Bordetella bronchiseptica en animales de laboratorio (página 2)

Desarrollo.

1. Características de Bordetella bronchiseptica

1.1. Características del género Bordetella

El género Bordetella está conformado por bacterias de metabolismo aerobio, cuyas características fisiológicas y bioquímicas las han agrupado en un mismo género y a su vez diferenciado en 4 especies: Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Bordetella bronchiseptica y Bordetella avium; (Sapian; 1991). Todas estas especies están asociadas con infecciones de las vías respiratorias; Bordetella pertussis y Bordetella parapertussis son patógenos exclusivamente de humanos y las dos especies restantes, lo son para animales fundamentalmente (Hallander, Storsaeter and Mollby, 1991).

En la organización del árbol filogenético del género Bordetella (Figura 1), se plantea que a partir de una especie ancestral surgió probablemente una diferenciación que dio lugar a Bordetella avium. Con Bordetella bronchiseptica se presentaron los genes de la toxina pertusis, evolucionando una cepa hacia Bordetella parapertussis y otra a Bordetella pertussis; perdiendo esta última la movilidad y adquiriendo una secuencia de inserción específica para humanos, así como la capacidad para expresar la toxina pertusis (Gross , Arico and Rappuoli, 1989).

Fig. 1. Arbol Filogenético del Género Bordetella

1.2. Características de la especie Bordetella bronchiseptica.

Reseña histórica

Según Merchant and Parker,1973; Bordetella bronchiseptica se aisló por primera vez en 1896 por Galli- Valerio, quien la describió nuevamente en 1908, denominándolo Bacillus caniculae. Por otra parte en 1901, Lignieres estudió una bacteria a la que llamó Pasteurella canina y planteó que era el agente etiológico del moquillo canino. En 1911 esta especie fue aislada y descrita en los EE.UU por Ferry con el nombre de Bacillus bronchicanis, el cual cambió en 1913 a Bacillus bronchiseptico y posteriormente en 1957 con la definición del género Bordetella en la Edición del Manual Bergey de ese año formó parte de este género (Merchant and Parker,1973).

Morfología y características diferenciales con el resto de las especies

Bordetella bronchiseptica es un bacilo corto, pleomórfico de 0.4- 0.5 m m de diámetro y 1.5-2 µm de longitud que presenta formas cocoides y bacilares, puede agruparse en parejas o cadenas pero por lo general se presenta como bacterias aisladas, es móvil gracias a sus flagelos peritrícos, no forma esporas ni produce cápsula. Crece óptimamente en aerobiosis, a temperatura de 37 +/-2 °C, pH entre 7.0 y 7.2 y medios enriquecidos con tejido o plasma.

En medio Agar Sangre forma pequeñas colonias grises circulares parecidas a gotas de rocío y en Agar Mac Conkey colonias pequeñas incoloras. En medios líquidos produce turbidez uniforme, dando un sedimento granular, pero sin formar película en la superficie. Cuando el cultivo envejece, al agitarse toma forma de látigo. Este bacilo muere en 20 minutos a la temperatura de 55 °C lo que lo hace menos resistente al calor que otros bacilos Gram negativos no esporulados. Es sensible a la luz, la desecación y a los desinfectantes ordinarios y muere por congelación (Merchant and Parker, 1973; Michel, 1982).

Dentro de sus características bioquímicas, una de las más notables y que la diferencia del resto de las especies que conforman el género, es su falta de acción fermentativa sobre los carbohidratos y su rápida acción sobre algunos sustratos como la urea, la cual descompone en menos de 4 horas a 37°C, gracias a la fuerte acción de la enzima ureasa (Tabla 1). Esta bacteria no produce indol y puede o no reducir los nitratos a nitritos en dependencia de la cepa en cuestión (Griffith, Brasky and Lang, 1997).

Tabla 1. Características Diferenciales del género Bordetella.

