplicaciones Análisis de: Cristales de aminoácidos. ADN y ARN Complejos Proteína – ácidos nucleicos. Cromosomas. Membranas celulares. Proteínas y pépticos Cristales moleculares. Polímeros y biomateriales Componentes de las membranas de la célula.
Microscopio de barrido efecto túnel Forma parte de los instrumentos llamados 'nanoscopios‘( visualiza objetos del tamaño de nanómetros (10 a la menos nueve metros). Inventado en 1981 por G. Binning y H. Röhrer, (IBM, Zurich) (galardonados con el Premio Nobel de Física en 1986 por su invención). Dispone de una aguja tan afilada que en su extremo sólo hay un átomo. La punta se sitúa sobre el material y se acerca hasta la distancia de 1 nanómetro (10 a la menos 9 metros). Una corriente eléctrica débil genera una diferencia de potencial de 1 voltio. Al recorrer la superficie de la muestra, la aguja reproduce la topografía atómica de la muestra. Aplicaciones Imágenes atómicas de moléculas de ADN. Mover átomos individuales. Mapas precisos de superficies de metales o de semiconductores, cada átomo puede distinguirse de su vecino.
Microscopio estereoscópico Visión tridimensional de los objetos, para observaciones que requieren pequeños aumentos
3.0 Partes del micoscropio óptico
Partes del microscopio óptico. SISTEMA MECANICO Píe Brazo Tubo Lugar donde se deposita la preparación. Platina Base sobre la que se apoya el microscopio. Sostiene el tubo en su porción superior y por el extremo inferior se adapta al pie. Forma cilíndrica En su extremidad superior se colocan los oculares. (Es ennegracido internamnete para evitar los reflejos de luz).
Platina:Presenta un orificio en el eje óptico del tubo que permite el paso de los rayos luminosos a la preparación,puede ser fija, en cuyo caso permanece inmóvil; en otros casos puede ser giratoria, es decir, mediante tornillos laterales puede centrarse o producir movimientos circulares. Escala Pinza
SISTEMA MECANICO Revólver Pieza giratoria en los cuales se enroscan los objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos .
SISTEMA DE Mecánico Tornillo micrométrico Tornillo macrométrico Freno. Aproxima el enfoque,permite un enfoque rápido de la preparación. Se logra el enfoque exacto y nítido de la preparación Tornillos de enfoque
SISTEMA ÓPTICO Oculares: Los oculares están constituidos generalmente por dos lentes, dispuestas sobre un tubo corto . Objetivos: Producen aumento de las imágenes de los objetos y organismos. Partes del microscopio óptico. Sistema de lentes
SISTEMA ÓPTICO Objetivos Partes del microscopio óptico. Están colocados en el revolver. Tienen un sistema de amortiguación. Un anillo coloreado indica los aumentos. Poseen un aumento de 4x, 10x, 40x y 100x aumentos. Sistema de lentes:
SISTEMA ÓPTICO Objetivos Partes del microscopio óptico. Sistema de lentes: Rojo 4x Amarillo 10x Blanco 100x (Inmersión) Azul 40x amortiguación
SISTEMA ÓPTICO Partes del microscopio óptico. Sistema de lentes: Están colocados en la parte superior del tubo. Poseen un aumento de 10x, 15x y 20x. Oculares
SISTEMA ÓPTICO Objetivos Partes del microscopio óptico. ACEITE DE INMERSIÓN Sistema de lentes: Hoy no son de madera de cedro, sino sintéticos. Los hay de baja, media y alta viscosidad. Su empleo es imprescindible con el objetivo de inmersión (100x).
SISTEMA ÓPTICO Sistema de Iluminación: Fuente de luz Condensador Partes del microscopio óptico. Diafragma Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación. Regula la cantidad de luz que entra en el condensador. Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.
