Aislamiento de Yersinia enterocolitica y de Yersinia kristensenii en fecas de ovinos (página 2)

MATERIAL Y METODOS

Se utilizó un total de 237 muestras de fecas de ovinos provenientes de 6 ovejerías de la provincia de Valdivia. De éstas, 147 se obtuvieron de corderos muertos de hasta 30 días de edad que habían presentado un cuadro diarreico, 48 correspondieron a corderos vivos clínicamente sanos no mayores de un mes de vida y 42 ovejas adultas. De los animales vivos se extrajo una muestra fecal mediante tórula rectal y de los muertos se obtuvo la muestra directamente del contenido intestinal.

Las muestras se inocularon en buffer fosfato 1/15 M a pH 7.6 y se refrigeraron a 4° C hasta por 30 días, sembrándolas semanalmente en agar base selectivo Yersinia (Oxoid) adicionado de suplemento e incubando los cultivos a 25° C por 48 h. Se seleccionaron las colonias sospechosas que presentaron un centro de color rosado pálido a oscuro, rodeadas de un halo translúcido. Las cepas purificadas se identificaron bioquímicamente según Bercovier y Mollaret (1984), biotipificándolas de acuerdo a los criterios de Niléhn (1969), incubando los cultivos a 37° C, y se serotip-ficaron con los sueros monovalentes O:3, O:5 y O:9 elaborados en el Instituto Pasteur, Francia.

Además se investigó la presencia de plásmidos de virulencia, empleando las técnicas de expresión fenotípica de afinidad tintorial por cristal violeta y de crecimiento dependiente de calcio.

Para determinar la afinidad tintorial se emplearon cultivos en agar tripticasa de soya (TSA, Difco) de 24 h a 37° C, cubriendo la placa con 8 ml de solución de cristal violeta (85 µg/ml) por 2 minutos; una vez eliminado el colorante se observaron las colonias bajo lupa, con la finalidad de comprobar si existían colonias positivas al plásmido de virulencia, las que adquieren un color violeta oscuro a diferencia de las negativas, que no presentan variación de color (Bhaduri y col., 1987).

Para determinar la dependencia de calcio se utilizó el procedimiento descrito por Ridley y Toma (1989) y Bhaduri y col. (1990). Para tal efecto, las cepas se sembraron en duplicado, en agar TSA que se usó de control y en agar TSA adicionado de oxalato de sodio 0.25 M y cloruro de magnesio 0.25 M e incubadas a 37° C por 24 h. Las cepas positivas a plásmido de virulencia son de menor tamaño que las colonias en el medio control.  

RESULTADOS Y DISCUSION

Sólo de los animales que habían presentado diarrea se aislaron 5 cepas pertenecientes al género Yersinia, 3 de ellas correspondieron a Y. enterocolitica sin presentar plásmido de virulencia ni reaccionar frente a ninguno de los antisueros utilizados para la serotipificación. Las 2 cepas restantes se identificaron como Y. kristensenii. Los biotipos y las propiedades de las 5 cepas se resumen en el cuadro 1.

Las especies del género Yersinia encontradas en el presente trajo son ubicuas de gran distribución ambiental; sin embargo se aislaron solamente en animales de 3 de las 6 ovejerías en estudio, lo que es interesante continuar investigando, máxime si se constató su presencia solamente en corderos que habían presentado diarrea. Fue así como se identificaron 2 cepas de Y. kristensenii (cuadro 1), especie de microorganismo que no tiene mayor importancia clínica y que se había encontrado anteriormente en el contenido intestinal de cerdos y de peces de la zona (Zamora y col. 1979; Zamora y col. 1986), agente que también se ha aislado en el extranjero de ovinos enfermos y sanos (Bulliams, 1987; Philbey y col. 1991). A su vez, se aislaron 3 cepas de Y. enterocolitica, dos de las cuales pertenecían al biotipo 1 y una al biotipo 2, las que no se pudieron serotipificar con los antisueros utilizados (cuadro 1). El hallazgo del biotipo 1 no causa mayor extrañeza, ya que anteriormente se había encontrado en Valdivia en roedores silvestres (Zamora y col., 1979), bovinos (Zamora y col., 1981), cerdos (Zamora y col., 1986) y peces (Zamora y Enríquez, 1987); en cambio no se ha aislado de animales domésticos en la zona central del país, pero se informa el aislamiento de biotipos 4 y 5 de cerdos (Borie, 1992, 1993), biotipos que revisten gran importancia en la especie humana.

