Multiplicación in vitro de Cúrcuma (página 2)

Materiales y Métodos

El presente trabajo se desarrolló en el laboratorio del Centro de Estudios de Biotecnología Vegetal de la Facultad de Ciencias Agrícolas, Universidad de Granma, para lo cual se desarrollaron los siguientes experimentos.

• Efecto del estado físico del medio de cultivo en la multiplicación in vitro de la Cúrcuma.

• Con el objetivo de evaluar el efecto del estado físico del medio de cultivo en la multiplicación in vitro de la cúrcuma, se utilizaron dos variantes:

Tratamiento 1. Medio de cultivo líquido.

• Tratamiento 2. Medio de cultivo solidificado con agar E a concentración de 6.0 g.l-1

Efecto de la concentración de sales propuestas por Murashige y Skoog (1962) en la multiplicación in vitro de la Cúrcuma.

Con la finalidad de evaluar el efecto de la concentración de las sales propuestas por Murashige y Skoog (1962) en la multiplicación in vitro de la Cúrcuma, fueron utilizadas a: 25, 50, 75 y 100% de su concentración en el medio de cultivo.

Empleo de diferentes concentraciones de 6-BAP en la multiplicación in vitro de Cúrcuma.

Para determinar el efecto del 6-BAP en la multiplicación in vitro de la Cúrcuma se utilizaron las siguientes concentraciones.

Tabla 1. Concentraciones de 6-BAP evaluadas en la multiplicación in vitro de la Cúrcuma.

En los distintos experimentos el material vegetal empleado fueron plantas in vitro de Cúrcuma en su segundo subcultivo, mantenidas en el medio de cultivo propuesto por Salvi et al (2002). Como medio de cultivo basal se utilizó el propuesto por Salvi et al (2002), compuesto por las sales de MS (1962), 6- BAP (2.0 mg.l-1), ácido naftalenacético (ANA) a 0.1 mg.l-1, vitaminas MS (10.0 ml.l-1) y sacarosa (40.0 g.l-1). El pH fue ajustado a 5,7. La esterilización de los medio de cultivo se realizó en autoclave a 121°C y 120 Kpa durante 20 minutos y se distribuyeron a razón de 10 ml en tubos de ensayo de 3 cm de diámetro y 10 cm de largo. La siembra del material vegetal se realizó en condiciones asépticas, colocándose un explante por frasco. Se utilizaron 20 explantes para cada tratamiento. La incubación se realizó en cámara de cultivo en condiciones de iluminación solar de 45-54 µmol m-2 s–1 de intensidad luminosa, humedad relativa del 70-80 % y 25 ± 2°C de temperatura.

A los 40 días posteriores a la siembra se evaluaron, para todos los tratamientos, las variables siguientes: Coeficiente de multiplicación y longitud de las plantas in vitro. Se empleó un diseño completamente aleatorizado y el procesamiento estadístico de los datos se realizó mediante un análisis de varianza de clasificación simple, aplicándose la prueba de rangos múltiples de Tukey para p≤0.05 al existir diferencias significativas y se utilizó el paquete estadístico desarrollado por el Departamento de Matemática Aplicada del Instituto de Ciencias Agrícolas (1991).

Resultados y Discusión

• Efecto del estado físico del medio de cultivo en la multiplicación in vitro.

En la tabla 2 se muestra el coeficiente de multiplicación y la longitud de las vitroplantas alcanzados al comparar los medios de cultivo en cuanto a su estado físico. Los mayores valores del coeficiente de multiplicación se alcanzaron cuando se utilizó el medio solidificado, con diferencias altamente significativas en relación con el medio de cultivo líquido, en cuanto a la longitud de las vitroplantas de forma general los valores alcanzados en el medio de cultivo líquido tuvieron un comportamiento ligeramente superior al del medio de cultivo semisólido, aunque no existieron diferencias significativas.

Tabla 2. Efecto del estado físico del medio de cultivo en coeficiente de multiplicación y longitud de las plantas in vitro de Cúrcuma.

Los resultados indican que la Cúrcuma es una especie que responde mejor a la multiplicación en medios de cultivo sólidos. Respecto a esto Pierik (1989) señaló que la respuesta de los cultivos al empleo de medios líquidos depende en gran medida de la especie y de la fase de desarrollo en que este se encuentre. Jiménez et al. (1996) recomendaron el empleo de medios semisólidos para inducir brotes axilares de Musa sp, debido fundamentalmente a una mejor oxigenación de los explantes y con ello una disminución de los daños por hipoxia.