SISTEMA ÓPTICO Fuente de luz Partes del microscopio óptico. Suele ser una lámpara halógena de intensidad graduable. Se enciende y apaga con un interruptor. En el exterior puede tener un filtro. Sistema de Iluminación: lámpara Interruptor graduación de la luz Filtro
SISTEMA ÓPTICO Condensador Partes del microscopio óptico. Concentra la luz de la lámpara en un punto de la preparación. Sistema de Iluminación: condensador Diafragma o iris Dentro del condensador. Al cerrarse mejora el contraste, pero empeora la resolución. diafragma
4.0 Pasos a seguir para su uso. Conectar el microscopio a la corriente eléctrica. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente.(Si se recogio correctamente ya debe estar en esas condiciones). Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas. Encender la fuente de luz con la intensidad mínima y se va aumentando poco a poco. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparación es de bacterias.
Pasos a seguir para su uso. 6. Para realizar el enfoque: Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo macrométrico( Mirando directamente y no a través del ocular, se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación y dañar ambos). Mirando, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo nítida la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino. 7. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 5.
Pasos a seguir para su uso. 8. Empleo del objetivo de inmersión: Bajar totalmente la platina. Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que echar el aceite. Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y el de 40x. Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz. Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente. Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande.
Pasos a seguir para su uso. Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede volver a usar el objetivo. Finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revólver. Se puede retirar la preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en posición de observación. Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para óptica. Comprobar también que el objetivo 40x está perfectamente limpio. – Apagar el equipo y desconectarlo de la corriente.
Aumento Poder de resolución Límite de resolución Número de campo Profundidad de campo Contraste 5.0 Parámetros Ópticos.
Se calcula multiplicando el aumento del objetivo por el aumento del ocular. 40 x 10 x 400x 5.1 Aumento
Es la capacidad del instrumento para dar imágenes distintas de puntos situados muy cerca uno del otro en el objeto. Depende de: la long. de onda (?) y de la apertura numérica (AN). 5.2 Poder de resolución R AN 0.61 ? Es la capacidad de reunión de la luz de objetivo, también se encuentra grabada en la manga del lente.
Es la distancia mínima que debe existir entre dos puntos para que puedan ser discriminados como tales. El Límite de Resolución es la inversa del Poder de Resolución, de manera que cuanto mayor sea éste, menor será el Límite de Resolución. 5.3 Límite de resolución Límite de Resolución Poder de Resolución 1
Es el diámetro de la imagen observada a través del ocular, expresado en milímetros. 5.4 Número de campo Espesor de la preparación enfocada en cualquier momento. 5.5 Profundidad de campo
Diferencia de absorción de luz entre el objeto y el medio Puede aumentarse con las tinciones. 5.6 Contraste
6.0 Mantenimiento del microscopio El microscopio debe estar protegido del polvo, humedad y otros agentes que pudieran dañarlo .( Guardado en estuche, campana y otros). Las partes mecánicas deben limpiarse con un paño suave.( Humedecer el paño con Xilol si se ha trabajado con aceite de inmersión). La limpieza de las partes ópticas requiere precauciones especiales. Nunca deben tocarse las lentes del ocular, objetivo y condensador con los dedos. Para guardarlo se acostumbra colocar el objetivo de menor aumento sobre la platina y bajado hasta el tope; el condensador debe estar en su posición más baja, para evitar que tropiece con alguno de los objetivos . Guardar en lugares secos, para evitar que la humedad favorezca la formación de hongos. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico, micrométrico, platina, revólver y condensador). El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a la preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrándolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se está observando a través del ocular. Mantener seca y limpia la platina del microscopio
7.0 Conclusiones El Microscopio es: un instrumento que se utilizan para obtener una imagen aumentada de objetos minúsculos o detalles muy pequeños de los mismos. El microscopio simple o lente de aumento es el más sencillo de todos y consiste en realidad en una lupa que agranda la imagen del objeto observado. Dos lentes convexas bastan para construir un microscopio. Cada lente hace converger los rayos luminosos que la atraviesan. Una de ellas, llamada objetivo, se sitúa cerca del objeto que se quiere estudiar. La imagen es observada por la segunda lente, llamada ocular, que actúa sencillamente como una lupa. Zacharias y Hans Janssen construyeron en los años 1590's el primer microscopio registrado. En 1932, Bruche y Johnsson construyen el primer microscopio electrónico a base de lentes electrostáticas. Los virus, y los objetos más pequeños, como las macromoléculas solamente pueden verse a través del microscopio eléctronico.