Los casos de enteritis en corderos debida a Y. enterocolitica descritos en el extranjero corresponden, más frecuentemente, al biotipo 5 serotipos O: 2, 3 y, aunque por lo general las cepas que se aíslan de los ovinos adultos son avirulentas (Slee y Button, 1990: Slee y Skilbeck, 1992), Philbey y col. (1991) comunican el aislamiento de cepas patógenas en ovejas y opinan que enfermedades intercurrentes parasitarias o infecciosas podrían predisponer a la yersiniosis intestinal por Y. enterocolitica. Por su parte, Bin-Kun y col. (1994) informan de un brote de yersiniosis en ovejas estresadas por transporte, enfermando el 41% con una mortalidad del 34% debido a cepas pertenecientes al biotipo 3; sin embargo, en esa oportunidad la diarrea fue ocasional y el cuadro se caracterizó por fiebre alta (40.1-41.5° C), graves trastornos torácicos y en otras vísceras y también lesiones cutáneas; preferentemente pústulas en la comisuras de los labios, en la base de las orejas y en el dorso de la nariz.

 Y. enterocolitica es un conocido enteropatógeno de ovinos en Australia y Nueva Zelanda que produce una enteritis acuosa no sanguinolenta con típicos microabscesos intestinales, los que no se presentan cuando la cepa es de baja virulencia, eliminando el microorganismo en gran cantidad durante la fase aguda de la enfermedad.

La mayoría de los animales adquiere la infección durante los dos primeros años de vida, siendo más susceptibles los menores de un año de edad, especialmente si concurren otros factores, pudiéndose mencionar estrés nutricional, destete, carencia de anticuerpos calostrales, helmintiasis, altas temperaturas estivales, entre otros (McSporran, 1984; Slee y Button, 1990; Slee y Skilbeck, 1992). En estos países la yersiniosis a Y. enterocolitica adquiere mayor importancia, no sólo por la infección entérica que produce, sino que también porque se considera que los ovinos y caprinos son las principales fuentes de infección para el bovino Slee y Skilbeck, 1992).

En el presente trabajo se aislaron cepas de Y. enterocolitica pertenecientes a los biotipos 1 y 2, no pudiéndose comprobar los serotipos ni pesquisar plásmido de virulencia, lo que puede hacer pensar que no tendrían importancia en cuadros entéricos por ser biotipos generalmente no asociados con enfermedad, aunque McSporran y col. (1984) informan el aislamiento del biotipo 2 de un animal con enterocolitis multilocal supurativa.

Con todo, la existencia de estos biotipos en nuestro medio podría causar otros problemas clínicos, hipótesis que nace de las investigaciones realizadas por Corbel y col. (1990). Al respecto, estos autores informan del aislamiento de los serotipos 6, 7 y 30 de los biotipos 1 y 2 carentes de plásmidos de virulencia a partir de fetos abortados en ovejas con preñez avanzada, fetos que presentaban focos hemorrágicos en riñón, hígado y pulmón. Más aún, logran reproducir experimentalmente la infección en ovejas de 90 días de preñez al inocularlas por vía endovenosa produciendo –aproximadamente 50 días postinoculación– abortos o nacidos muertos con lesiones similares a las ocurridas en los abortos de campo. Concluyen manifestando que posiblemente las cepas que carecen de plásmido de virulencia producen una lenta infección en la placenta y en el feto ovino, lo que provocaría el aborto después de ese largo período de incubación.

Como corolario final cabe manifestar, en atención a los resultados obtenidos, que es necesario continuar con estos estudios con el objetivo de poder determinar si las cepas Y. enterocolitica biotipos 1 y 2 juegan algún papel en los cuadros entéricos de corderos y buscar su presencia en abortos de ovejas, como también comprobar la existencia de los biotipos 3 y 5 por ser cepas probadamente patógenas.

BIBLIOGRAFIA

BERCOVIER, H., H.H. MOLLARET. 1984. Yersinia. En: Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. KRIEG, N.R. and J.J. HOLT (eds.). N.R. Williams & Wilkins, Baltimore, U.S.A., vol. 1: 498-506.

BHADURI, S., L. CONWAY, V. LACHICA. 1987. Assay of cristal violet binding for rapid identification of virulent plasmid-bearing clones of Yersinia enterocolitica, J. Clin. Microbiol. 25: 1039-1042.

BHADURI, S., C. TURNER-JONES, M.M. TAYLOR, R.V. LACHICA. 1990. Simple assay of calcium dependency for virulent plasmid-bearing clones of Yersinia enterocolitica, J. Clin. Microbiol. 28: 798-800.

BIN-KUN, H., X. DE-SHENG, O. HONG-BI, Z. SHI-XIANG, K.J. SLEE. 1994. Yersiniosis in sheep due to Yersinia enterocolitica, Br. Vet. J. 150: 473-479.

