Células madre: diferenciación al linaje dopaminérgico para el tratamiento del Parkinson (página 2)

Fetales:

Se obtienen a partir del cordón umbilical y tienen características similares a las adultas.

¿CÓMO SE DESCUBRIERON LAS CÉLULAS MADRE?

Los científicos descubrieron hace más de 20 años el modo de obtener células madre de embriones de ratones. Sin embargo, la primera vez que se obtuvieron células madre embrionarias humanas fue en 1994. Se aislaron a partir de un blastocisto procedente de fecundación in vitro (FIV).

Blastocisto es el nombre que recibe el embrión de entre una o dos semanas antes de implantarse en el útero materno. Pero no fue hasta finales del año 1998 cuando un grupo de investigadores de la Universidad de Wisconsin (EEUU) consiguió el primer cultivo en el laboratorio de células madre embrionarias humanas a partir de blastocistos. Un cultivo o línea celular es un conjunto de células que se dividen continuamente en el laboratorio.

El poder crecer y mantener estas células in vitro supuso el comienzo del boom de las células madre. A partir de ese momento, grupos de investigación de todo el mundo han estudiado las características moleculares de estas células y han desarrollado sistemas más eficaces para cultivarlas in vitro. Además, se han hecho avances muy importantes a la hora de dirigir estas células hacia un tipo celular concreto. Esto ha originado que las células madre hayan adquirido un gran potencial terapéutico por sus aplicaciones en la regeneración de tejidos dañados y restablecimiento de funciones afectadas del cuerpo.3

¿QUÉ ES LA ENFERMEDAD DE PARKINSON?

La enfermedad de Parkinson se caracteriza por una degeneración progresiva de neuronas en el sistema nervioso central, que afecta de forma marcada a las neuronas que producen el mediador químico dopamina. El déficit en este neurotransmisor da lugar a una serie de síntomas que caracterizan a la enfermedad de Parkinson, el temblor, la rigidez y la disminución en los movimientos voluntarios.4

¿CÓMO SE CONSIGUE UN CULTIVO DE CÉLULAS MADRE?

Existen varias estrategias pero en todos los casos es un proceso largo, complejo y, por el momento, con una tasa de éxito baja. Para conseguirlo es necesario reproducir, en el laboratorio, el escenario en el que estas células actúan en el organismo. Además, estos modelos experimentales tienen que cumplir una serie de características:

• Tienen que reflejar de forma exacta la biología de las células madre.
• Tienen que ser reproducibles, es decir, los experimentos se tienen que poder repetir en el laboratorio.
• Tienen que ser procesos de una duración no muy larga, de modo que se puedan desarrollar, analizar y repetir en un periodo de tiempo razonable.

Si se quiere obtener un cultivo o línea celular de células madre embrionarias, el proceso comienza aislando, con técnicas de microcirugía, la masa celular interna del embrión. Esta masa de células se coloca sobre un soporte de vidrio o plástico donde existe un líquido rico en los nutrientes que necesitan las células para multiplicarse y crecer. Conforme las células van dividiéndose y aumenta su número, se va repitiendo el proceso. Así al final se obtiene una línea celular de células embrionarias. Este cultivo seguirá dividiéndose siempre que se mantenga bajo control el ambiente y se aporten los nutrientes necesarios para crecer.

Estrategia para obtener cultivos de células madre embrionarias a partir de un embrión. (Fuente: smartplanet)

Hoy en día la mayoría de las líneas de células madre embrionarias se generan a partir de embriones de ratón. Sin embargo, los investigadores están explorando nuevas formas para obtener este tipo de células:

• A partir de embriones sobrantes de procesos de FIV: Se pueden generar líneas de células madre embrionarias humanas a partir de embriones creados mediante FIV. En este caso, como la fecundación tiene lugar fuera del cuerpo de la mujer, es posible crecer estos embriones en el laboratorio.
• Mediante clonación terapéutica: Las células madre también se pueden obtener por el procedimiento empleado para generar clones "enteros" como la oveja Dolly. Sin embargo, al tener un uso estrictamente médico, se denomina clonación terapéutica.

En este proceso (ver imagen), se inserta el núcleo procedente de una célula adulta del donante en el interior de un óvulo al que se le ha quitado el núcleo. Así, el núcleo adulto aporta toda la información genética (el ADN) necesaria para dividirse la célula y el óvulo los nutrientes necesarios para que se lleve a cabo este proceso. Mediante un estímulo (por ejemplo una descarga química) se activa la multiplicación de esta célula como si fuera un zigoto. A partir de aquí se obtendrán células madre embrionarias genéticamente idénticas al donante adulto. Por ello esta técnica podría suponer una aproximación valiosísima para generar tejidos sin riesgo de rechazo.

Estrategias para obtener cultivos de células madre embrionarias mediante clonación terapéutica. (Fuente: smartplanet)

Para obtener una línea de células madre adulta (imagen), en primer lugar hay que aislar estas células de los distintos órganos del cuerpo, por ejemplo de la médula ósea. A continuación estas células se colocan en un soporte con el ambiente y los nutrientes necesarios para que empiecen a multiplicarse de forma equivalente a las embrionarias.