Factores de Patogenicidad

Diversos han sido los experimentos destinados a estudiar los factores de patogenicidad del genero Bordetella, que puedan utilizarse en el diagnóstico de laboratorio o en la preparación de vacunas, comprobándose que todas las especies que conforman este género, son similares en varios factores de patogenicidad (Burns et al, 1993).

Los factores de patogenicidad comunes entre Bordetella bronchiseptica y Bordetella pertussis son la Hemoaglutinina filamentosa (HAF), la presencia de aglutinógenos (fimbrias), la enzima adenilato ciclasa, las hemolisinas, la endotoxina (LDS) y la toxina termolábil, lo cual demuestra aún más la similitud antigénica de estas dos especies (Burns et al, 1993).

Según Sapian, 1991, la virulencia de Bordetella bronchiseptica es ciertamente un fenómeno multifactorial. Los diferentes factores pueden influir en las distintas etapas de colonización del microorganismo debido al mecanismo de acción de cada uno de ellos. Según Sapian (1991) la virulencia de Bordetella bronchiseptica es ciertamente un fenómeno multifactorial. Estos factores pueden influir en las diferentes etapas de colonización del microorganismo debido al mecanismo de acción de cada uno de ellos. En la tabla 2 se muestran los principales factores de patogenicidad relacionados con la infección por Bordetella bronchiseptica y su mecanismo de acción fundamental, los cuales son:

Hemoaglutinina Filamentosa: Es una adhesina, responsable de la adherencia del microorganismo a las células epiteliales ciliadas y no ciliadas y a los macrófagos del tracto respiratorio, permitiendo la colonización de la bacteria (primera etapa de la infección)

Fimbrias: Permiten la adherencia del microorganismo a las células ciliadas del tracto respiratorio (adhesina).

Enzima adenilato ciclasa: Es una enzima extracitoplasmática con características de toxina. Penetra a través de la célula hospedera y es capaz de producir AMP cíclico a partir de ATP endógeno. Constituye un importante factor de virulencia ya que impide la acción fagocítica de los leucocitos polimorfonucleares y los macrófagos en el hospedero. Su actividad está muy relacionada con la proteína de membrana externa de 68 kDa, la cual constituye un antígeno de superficie celular muy recomendado tanto para el diagnóstico como para la protección.

Citotoxina traqueal: Enzima que provoca daño celular (ciliostasis) a nivel del epitelio ciliado del tracto respiratorio.

Toxina termolábil: Enzima lábil al calor, induce una vasoconstricción.

Endotoxina: Enzima estable al calor, inmunopotencialmente activa, que provoca pirogenicidad, mitogenicidad así como tiene la capacidad de provocar shock.

(Kemeny, 1973; Novotny et al, 1985; Montaraz, Novotny and Ivany, 1985; Kobish and Novotny, 1990).

Se plantea que la infección puede ocurrir en dos etapas fundamentales: En una primera etapa (colonización), ocurre la activación de los genes de producción de la Hemoaglutinina Filamentosa (HAF), la cual en unión con las fimbrias actúan permitiendo la colonización de la bacteria en el hospedero y en una segunda etapa (daño celular) ocurre la expresión de otros genes como los de las endotoxinas, la citotoxina traqueal y la enzima adenilato ciclasa, los cuales son los causantes de los daños sistémicos en el tracto respiratorio (Bemis and Wilson, 1985; Zeligs, Zeligs and Bellant, 1986; Locht et al, 1993; Burns et al, 1993; Keil and Fenwick, 2000).

Tabla 2. Principales factores de patogenicidad de Bordetella bronchiseptica. Mecanismo de acción

Incidencia de Bordetella bronchiseptica

Bordetella bronchiseptica se considera un parásito del tracto respiratorio de diversas especies de animales. M’Gowan en 1911 describió el hallazgo del germen en hurón, mono, cabra, cobayo, conejo, gato y perro y además dio a conocer que había aislado esta bacteria en un empleado que había manejado conejos y cobayos. En 1943, Phillips en Canadá logró aislarla en cultivo puro a partir de exudados bronquiales de cerdos.