BORIE, C., A. SANDOVAL, V. PRADO. 1992. Aislamiento, bioserotipificación y estudio de patogenicidad de Yersinia enterocolitica en cerdos. XIII Congreso Panamericano de Ciencias Veterinarias, p. 279, Santiago, Chile.

BORIE, C.F., 1993. Yersinia enterocolitica en cerdos. Características microbiológicas, patogénicas y genéticas de las cepas porcinas. Tesis Magister en Ciencias Biológicas, mención Microbiología, Fac. de Medicina, Universidad de Chile, 66 pp.

BULLIAMS, J.A. 1987. Yersinia species infection of lambs and cull cows at an abattior, N. Z. Vet. J. 35: 65-67.

CORBEL, M.J., R.A. BREWER, D. HUNTER. 1990. Characterization of Yersinia enterocolitica strains associated with ovine abortion, Vet. Rec. 127: 526-527.

ENRIQUEZ, R., J. ZAMORA. 1987. Aislamiento de Yersinia ruckeri de carpas (Cyprinus carpio) en Valdivia, Arch. Med. Vet. 19: 33-36.

HUGHES, D. 1979. Isolation of Yersinia enterocolitica from milk and dairy farms in Australia, Appl. Bact. 46: 125-230.

HUNTER, D., S. HUGHES. 1983. Isolation of Yersinia enterocolitica from pigs in the United Kingdom, Vet. Rec. 112: 322-323.

McSPORRAN K.D., L.M. HANSEN, B.W. SAUNDERS, A. DAMSTEEGT. 1984. An outbreak of diarrhoea in hoggets associated with infection by Yersinia enterocolitica, N. Vet. J. 32: 38-39.

MOLLARET, H.H., J.M. ALONSO, H. BERCOVIER. 1982. Aspects biologiques diagnostiques et écologiques des yersinioses, Med. Infect. 12: 664-667.

MOLLARET, H.H. 1983. Enteritis par Yersinia, Laboratorio 75: 389-397.

NILEHN, B. 1969. Studies on Yersinia enterocolitica with special reference to bacterial diagnosis an occurrence in human acute enteric disease, Acta. Path. Microbiol. Scand. Supplementum 206, p. 12.

PHILBEY, A.W., J.R.W. GLASTONBURY, I.J. LINKS, L.M. MATTHEWS. 1991. Yersinia species isolated from sheep with enterocolitis, Austr. Vet. J. 68: 108-110.

RIDLEY, G., S. TOMA. 1989. Detection of pathogenic Yersinia enterocolitica by using congo redmagne-sium oxalate agar medium, J. Clin. Microbiol. 27: 213-214.

ROJAS, X., H. FIEDLER, R. MARTIN. 1985. Un caso de yersiniosis por Yersinia pseudotuberculosis en gato, Arch. Med. Vet. 17: 115-118.

SLEE, K.J., C. BUTTON. 1990. Enteritis in sheep and goats due to Yersinia enterocolitica infection, Austr. Vet. J. 67: 396-398.

SLEE, K.J., N.W. SKILBECK. 1992. Epidemiology of Yersinia pseudotuberculosis and Y. enterocolitica infection in sheep in Australia, J. Clin. Microbiol. 30: 712-715.

ZAMORA, J., O. ALONSO, E. CHAUAN. 1979. Isolement et characterization de Yersinia enterocolitica chez les rongeurs sauvages du Chili, Zbl. Vet. Med. B. 26: 392-396.

ZAMORA, J., A. MUÑOZ, O. ALONSO. 1981. Isolirung von Yersinia enterocolitica aus dem Blinddarminhalt von Rindern Süd-Chiles, Zbl. Vet. Med. B. 28: 503-505.

ZAMORA, J., O. ALONSO, R. MANSILLA. 1986. Aislamiento de Yersinia enterocolitica y de Yersinia frederiksenii del tracto intestinal del cerdo, Agro-Ciencia 2: 149-152.

ZAMORA, J., R. ENRIQUEZ. 1987. Yersinia enterocolitica, Yersinia frederiksenii and Yersinia intermedia in Cyprinus carpio (Linneo 1758), J. Vet. Med. B. 34: 155-159.

J. ZAMORA, M.V.; G. REINHARDT, M.V., Dr. Med. Vet.; M. POLETTE, T.M.; P. MACIAS, T.M.; J. ENGLISH, T.M. Instituto de Microbiología, Facultad de Ciencias, Universidad Austral de Chile, Casilla 567, Valdivia, Chile.