Acclimatization and field evaluation of sweet potato encapsulated buds.
Yemas de boniato del clon CEMSA 78-354, tomadas de tubérculos mantenidos en agua en condiciones semicontroladas de laboratorio fueron encapsuladas en alginato de sodio al 3%, disuelto en las sales Murashige y Skoog, 1962 (MS) complementadas con 1.0 mg.l-1 de tiamina, 100.00 mg.l-1 de mioinositol, 10.0 mg.l-1 de ácido giberélico, 1.0 mg.l-1 de 6-bencilaminopurina, 0.05 mg.l-1 de ácido indolacético y 30 g.l-1 de sacarosa. Durante la fase aclimatización la supervivencia y el crecimiento fueron superiores cuando se emplearon yemas encapsuladas brotadas in vitro en comparación con las yemas recién encapsuladas y yemas sin encapsular. Las plantas provenientes de yemas encapsuladas mostraron mayor supervivencia y número de ramas, pero menor número y peso de los tubérculos en comparación con las plantas obtenidas por el método tradicional cuando se evaluaron en condiciones de campo.
Palabras clave: semilla sintética, Ipomoea batata, encapsulación, semilla artificial
Abstract
Buds of CEMSA 78-354 sweet potato clone taken from tubers maintained in semicontrolated conditions were encapsulated in 3% sodium alginate beads containing Murashige and Skoog, 1962 (MS) salts solution supplemented with 100.00 mg.l-1 myoinositol, 10.0 mg.l-1 giberellic acid, 1.0 mg.l-1 6-bencilaminopurin, 0.05 mg.l-1 indolacetic acid and 30 g.l-1 sucrose. Survival and growth using encapsulated buds with shoot and root development in vitro were bigger than using buds just encapsulated and not encapsulated buds during acclimatisation. The plant from encapsulated buds shown higher survival and number of branches but the number and weigh of tuber were lower than plants from traditional sown methods in field conditions.
Key Words: synthetic seed, Ipomoea batatas, encapsulation, artificial seed
El boniato ( Ipomoea batatas (L.) Lam.) ocupa el sexto lugar entre los alimentos más importantes del mundo (Jarret, 1991). En Cuba, el boniato se cultiva en casi todas las localidades, por ser un cultivo que se adapta fácilmente a casi todas las condiciones climáticas y de suelo. Este cultivo juega un importante papel desde el punto de vista económico y para la alimentación humana y animal, constituyendo una fuente de carbohidratos, vitamina A y calcio (González, 1996). La necesidad de satisfacer las demandas alimenticias de la población, exige la búsqueda de alternativas para lograr la recuperación del boniato, siendo una de las limitantes para esto, la insuficiente cantidad y calidad de las semillas. La aplicación de técnicas biotecnológicas, para la producción de semillas libres de plagas y enfermedades, el mejoramiento genético y la conservación de la diversidad genética de los cultivos constituye una alternativa muy prometedora; sin embargo, estas técnicas son muy costosas, lo que exige la búsqueda de nuevas vías que permitan acortar el ciclo de producción de la semilla y reducir los costos. La encapsulación de brotes, ápices y yemas ha constituido una alternativa interesante de propagación en varias especies: Morus indica L. (Bapat y Rao, 1987), banano (Rao et al., 1993) kiwi, melocotón y frambuesa (Piccioni y Standarti, 1995), papa (Vilariño et al., 1996) y varias especies forestales (Maruyama et al., 1997), es una forma ventajosa de obtención de semillas de calidad, libres de plagas y enfermedades en un corto periodo de tiempo, esto favorece la posibilidad de incorporar a la cápsula: nutrientes, fungicidas, reguladores del crecimiento, microorganismos beneficiosos, etc. El encapsulado de yemas ofrece posibilidades para la siembra mecanizada y la conservación e intercambio internacional de germoplasma debido a su pequeño tamaño y facilidad de manejo, sin embargo, existen muy pocas referencias relacionadas con el comportamiento en condiciones ex vitro de yemas, brotes y embriones encapsulados, fundamentalmente sobre su comportamiento en condiciones de campo. El presente trabajo se desarrolló con el fin de evaluar el comportamiento de yemas de boniato encapsuladas en condiciones de aclimatización y de campo.