Durante todos estos años de investigación de esta especie, la prevalencia de infección ha sido especialmente alta en cerdos, perros y curieles (Winsser, 1960, Smith, Baskerwille y Bronthwell, 1982). Además se ha encontrado afectando otras especies como ratas, ratones, conejos y otros (Good and May, 1971; Deeb et al, 1990).

También ha estado involucrada en afecciones respiratorias en personas inmunodeprimidas y convalecientes, así como en personal que ha mantenido un contacto estrecho con animales enfermos; aunque no es considerado un microorganismo antropozoonótico (Bauwens et al, 1992).

En cuanto a los animales de laboratorio, se ha demostrado que esta bacteria es capaz de afectar a la inmensa mayoría de las especies, principalmente roedores, lagomorfos y caninos entre otros. Su presencia influye de forma negativa en los resultados de las diferentes investigaciones en las que se emplean estos animales.

Producto de estas afectaciones, así como el impacto económico que representa la pérdida de estos tipos de animales con características de crianza y reproducción diferentes al resto de las especies, se incluyó esta bacteria dentro de la lista de microorganismos que afectan la condición de animal de laboratorio (Goodnow, 1980; Kraft et al, 1994).

Dentro de las diferentes categorías de animal de laboratorio, la categoría convencional se caracteriza por la cría en instalaciones abiertas, en la que los animales se exponen al padecimiento de diferentes tipos de enfermedades, tales como cutáneas, respiratorias y gástricas, las cuales son las principales causas del incremento de la morbilidad y mortalidad en estos animales. Los criadores de lagomorfos plantean que entre el nacimiento y el final del engorde existe en esta especie una mortalidad cercana al 20 % y que una de sus causas fundamentales son las enfermedades infecciosas. Dentro de éstas, las enfermedades respiratorias ocupan un lugar importante, ya que se transmiten por vía aerógena y muchos animales pueden ser portadores asintomáticos, perpetuando así la enfermedad en la colonia (Sosa, 2001).

Bordetella bronchiseptica es uno de los microorganismos que puede provocar enfermedades respiratorias en conejos (Deeb et al, 1990), siendo capaz de infectar a los animales, específicamente de la categoría desarrollo, mantenerse de forma asintomática y con la aparición de un estrés, ya sea de transporte, nutricional o de manipulación desatar una serie de síntomas como disnea, decaimiento, secreción nasal y/o estornudos, llegando a provocar neumonías severas e incluso la muerte si no se atiende rápidamente (Goodnow, 1980; D’ Amore et al, 2000).

Brotes por esta bacteria se han reportado por diferentes investigadores en México, Estados Unidos e Italia fundamentalmente, involucrando a curieles, conejos, primates no humanos, roedores y cerdos (Goodnow, 1980; Musser et al, 1987; Percy and Barthold, 1993).

En nuestro país no existen datos de infección en conejos por esta bacteria ya que la cría de esta especie animal es fundamentalmente por criadores particulares, los cuales al aparecer síntomas compatibles con procesos respiratorios proceden rápidamente al sacrificio de los animales enfermos para evitar la propagación de la enfermedad en sus conejeras. En estos casos la enfermedad se asocia a Pasteurella multocida, bacteria más frecuentemente aislada en los procesos respiratorios de estos animales. Además no existe en la Red Nacional de Laboratorios Veterinarios de Cuba un diagnóstico de rutina para el aislamiento e identificación de esta entidad; pudiendo ser estas unas de las causas por las que no se considere esta especie como una de las responsables de la morbi-letalidad de los conejos en Cuba (Ponce et al, 2000; Sosa, 2001).