Machado et al. (2002) durante la multiplicación in vitro de Gerbera jamessonii H utilizando medios de cultivo semisólido, obtuvieron un mayor coeficiente de multiplicación en comparación con el medio de cultivo líquido. El efecto negativo de los medios de cultivo líquidos en esta fase en condiciones estáticas ha sido observado por diferentes autores en otras especies como plátanos y bananos (Orellana, 1995), papa (Agramonte, 1999).

Resultados obtenidos por Machado et al. (2002) indican una longitud significativamente superior de plantas in vitro de Gerbera jamessonii H, cuando utilizaron el medio de cultivo en forma semisólida en comparación con el empleo del medio de cultivo líquido.

Al evaluar el efecto del estado físico del medio de cultivo en la micropropagación del cultivar de plátano FHIA -21 (AAAB), Jiménez et al. (2002) lograron resultados similares en cuanto a la altura de la planta y el número de raíces al comparar medios de cultivo semisólido y líquido.

Fajardo (2006), obtuvo resultados significativamente superiores en el número de yemas brotadas y la supervivencia cuando utilizó el medio de cultivo semisólido (2.5 g .l-1 de Gelrite) en el establecimiento in vitro de yemas axilares de Guagua angustifolia en comparación con el empleo del medio de cultivo líquido.

Efecto de las sales propuestas por Murashige y Skoog (1962) a diferentes concentraciones en la multiplicación in vitro.

La influencia de la concentración de las sales propuestas por Murashige y Skoog (1962) en el coeficiente de multiplicación y longitud de las plantas in vitro a los cuarenta días después de la siembra se presenta en la tabla 3, y se puede observar una tendencia general a aumentar con el aumento de la concentración de las sales. Los mayores valores del coeficiente de multiplicación correspondieron a los tratamientos 3 y 4, los cuales difieren de forma significativa de los tratamientos 1 y 2 y a su vez estos difieren entre si. La longitud de las vitroplantas fue significativamente superior al utilizar las sales al 100%.

Tabla 3. Influencia de la concentración de las sales propuestas por Murashige y Skoog (1962) en el coeficiente de multiplicación y longitud de vitroplantas de Cúrcuma a los 40 días después del subcultivo.

Medias con letras no comunes difieren para (p0.05) según la prueba de rangos múltiples de Tukey.

Según los resultados obtenidos, todo parece indicar que la Cúrcuma es un cultivo que requiere de altas concentraciones de compuestos inorgánicos para su desarrollo, y una disminución del contenido mineral en el medio de cultivo provoca retardos en su crecimiento y multiplicación. Al respecto, Mroginski y Scocchi, (1998), al conservar meristemos de Paraíso (Melia azedarach) durante seis meses, obtuvieron que la reducción de las sales Murashige y Skoog (1962) hasta un 25% de su concentración, provocó una reducción del crecimiento y desarrollo de las plantas in vitro. García et al. (1999) refirieron un retardo en el crecimiento de vitroplantas caña de azúcar (Saccharum spp) al reducir la concentración de las sales MS en el medio de cultivo hasta un cuarto de su concentración.

Trabajos realizados por Trujillo et al. (2001) en los cuales variaron la concentración de sales inorgánicas en el medio de cultivo para la micropropagación de A. andracarium, posibilitaron obtener vitroplantas de mayor altura, cuando el medio de cultivo contenía el 100% de las sales.

Alvarado et al. (2000), obtuvieron un mayor número de yemas brotadas, mayor longitud del brote y número de nudos al utilizar las sales MS al 100% de su concentración en la micropropagación de Ruda.

Empleo de diferentes concentraciones de 6- BAP en la multiplicación in vitro de Cúrcuma.

Los reguladores del crecimiento son muy empleados en el cultivo in vitro, ya que sus efectos favorecen en gran medida el crecimiento y desarrollo de las plantas. En la tabla 4, al evaluar el 6-BAP a diferentes concentraciones se observa que el coeficiente de multiplicación mostró una tendencia a aumentar con el incremento de la concentración de 6-BAP, obteniéndose valores significativamente menores cuando se utilizó la concentración de 1.0 mg.l-1, la longitud de las vitroplantas fue disminuyendo a medida que aumentó la concentración de 6-BAP, alcanzando los valores más bajos en las concentraciones de 3.0 y 4.0 mg.l-1. En los tratamientos donde se empleó el 6-BAP a la concentración de 4.0 mg.l -1 se observó la aparición de plantas con síntomas de hiperhidricidad.

Tabla 4. Efecto del 6- BAP a diferentes concentraciones en la multiplicación in vitro de Cúrcuma.