Estrategias para obtener cultivos de células madre embrionarias a partir de células madre adultas. (Fuente: smartplanet)

En la diferenciación hacia un fenotipo dopaminérgico, se deben de tener en cuenta diversos factores tales como FGF-2, FGF-8, Shh, ácido ascórbico, monofosfato de adenosina cíclico o BDNF ya que se trata de simular el proceso de desarrollo natural de estas neuronas pero in Vitro. Factores solubles de la familia de las Wnts secretadas por astrositos participan también en la diferenciación de las células dopaminergicas. Otro punto en la diferenciación dopaminergica de precursores del mesencéfalo ventral incluye la eliminación de mitógenos o adición de factores solubles como el suero bovino fetal en combinación con interleucinas (IL-1,IL-11), LIF, factor neurotrofico derivado de una línea celular glial, un amezcla de FGF-8, GDNF y Forskolin o el ácido ascórbico.1 También manipulaciones genéticas como la del gen Nurr 1 el cual es esencial para la supervivencia de células precursoras dopaminergicas mesenfalicas, así como también para su diferenciación en células productoras de dopamina.

PROTOCOLO DE DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS MADRE AL LINAJE DOPAMINÉRGICO

La diferenciación de las células madre embrionarias se llevara a cabo mediante células estromales no diferenciadas hESCs de la línea SA002.5 (Cellartis, Gothenburg) y se realizara la diferenciación en el Laboratorio de Biotecnología ME – CZH.

Las células del ES serán sembradas en platos revestidos de gelatina y mantenidas en medio Glasgow MEM complementado con 2000 U/ml LIF, 20 µg/mlblasticidina S, suero vacuno fetal al 1%, aminoácidos no esenciales 0.1mM, Piruvato 1mM y 2- mercaptoetanol 0.1mM.

Las células PA6 crecerán en un medio esencial alfa, complementado con el 10% FBS, Penicilina 50 µg/mly estreptomicina 50 U/ml. Todas las células se cultivaran en una incubadora con CO2 al 95% a 37ºC.

Las células madre embrionarias serán cultivadas usando PA6 CM para inducir la diferenciación de los nervios. Para preparar PA6 CM, las células confluentes PA6 se lavaran tres veces con buffer fosfato salino, iones de calcio y de magnesio [PBS (+)] y los medios respectivos serán substituidos por G-MEM complementados con el 5% de KSR, aminoácidos no esenciales 0.1mM, Piruvato 1mM y con o sin 2 – mercaptoetanol 0.1mM y heparina (10 o 100 µg/ml). Después de 48 h, el sobrenadante se recogerá y se filtrara con un filtro de 0.22 milímetros. El CM se recogerá usando 10 µg/mlde GMEM, y con 10 µg/ml de heparina; están referidos como CM-0H, CM-10H y CM-100H respectivamente.

Las células embrionarias se pondrán sobre unas placas de cristal revestidas de poliornitina (sigma) /fibronectina con una densidad de 1250 células/cm2 en G-MEM complementadas con KSR 5%, aminoácidos no esenciales a 0.1mM, Piruvato 1mM y 2-mercaptoetanol 0.1mM. Después de 5 horas, CM-0H, CM-10H (la concentración final de heparina es 3.3 mg/ml) o CM-100H (concentración final de heparina es 33 mg/ml) serán agregadas a la placa con una relación de 1:3 volúmenes de medio de cultivo y luego se mezclaran bien. Todas las placas se mantendrán a 37 ºC con el 5% de CO2 por 16 días.5

ANÁLISIS INMUNO HISTOQUÍMICO:

Los cultivos celulares preparados para el estudio de la diferenciación de neuronas de DA mediante las células derivadas de la actividad estromal (SDIA) de hESCs, serán visualizados por un microscopio fluorescente de Zeiss (Carl Zeiss, Jena, Alemania, http://www.zeiss.com) con cámara digital. El número total de colonias positivas de tirosina hidroxilasa serán contadas.

Para definir una colonia como inmunoreactiva aproximadamente el 10% de las células deben colorearse por efecto del marcador. Los números de células fueron determinados usando un sistema de la Echar-Rejilla de Olympus (Olympus). Usando una técnica sistemática de muestreo al azar, los núcleos seran delineados por la acción de HNuc y de BrdU o neuronal (NeuN) – o las células TH-positivas serán determinadas en un % de las áreas.6

BIBLIOGRAFÍA

1. Caracterización de efectores de diferenciación gabaergica en células madre como herramienta terapéutica de enfermedades neurodegenerativas. Martin Ibáñez Raquel
2. Adult stem cells. F. Prósper, C.M. Verfaillie. Servicio de Hematología y Área de Terapia Celular.
3. http://gslc.genetics.utah.edu/units/stemcells/scsuccess/
4. CÉLULAS MADRE Y ENFERMEDAD DE PARKINSON. Ernest Arenas Laboratorio de Neurobiología Molecular, MBB, Karolinska Institute, Estocolmo, Suecia 5. Pérdida de las neuronas dopaminérgicas mesencefálicas por la inactivación del gen Nurr1. Odila Saucedo Cárdenas, Roberto Montes de Oca Luna.
5. YAMAZOE Hironori, IWATA Hiroo. Efficient generation of dopaminergic neurons from mouse embryonic stem cells enclosed in hollow fibers. 2006.
6. BREDERLAU, Anke et al. Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Cells to a Rat Model of Parkinson’s disease: Effect of In Vitro Differentiation on Graft Survival and Teratoma Formation. 2008.

Autores

Carol Johanna Diaz Gutierrez

Erika Viviana Diaz Aguirre

Adriana Alejandra Marin Rodriguez

Oscar Javier Peralta Quevedo

ESTUDIANTES DE SEXTO SEMESTRE DE BIOLOGÍA

UNIVERSIDAD DEL TOLIMA