2. Diagnóstico

El método de cultivo e identificación se ha utilizado siempre como una técnica de referencia por su posibilidad de detectar los microorganismos mediante su aislamiento y posterior identificación aunque posee sus desventajas, como son: se requiere del sacrificio del animal para el aislamiento primario del agente a partir de los órganos procesados, se necesitan medios de cultivos costosos que encarecen el control de la calidad, ya que en ocasiones requieren ser específicos para el caso de algunas entidades más selectivas en sus condiciones de crecimiento o por sus características, ya que tienen un crecimiento más lento que el del resto de los microorganismos que habitan de forma natural en los órganos a muestrear o que se encuentren contaminando los mismos (Matherne, Earl and Wagner, 1987; Hallander, Storsaeter and Mollby, 1991, Hozbor, Fouque, Guiso, 1999). Es por esta razón que se hace necesario la búsqueda de otros métodos más específicos y sensibles para detectar la presencia de este patógeno, ya sea por detección de antígenos o de anticuerpos específicos que denoten que el agente ha estado o está presente, pudiendo afectar la calidad de los animales.

Diversos métodos se han desarrollado sobre la base de las características de la reacción inmune y las propiedades físico – químicas de los antígenos y anticuerpos con la finalidad de detectar la presencia de ambos y cuantificarlos. Dentro de las pruebas inmunoquímicas más empleadas, podemos mencionar las técnicas de aglutinación, las técnicas de precipitación, las técnicas con anticuerpos marcados y los inmunoensayos (Peralta, Pedroso y Martínez, 1997, Hosbor, Fouque, Guiso, 1999).

Las técnicas inmunoenzimáticas, empezaron a desarrollarse con los trabajos de Avrameas y Uriel (1966) quienes concibieron la idea de marcar antígenos y anticuerpos con enzimas para usarlas en técnicas convencionales como la inmunodifusión doble. Sin embargo, el empleo de conjugados enzimáticos en estos inmunoensayos se reportó de forma independiente por Engvall y Perlmann en 1971. Este método fue presentado como una alternativa a los sistemas de radioinmunoensayos para el diagnóstico de antígenos y anticuerpos.

El término ELISA se utilizó por primera vez por Engvall y Perlmann en 1971 y se identificó como ensayos heterogéneos (Crowther, 1995, Peralta, Pedroso y Martínez, 1997). Este sistema era diferente a los métodos enzimáticos utilizados hasta entonces como las coloraciones inmuno-histoquímicas por la técnica de inmunoperoxidasa. Más tarde Voller, Bidwell y Bartlett en 1976 dieron pasos de avance en el desarrollo de las técnicas inmunoenzimáticas, poniendo a punto el método en microplaca de poliestireno y sugiriendo su uso para titular anticuerpos inducidos por enfermedades infecciosas.

Desde el año 1977 hasta la actualidad, se observa un gran auge en la aplicación de estas técnicas para el diagnóstico de diferentes enfermedades en animales y vegetales (Voller and Savigny, 1981; Peralta, Pedroso y Martínez, 1997).

Los métodos serológicos son en general ampliamente utilizados para la detección de agentes infecciosos en todas las ramas de la microbiología y dentro de ellos, el ELISA es considerado de excelencia por ser una técnica rápida, sensible y específica, permitiendo el análisis de un número grande de muestras (Sakursi et al, 1990); estos sistemas son ampliamente utilizados por laboratorios especializados, dadas sus características de ser económicos, siendo considerado como uno de los métodos de diagnóstico bacteriológico más prometedores en el presente para estudios seroepidemiológicos (Voller, Bidwell and Bartlett,1976).

Según su finalidad se puede utilizar cualquiera de las variantes existentes de este método, tales como: ELISA Directo, ELISA Indirecto, ELISA Sandwich y ELISA de competencia. De ellos uno de los más utilizados ha sido el ELISA Indirecto el cual es capaz de detectar anticuerpos existentes en muestras de sueros de animales ya sean sanos o enfermos, lo que brinda información sobre el estado higiénico – sanitario de la especie animal estudiada (Crowther, 1995).

Por las características que poseen estos sistemas, son sumamente atractivos para los investigadores, permitiendo que en la actualidad sean introducidos prácticamente en todos los campos de la medicina tanto humana como veterinaria, sobre todo como medios de diagnósticos y para estudios tanto epidemiológicos como epizootiológicos, permitiendo que tanto en el mercado como en la literatura puedan encontrarse diferentes sistemas ELISA para el diagnóstico de parásitos, bacterias, hongos, Ricketsias y virus (Voller, Bidwell and Bartlett, 1982).