Material vegetal
Para todos los experimentos se emplearon yemas de boniato provenientes del clon CEMSA 78-354, tomadas de tubérculos mantenidos en agua en condiciones semicontroladas de laboratorio. Las yemas se desinfectaron en una solución de hipoclorito de sodio al 1% de cloro activo durante 15 minutos. Se enjuagaron tres veces con agua destilada estéril en la cabina de flujo laminar y fueron cortadas a un tamaño de 1.5-2.0 cm, de forma que se eliminaran los tejidos afectados durante la desinfección. Posteriormente se colocaron sobre papel de filtro seco estéril durante tres días con el fin de propiciar el desarrollo de raíces y la elongación de las yemas.
Encapsulación
En el encapsulado se empleó alginato de sodio al 3%, disuelto en las sales MS complementadas con 1.0 mg.l-1 de tiamina, 100.0 mg.l-1 de mioinositol, 10.0 mg.l-1 de ácido giberélico, 1.0 mg.l- de 6-bencilaminopurina, 0.05 mg.l- de ácido indolacético y 30 g.l-1 de sacarosa, el pH se ajustó a 5.6 antes de disolver el alginato. En el momento de la encapsulación, las yemas se mezclaron con la disolución de alginato de sodio al 3% estéril en una cristalizadora, previamente esterilizada y se hicieron gotear utilizando una pipeta a la cual se había cortado la punta, en una disolución de CaCl2 .2H2O 100 mmol.l- en la cual se mantuvieron durante 30 minutos con vista a obtener la dureza adecuada. Se colocaron a razón de cuatro cápsulas en frascos que contenían 20 ml de medio de cultivo MS sin reguladores del crecimiento y se incubaron en cámara de luz solar, con una intensidad luminosa de 54 µmol.m-2s-1, 25± 2° C de temperatura y humedad relativa de 80 a 90 % durante cuatro semanas.
Aclimatización
Se realizó en la fase de adaptación de la Biofábrica de Granma y se evaluaron los siguientes tratamientos.
1-. Yemas encapsuladas cultivadas durante cuatro semanas in vitro, las cuales poseen brotes y raíces que han emergido de la cápsula, con una longitud media de 2.5 cm, 2.7 hojas y 4.5 raíces por planta.
2-. Yemas recién encapsuladas (el encapsulado se realizó siguiendo el procedimiento antes descrito en condiciones no estériles y seguidamente se plantaron en el sustrato escogido)
3-. Yemas no encapsuladas (segmentos nodales conteniendo una yema axilar de 2.0 cm de longitud)
Todos los tratamientos fueron plantados en bandejas de polieturano, sobre un sustrato compuesto por una mezcla de 50% de cachaza totalmente descompuesta y 50% de estiércol vacuno. Se realizaron tres riegos al día durante 10 minutos utilizando microaspersores. Se empleó un diseño completamente aleatorizado con tres repeticiones por tratamiento, cada bandeja constituyó una repetición, con 60 yemas por bandeja.
A los 30 días se evaluaron las variables: Porcentaje de supervivencia; se consideraron vivas las yemas que mantenían su coloración verde, número de hojas; se determinó por conteo del número total de hojas, independientemente de su estado de desarrollo, ancho y largo de la hoja; se midió con una regla la 3ra hoja completamente extendida contando a partir de la yema apical, el ancho se midió por la parte central de la hoja y el largo se tomó desde la base (unión con el peciolo) hasta el ápice de la hoja.Evaluación en campo
Se realizó en áreas de la finca de semillas "El Tamarindo" perteneciente a la Empresa de Cultivos Varios de Cautillo (ECVC) Bayamo, Granma, en el periodo comprendido entre el 13 de Junio y el 27 de Octubre de 2000. Se utilizó un diseño de bloques al azar, con tres repeticiones y cinco tratamientos. Se utilizaron parcelas de 3.6 m de ancho y 5.0 m de largo, para un tamaño de 18.0 m2, el marco de plantación entre surcos fue de 0.90 m y la distancia entre plantas de 0.23 m para un total de 84 plantas por parcela.