Los resultados evidencian un efecto positivo del 6-BAP en la multiplicación in vitro de la Cúrcuma, los cuales coinciden con Pierik (1987), quien refirió que el 6-BAP promueve la formación de brotes axilares, pues hace decrecer la dominancia apical, efecto que se incrementa con el aumento de su concentración.

Marcia et al. (2000), al evaluar la multiplicación in vitro de la Cúrcuma zedoaria, partiendo de ápices y utilizando el medio de cultivo propuesto por Murashige y Skoog (1962) suplementado con 2.0 mg.l-1 de 6-BAP concluyeron que es una técnica sencilla y económicamente viable. Prathanturarug et al. (2007), lograron la multiplicación y regeneración de yemas de Cúrcuma empleando el medio de cultivo propuesto por Murashige y Skoog (1962), suplementado con diferentes concentraciones de 6-BAP (1-5 mg.l-1) y kinetina (0.5-1.0 mg.l-1); además, determinaron que la concentración de 5.0 mgl-1 de 6-BAP fue óptima para la multiplicación in vitro.

Al analizar la respuesta in vitro de la Teca (Tectona grandis) a diferentes citoquininas, Daquinta et al. (2000) observaron en los explantes analizados (ápices) un número mayor de brotes emitidos en los tratamientos donde se combinaron 6-BAP y kinetina. Agramonte et al. (2001), al evaluar el efecto de diferentes las dosis de 6-BAP (0, 0.35, 0.50 y 1.0 mg.l-1) en la multiplicación in vitro de Eucaliptus grandis, observaron tendencia al aumento de los valores de la variable número de brotes por explantes y disminución de la longitud de los mismos con el aumento de la concentración, demostrando con esto que dosis relativamente altas inducen a un alto ahijamiento axilar y reducen el tamaño del brote, lo que produce una afectación del coeficiente de multiplicación, pues en el momento del subcultivo, muchos de estos brotes no pueden ser individualizados.

Conclusiones

El empleo del medio de cultivo en estado semisólido propició un mayor coeficiente de multiplicación en comparación con el medio de cultivo en estado líquido.

Se logró un incremento en el coeficiente de multiplicación y la longitud de vitroplantas en la fase de multiplicación al emplear las sales propuestas por Murashige y Skoog (1962) al 75 y 100% de su concentración.

La adición de 6-BAP a concentraciones de 3.0 y 4.0 mg.l-1 en el medio de cultivo, durante la fase de multiplicación propició un incremento en el coeficiente de multiplicación y una disminución en la longitud de las vitroplantas.

Bibliografía

Agramonte, D.1999. Métodos biotecnológicos para la producción de semilla original de papa (Solanum tuberosum, L.) Tesis en Opción al Título de Doctor en Ciencias Agrícolas. Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central de Las Villas. Santa Clara. Cuba.

Agramonte D., Delgado L., Troncones A., Pérez M., Ramírez D y Gutiérrez O. 2001. Micropropagación del Eucaliptus grandis (Hill ex Maide) a partir de segmentos nodales. Biotecnología Vegetal, 1 (2): 109-114.

Alvarado K., Calas M y Rodríguez R. 2000. Efecto de la concentraciones de sales MS en el establecimiento in vitro de segmentos nodales de Ruda. XIII Congreso Científico del INCA. Programas y Resúmenes. P 22.

Barthelemy S., Vergnes L., Moynier M., Guyot D., Labidalle S y Bahrsoni L. 1998. Curcumin and Curcumin derivates inhibitTal-mediated transactivation of type 1 human inmunodeficiency virus long terminal repeat. Res. Virol, 149: 43-52.

Borthakur M y Bordoloi DN. 1992. Micropropagation of Curcuma amada Roxb. Journal of Spice and Aromatic Crops, 1: 154-156.

Chandra D y Gupta S. 1972. Anti- inflamatory and anti-arthritic activity of volatile oil of Cúrcuma longa (Holdi) Indian Journal Medicines, 60: 138.

Daquinta M., Ramos L., Rodríguez R y Escalona M. 2000. Algunos elementos en la micropropagación de la Teça. Biotecnología Vegetal, 1: 39-44.

Fajardo, L. 2006. Establecimiento in vitro de yemas axilares de Guadua angustifolia Kunt. Tesis en Opción de Título de Master en Biotecnología Vegetal. IBP. UCIV 80.pp.