Estudios realizados por Boot et al en 1993, donde comparan el método de cultivo e identificación con el ELISA, mostraron que este último es mucho más sensible que el de cultivo, siendo recomendado que para estudios de grandes masas de animales se utilice el Sistema Inmunoenzimático; similares resultados reflejó el trabajo presentado por Wullenweber y Boot en 1994, donde también demuestran como en 39 curieles SPF testados por cultivo e identificación de sus órganos, así como por ELISA e Inmunofluorescencia, estas dos últimas técnicas mostraron ser más sensibles que el cultivo, el cual solo detectó el 10 % de las muestras que resultaron positivas por el ELISA.

Con el propósito de dar solución a las exigencias de las regulaciones internacionales sobre la calidad biológica de los animales de laboratorio, así como del establecimiento de un sistema de vigilancia epizootiológica que permita preservar tanto la salud animal como la humana, el Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB) estableció un Programa de Monitoreo Microbiológico (monitoreo de salud) con el objetivo de garantizar la disminución del riesgo de infecciones zoonóticas e incrementar la confiabilidad y veracidad de las investigaciones (Riera, 2001).

En el monitoreo microbiológico de animales, el tipo de agente a monitorear y las técnicas a emplear pueden variar de un país a otro, dependiendo de circunstancias locales como tamaño de la colonia a examinar, condiciones, vías de obtención y cría de la colonia, prevalencia regional de organismos específicos y situación económica (Kraft et al, 1994). En nuestro Centro desde el año 1992 se ha venido introduciendo como uno de los sistemas de diagnóstico para la detección de aquellos virus, bacterias y parásitos que afectan la calidad de nuestros animales de laboratorio, el método inmunoenzimático ELISA (Riera, 2001, Lugo, 2002), el cual ha mostrado ser eficaz en el diagnostico de anticuerpos a las diferentes entidades, en las que sean estandarizados estos sistemas.

Las ventajas del Sistema inmunoenzimático ELISA han sido reconocidas internacionalmente, las que han influido en su creciente auge e introducción en el diagnóstico (Peralta, Pedroso y Martínez, 1997) dentro de sus principales ventajas podemos mencionar que:

• Permiten el procesamiento de un gran número de muestras de forma simultánea.
• Garantizan estabilidad y alto rendimiento de sus componentes
• Poseen una sensibilidad y especificidad similar a técnicas de radioinmunoensayos.
• No trabaja con radioisotopos
• La lectura de sus resultados puede ser visual o fotométrica.
• Su realización puede ser tanto manual como automatizada.
• Pueden ser usados diferentes tipos de substratos: colorimétricos o fluorescentes.

Por las características que poseen, los hacen sumamente atractivos para los investigadores, permitiendo que en la actualidad sean introducidos prácticamente en todos los campos de la medicina tanto humana como veterinaria, sobre todo como medios de diagnósticos y para estudios tanto epidemiológicos como epizootiológicos, permitiendo que tanto en el mercado como en la literatura puedan encontrarse diferentes sistemas ELISA para el diagnóstico de parásitos, bacterias, hongos, Ricketsias y virus (Voller, Bidwell and Bartlett, 1982; Boot et al, 1993).

3. Tratamiento y Prevención

3.1. Tratamiento

Una vez que los animales han sido infectados de forma natural y muestren signos evidentes de enfermedad sistémica se recomienda su tratamiento con antibióticos de amplio espectro o específicos para este germen; dentro de éstos podemos citar los antibióticos b lactámicos (Penicilina, Ampicillin y Amoxicillin), los cuales interfieren en la síntesis de la pared celular de la bacteria. Otros antibióticos como las cefalosporinas de primera generación (Cefalexina y Cefadroxil) han sido empleados con buenos resultados. La Eritromicina, Clarithromycin y Azithromycin, antibióticos de la clase macrólidos, interfieren con la síntesis de proteína bacteriana a nivel ribosomal, siendo esto uno de los mayores beneficios para el tratamiento de las enfermedades de tipo respiratorias por su elevada capacidad de penetrar tejidos del tracto respiratorio (Keil and Fenwick, 2000).