No se aplicó fertilización alguna, ni productos químicos durante la investigación, así mismo no se realizaron riegos durante el ciclo de evaluación, durante los últimos 120 días se colocaron trampas de ferromonas para la captura de tetuanes.
Los tratamientos evaluados fueron:
I-. Plantas de boniato provenientes de yemas encapsuladas, aclimatizadas en bandejas de polieturano durante 30 días.
II-. Esquejes de 20-25 cm de longitud provenientes de tubérculos mantenidos en condiciones semicontroladas de laboratorio.
III-. Esquejes de 20-25 cm de longitud provenientes de bancos de semillas (método tradicional).
El porcentaje de supervivencia del material vegetal se evaluó por conteo del número de plantas vivas a los 10 días posteriores a la siembra y en ese momento se realizó la resiembra de las plantas muertas. El cierre de campo se determinó visualmente a los 30 días después de la plantación. A los 135 días se realizó la cosecha. Se tomaron 10 plantas por parcela y se evaluaron los siguientes indicadores: Número de ramas por planta; se determinó por conteo del número total de ramificaciones de la planta, largo de las ramas; se midió utilizando una cinta métrico la rama más larga, desde la base del tronco hasta la yema apical, número de tubérculos por plantas; se realizó por conteo del número total de tubérculos por planta independientemente de su tamaño, peso de los tubérculos; se determinó el peso total de tubérculos por planta utilizando una balanza técnica y se dividió este resultado entre el número de tubérculos por planta.
Los datos se procesaron mediante un análisis de varianza simple, empleando el sistema estadístico Statistic. Cuando existieron diferencias significativas se aplicó la prueba de comparación de medias de Tukey para un nivel de significación de 0.05.
El paso más crítico en la tecnología de la semilla sintética es la formación de plantas a partir de brotes o embriones encapsulados bajo condiciones no estériles ( Fujii et al., 1989), por esto en muchos casos se promueve antes su brotación y enraizamiento in vitro. Como puede apreciarse en la tabla 1 se obtuvo un 100% de supervivencia de las plantas obtenidas de yemas encapsuladas brotadas in vitro y sólo el 37.5% y 81.6% en las yemas recién encapsuladas y sin encapsular respectivamente. Como demuestran estos resultados, las yemas encapsuladas brotadas in vitro toleraron mejor las condiciones de aclimatización, lo cual lógicamente estuvo dado por presentar un sistema foliar y radicular ya desarrollado cuando son plantadas en estas condiciones. Estos resultados coinciden con los referidos por Murayama et al., 1997 en ápices encapsulados de Cedrela odorata L., Guazuma crinita Mart. y Jacaranda mimosaefolia D.Don los que informaron valores de conversión in vitro de 60, 80 y 100% respectivamente, pero cuando se llevaron a condiciones in vivo se redujo a un 6.7, 3.3 y 31.7%. Sin embargo, cuando fueron incubadas in vitro durante una semana los valores de conversión in vivo se incrementaron entre 28.6 y 100%, respectivamente. Quiala et al. (1997) obtuvieron en embriones somáticos encapsulados de café y de caña de azúcar mayores valores de conversión en planta después de ser sometidos a un periodo de pregerminación in vitro.
Tabla 1. Comportamiento de la supervivencia de yemas de boniato encapsuladas durante la aclimatización.
Tratamiento | Supervivencia (%) |
Yemas encapsuladas y brotadas in vitro | 100 |
Yemas recién encapsuladas | 37.5 |
Yemas sin encapsular | 81.6 |
La baja supervivencia de las yemas recién encapsuladas consideramos que pudo estar dada por diferentes causas entre ellas: imposibilidad de las yemas para romper rápidamente la cápsula, lo que propicia el ataque de insectos, fundamentalmente hormigas, las cuales son atraídas por el medio de cultivo que contiene la cápsula lo cual afecta la brotación, además un exceso de humedad del sustrato que provocó la pudrición del explante. Jiménez y Quiala (1998) refieren entre los factores que influyen en la conversión en planta de las yemas y embriones encapsulados: dureza de la cápsula, ataque de insectos y microorganismos, la calidad del endospermo artificial, entre otros. Bapat y Rao (1988) obtuvieron en condiciones in vitro un 16% de conversión en planta de yemas encapsuladas de Sandalwood y no lograron conversión en planta cuando estas fueron plantadas in vivo. Resultados obtenidos por Standardi y Piccioni (1997) refieren porcentajes de supervivencias del 100% y 90.4% cuando plantaron yemas encapsuladas de Malus pumila Mill. en agar y en una mezcla de suelo respectivamente.