García L., Rodríguez M., Martínez Y., Sarría B y Pichardo T. 1999. Aplicación de la Biotecnología en la conservación de los recursos filogenéticos de la caña de azúcar (Saccharum spp. híbrido). Libro de Reportes Cortos. V Coloquio Internacional de Biotecnología Vegetal. IBP. Villa Clara.

Jiménez F., Ramírez A y Agramonte D. 2002. Empleo de Biobrás-16 en la micropropagación del cultivar de plátano FHIA- 21 (AAAB). Biotecnología Vegetal, 2 (3): 131-136.

Jiménez E. 1996. Generalidades del cultivo in vitro. En: Pérez JN (ed). Propagación y Mejora Genética de plantas por Biotecnología. Cap. 1. Vol.1. IBP. Santa Clara. P. 13-14.

Machado P., Agramonte D., Almanza N., Díaz D y Gómez L. 2002. Micropropagación de Gerbera jasmessonii H. Bolus. Biotecnología Vegetal, 2 (2) 169- 178.

Márcia M., Antônio F., Amaral C y Murilo M. 2000. Quantificação da micropropagação de Curcuma zedoaria Roscoe. Science Agriculture, 57 (4).

Mesa M., Ramírez-Tortosa M., Aguilera C., Ramírez-Bosca A y Gil A. 2000. Efectos farmacológicos y nutricionales de los extractos de Cúrcuma longa L. y de los curcuminoides. Ars Pharmaceutica, 41: 3, 307-321.

Ministerio de la Agricultura. 2004. Lineamientos para los subprogramas de la Agricultura Urbana para el 2005-2007 y sistemas evaluativos. Grupo Nacional de Agricultura Urbana.

Mroginski L y Scocchi A. 1998. Conservación de germoplasma de Paraíso (Melia azedarach) mediante el cultivo de meristemos. Libro de resúmenes. III Encuentro Latinoamericano de Biotecnología Vegetal. Palacio de las Convenciones. Ciudad de la Habana.

Murashige T y Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, 15: 473 – 497.

Orellana P. 1995. Tecnología para la micropropagación in vitro de clones de Musa sp. Tesis en Opción al Título de Doctor en Ciencias Agrícolas. Instituto de Biotecnología de las Plantas. Villa Clara. Cuba.

Orellana P.1998. Introducción a la propagación masiva. En: Pérez, JN (eds). Propagación y Mejora de Plantas por Biotecnología. Instituto de Biotecnología de las Plantas. Villa Clara.

Pathanturarug S., Soothrochacreannon S., Chuakul N., Phaideen W y Saralamp P. 2003 High frequency shoot multiplication in Curcuma longa using thidiazuron. Plant Cell Reports, 21(11): 1054-1059.

Pierik R.1987. Preparation and composition of the nutrients media. En: In vitro culture high plant. Martinus Nijoff Publisher p. 45- 71.

Pierik, R. 1989. Cultivo in vitro de las plantas superiores. Editorial. Mundi Prensa. Madrid. P. 49-113.

Salvi N., Deela G y Eapen S. 2002. Micropropagation and Fiel evaluation of micropropagated plant of tumeric. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 68: 143-151.

Terán Z., Cabrera A y Peña L. 2004. Cúrcuma (Cúrcuma longa L.) Importancia y necesidad de su producción en las condiciones de Cuba. XIV Congreso Científico del INCA. Libro de Programas y Resúmenes.

Trujillo R., Concepción O., Daquinta M., Nápoles L y Barmaseda M. 2000. Propagación in vitro de Anthurium andraeanum Lind. variedad Sonate. Biotecnología Vegetal, 1: 33-38.

Agradecimientos

Agradecemos al Ingeniero Zoilo Terán del Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA) por la entrega del material vegetal utilizado en nuestro trabajo y a ONG Euskadi- Cuba del país Vasco España, por el financiamiento del proyecto.

Autor:

Ángel Espinosa Reyes

Juan José Silva Pupo

Misterbino Borges García

Orlando González Paneque

Ilennia González Aliaga

Yariuska Maceo

Centro de Estudios de Biotecnología Vegetal. Facultad de Ciencias Agrícolas. Universidad de Granma. CP 85100. Bayamo. Granma. Cuba.

Datos del Autor: Ángel Espinosa Reyes (Bayamo. Granma. Cuba). Graduado de licenciado en Química en el año 1989. Posee 23 años como docente, ha impartido las asignaturas de Química General, Química Analítica en las especialidades de Agronomía, Ingeniería Forestal e ingeniería Industrial. Ha trabajado durante 15 años en la propagación de plantas por cultivo de tejidos y la conservación de germoplasma in vitro.

Bayamo. Granma. Cuba. Febrero de 2008.