A pesar de lo efectivo de algunos antibióticos, el uso indiscriminado de estos ha traído consigo la resistencia de muchas cepas bacterianas a estos, lo que ha conllevado a tratar de buscar alternativas para prevenir una posible infección por esta entidad.

3.2. Prevención

Diversos han sido los trabajos encaminados hacia la protección de los animales ante una infección por Bordetella bronchiseptica, fundamentalmente para los animales de laboratorio, los cuales por el uso para el cual están destinados requieren una calidad microbiológica definida y controlada.

En 1965, Ganaway, Allen and Mc Pherson previnieron un brote de neumonía en una colonia de curieles mediante la vacunación con cepas formolizadas. Harris y Switzer en 1972, inmunizaron cerdos por vacunación parenteral logrando algún nivel de protección. Nakagawa, Yoda y Muto en 1974 obtuvieron buenos resultados en la profilaxis de curieles con neumonías causadas por Bordetella bronchiseptica mediante vacunación con Bacterinas, aunque la protección no fue completa. Otros investigadores como Shimizu (1978) tomaron como método profiláctico la vacunación intranasal con cepas vivas controlando un poco la diseminación del agente.

Posteriormente, en 1983 Kobisch evaluó 7 vacunas contra esta especie en cerdos libres de gérmenes patógenos, mostrando una disminución en las manifestaciones clínicas y reducción de las lesiones en los grupos vacunados, así como en los aislamientos de este microorganismo en las fosas nasales y pulmón. Matherne, Earl y Wagner en 1987 compararon 3 tipos de vacunas contra Bordetella bronchiseptica en cuanto a protección contra esta entidad en curieles, demostrando que disminuyeron las lesiones en pulmón. En 1991, Shek y colaboradores evaluaron la persistencia de esta especie bacteriana en curieles vacunados probando que al vacunar los animales con 2-4 billones de la cepa formolizadas, los títulos de anticuerpos (por método de microaglutinación) aumentaron dramáticamente y los aislamientos disminuyeron considerablemente.

Otro grupo de investigadores se ha dedicado a la búsqueda de un componente de esta bacteria que brinde una mayor protección con el objetivo de obtener un inmunógeno que proteja contra este microorganismo y disminuya en gran medida los efectos secundarios que pueda provocar una vacuna de células enteras. Novotny y colaboradores en 1985, utilizaron varias fracciones de esta bacteria en su estudio, tales como fragmentos de antígeno de superficie celular (CSA) cuya composición era fundamentalmente de lipopolisacáridos, fibras y proteínas de membrana externa, formando parte de esta última una molécula de 68 kDa, la cual brindó protección a ratones ante infecciones por Bordetella bronchiseptica.

La prevención de las enfermedades respiratorias con el establecimiento de un programa de vacunación en la masa animal constituye una de las medidas a tomar para el mantenimiento del status microbiológico requerido en estos sistemas de producción (Shek et al, 1991), lo cual unido al mantenimiento de las condiciones higiénico- sanitarias permite garantizar la calidad microbiológica de esta especie animal (Clark, Ransom, Katryn, and Brown, 1996, Kraft et al, 1994). Otras de las vías para mantener las colonias de producción libres de Bordetella bronchiseptica y de otros muchos microorganismos de los cuales deben encontrarse libres estos animales es mediante la crianza en condiciones controladas (Aisladores o Zonas protegidas) las cuales garantizan que estos animales posean una microbiota estable y conocida, con lo que se favorece el desarrollo exitoso de cualquier investigación (Forte et al, 2001).

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Datos del autor.

Resumen Curricular del Autor principal

Lic. MSc. Sonia Lugo Marante

Lic. Joan Peña Rodríguez.

Centro Nacional Para la Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB).

La Habana, Cuba. Febrero 2007