La evaluación sistemática del crecimiento y desarrollo del material vegetal durante la aclimatización permite determinar el momento adecuado para llevar las plantas al campo, además, posibilita evaluar la calidad del material vegetal que se llevará a condiciones de producción. En la tabla 2 se muestra que las plantas obtenidas a partir de yemas encapsuladas convertidas in vitro alcanzaron valores significativamente superiores en todas las variables evaluadas en comparación con las plantas obtenidas de yemas recién encapsuladas y yemas sin encapsular.
Tabla 2. Comportamiento del número de hojas por planta, largo y ancho de la hoja después de 30 días en la fase de aclimatización de yemas de boniato encapsuladas.
Tipo de explante | Número de hojas por planta | Largo de la hoja (cm) | Ancho de la hoja (cm) |
yemas encapsuladas brotadas in vitro | 6.84 a | 7.57 a | 4.05 a |
Yemas recién encapsuladas | 3.93 b | 5.36 b | 2.60 b |
Yemas sin encapsular | 4.45 b | 6.21 b | 2.59 b |
Coeficiente de variación | 14.6% | 13.8% | 14.6% |
Medias con letras diferentes en una misma columna difieren según Tukey ( p< 0.05)
Aguilera et al. (1999) obtuvieron mayor altura de las plantas y mayor número de hojas por planta cuando emplearon estiércol vacuno como sustrato en la aclimatización de plantas in vitro de ñame.
Lograr una elevada supervivencia del material vegetal sembrado en el campo evita gastos por resiembra, facilita el control de las plantas indeseables y un mayor aprovechamiento del área de cultivo. La supervivencia evaluada a los 10 días posteriores a la siembra (Tabla 3) muestra que los mayores valores se alcanzaron cuando se emplearon plantas provenientes de yemas encapsuladas. Estos resultados pueden atribuirse a que estas poseen al ser sembradas en el campo un sistema radical y foliar desarrollado, además se trasplantaron con el sustrato en el cual crecieron durante la fase de aclimatización, esto les permitió resistir mejor las condiciones de escasa humedad y altas temperaturas bajo las cuales se plantó el experimento, no así el material proveniente de tubérculos y de bancos de semillas (método tradicional de siembra) los cuales deben comenzar a desarrollar raíces y brotes para poder nutrirse y en los primeros días del experimento la humedad del suelo no fue la óptima por no existir posibilidades de riego.
El cierre de campo realizado por estimación visual a los 30 días reflejó un 80% de área cubierta, excepto cuando se emplearon esquejes de tubérculos (Tratamiento II) donde se alcanzó sólo un 60% de área cubierta, el desarrollo de las plantas en todas las variantes fue vigoroso, mostrando un intenso color verde y hojas de un tamaño normal para el clon empleado, sin diferencias entre los tratamientos evaluados.
Tabla 3. Comportamiento en condiciones de campo del material vegetal evaluado.
Tratamientos | Supervivencia (%) | Ramas/ planta | Longitud de las ramas (m) | Tubérculo/planta | Peso de los tubérculos (g) |
I | 98.01 | 18.56 ab | 2.57 a | 0.66 b | 59.13 a |
II | 40.07 | 14.80 bc | 2.55 a | 0.73 b | 54.60 a |
III | 81.74 | 11.60 c | 2.53 a | 1.33 a | 55.66 a |
Coeficiente de variación (%) |
| 11.32 | 10.01 | 27.7 | 22.10 |
I- Plantas provenientes de yemas encapsuladas.
II- Esquejes provenientes de tubérculos mantenidos en condiciones semicontroladas de laboratorio.
III- Esquejes provenientes de bancos de semillas (método tradicional).
Medias con letras diferentes en una misma columna difieren según Tukey ( p< 0.05)
El número de ramas por planta (Tabla 3) es mayor en las plantas provenientes de yemas encapsuladas con respecto a los demás tratamientos, esto puede estar dado por el efecto residual de los reguladores del crecimiento empleados en el medio de cultivo para la encapsulación, fundamentalmente el 6-BAP, del cual se conoce, favorece la formación de brotes múltiples y el rejuvenecimiento que provoca el cultivo in vitro. La longitud promedio de las ramas no mostró diferencias significativas entre los tratamientos. Los resultados alcanzados son indicadores de las potencialidades del empleo de yemas encapsuladas de boniato como fuente de semillas, pues al proporcionar un elevado número de ramas por planta incrementaría el volumen de material de siembra, además de las ventajas asociadas a la sanidad de la semilla. Mederos (1999) al evaluar plantas in vitro de yuca (Manihot esculenta) en condiciones de campo obtuvo un comportamiento agronómico superior de estas con respecto a las plantas propagadas por el método tradicional. Así mismo López et al. (1999) obtuvieron un comportamiento agronómico superior de las plantas de boniato obtenidas del cultivo in vitro en comparación con las obtenidas por el método tradicional de propagación.
En la tabla 3 puede observarse, además, que el número de tubérculos por planta fue mayor cuando se empleó el método tradicional, sin embargo el valor obtenido estuvo muy por debajo de las potencialidades que posee el clon empleado. Cuando se emplearon plantas provenientes de yemas encapsuladas se observó, en ocasiones, el desarrollo de gran número de raíces pequeñas sin llegar a engrosar. En esta tabla se muestra, además, que no existieron diferencias significativas entre los tratamientos evaluados en cuanto al peso de los tubérculos, los cuales como lo indican los valores obtenidos (50-60 g) fueron tubérculos pequeños, a pesar de extenderse el periodo de cosecha hasta los 135 días. Estos resultados coincidieron con los obtenidos por Templeton-Somer y Collins (1986) quienes encontraron que las plantas de boniato obtenidas in vitro de hojas, yemas laterales o nodos produjeron menores rendimientos que los provenientes de esquejes. Schutthers et al. (1994) obtuvieron un alto número de tubérculos por planta, sin embargo, de un tamaño muy pequeño, cuando evaluaron plantas de boniato obtenidas de embriones somáticos. Templeton- Somer y Collins (1986) determinaron que el uso de las técnicas in vitro reduce el rendimiento de tubérculos de boniato sólo en el primer ciclo de siembra, debido fundamentalmente al rejuvenecimiento del material vegetal, no encontrando diferencias con el material proveniente de esquejes en un segundo ciclo de siembra. Hattori (1988) planteó que los bajos rendimientos obtenidos en la producción de tubérculos de boniato por las plantas procedentes del cultivo in vitro pudieran estar asociados a la producción de esporamina (la proteína más abundante en los tubérculos), la cual cuando el material vegetal crece in vitro se ha encontrado que es más abundante en el tallo que en las raíces, lo cual puede producir un desbalance químico en la planta e inhibir la producción normal de tubérculos y el aumento en tamaño de estos. Sin embargo, Del Sol et al. (1999) al comparar durante tres ciclos de cosecha plantas de ñame procedentes del cultivo de tejidos con plantas propagadas por el método tradicional obtuvieron durante el primer ciclo un mayor rendimiento tanto en el número de tubérculos como en el peso de los mismos, incrementándose en un 43 y 25% respectivamente cuando emplearon material vegetal procedente del cultivo in vitro, en el segundo ciclo se ratificó la superioridad de la semilla procedente del cultivo de tejidos.
El empleo de yemas de boniato encapsuladas brotadas in vitro asegura una mayor supervivencia y crecimiento del material vegetal durante la fase aclimatización.
El encapsulado de yemas de boniato constituye una alternativa valiosa para la propagación de este cultivo con fines de producción.
Aguilera, N, Guedes L y Borges M (1999) Aclimatización de clones de ñame ( Dioscorea alata (L.). V Coloquio de Biotecnología Vegetal. IBP. Cuba
Bapat, VA y Rao PS. (1987) Propagation of Morus indica by encapsulated shoot buds. Plant Cell Reports 6: 393-395
Bapat, VA y Rao PS (1988) Sandalwood plantlets from synthetic seeds. Plant Cell Report 7: 434
Del Sol, L, García M, Mederos V, Ventura J, Cabrera M y Espinosa E (1999) Influencia del cultivo in vitro sobre los rendimientos del clon de ñame blanco o pelú ( Dioscorea alata L.). Libro de resúmenes. I Taller Caribeño de Biotecnología Vegetal (BIOCAT 99). Bayamo. Cuba
Fuji, JA, Slade D y Redenbaugh K (1989) Maturation and greenhouse planting of alfalfa artificial seeds. In vitro Cell. Dev. Biol. 25. 1179.
González, G. (1996) Evaluación de clones de boniato (Ipomoea batatas (L.) Lam.) para forraje en la provincia Granma. Tesis presentada en opción al título de Master en Producción Vegetal. Universidad de Granma.
Hattori, T (1988) Expressing in transgenic tabacco of sporamin gene coding for the storage protein of sweet potato tuberous root. Israel Conference Biotechology. No. 100.
Jarret, R (1991) Cultivo de Tejidos de Camote. Publicaciones CIAT. Colombia. 20 p
Jiménez, EA y Quiala E (1998) Semilla Artificial. En: Pérez Ponce, JN (Ed) Propagación y mejora genética de plantas por biotecnología, pp. 225-240. IBP, Santa Clara.
López, J, Cabrera M, García M, Medero V, Ventura J y Rayas A (1999) Comportamiento en campo de plantas in vitro de boniato regeneradas en sistemas de inmersión temporal. Libro de Resúmenes. I Taller Caribeño de Biotecnología Vegetal (BIOCAT 99). Bayamo. Cuba.
Mederos, V (1999) Estudio en condiciones de campo de vitroplantas de yuca regeneradas por embriogénesis somática. Libro de resúmenes. I Taller Caribeño de Biotecnología Vegetal (BIOCAT 99). Bayamo. Cuba
Murayama, E, Kinoshita I; Ishii K, Shigenega H, Ohba K y Saito A (1997) Alginate encapsulated technology for the propagation of the tropical forest trees: cedrela odorata L., Guasuma critina Mart and Jacaranda mimosaefolia D. Don. Sivae Genetica 46:1.
Murashigue, T y Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture. Physiol. Plant. 15: 473-497.
Piccioni, E y A. Standardi. (1995) Encapsulation of micropropagated buds of six woody species. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 42: 221-226
Quiala, E, Jiménez E, de Feria M, Barbón R, Chávez M y Capote A (1997) Encapsulación de embriones somáticos de caña de azúcar ( Saccharum sp.) En: Libro de Resúmenes. Técnicas de Avanzadas Aplicadas a la Propagación Masiva de Plantas. BIOVEG 97. Ciego de Avila, Cuba.
Rao, PS, Ganapathi TR, Suprasanna P y Bapat VA (1993) Encapsulated shoot tip of banana: a new propagation and delivery system. INFOMUSA. 2. (2): 4 –5.
Standardi, A y E Piccioni (1997). Rooting induction in encapsulated buds of M.26 apple rootstock for synthetic seed. Biology of Root Formation and Development Plenum Press. New York pp 309-314.
Templeton – Somer K.M y Collins WW (1986) Field performance and clonal variability in sweet potatoes propagated in vitro.J. Americ. Soc. Hort. Scie. No. 111 ( 689-694).
Vilariño S, Agramonte D, Herrera L, Pérez M, Alvarado Y y Acosta M. (1996) La encapsulación de yemas axilares de papa. Estudio del medio de cultivo y de las condiciones para la brotación in vitro. Centro Agrícola 1-3: 49.
Autor:
Ángel Espinosa Reyes
Orlando González Paneque
Juan José Silva Pupo
Centro de Estudios de Biotecnología Vegetal. Universidad de Granma. Apdo 21. CP 85100. Bayamo. Granma. Cuba