Identificación de Pseudocercosporella herpotrichoides (fron) deighton, agente causal de la mancha ocular del trigo en la zona sur de Chile (página 2)

MATERIALES Y MÉTODOS

Colecta y observación macro y microscópica de plantas afectadas, y aislamiento del agente causal

Plantas de trigo de las variedades SNA 400 y Francia afectadas por la sintomatología descrita, se colectaron a fines del año 1994 en la localidad de Quilquén, a 12 km al noroeste de la ciudad de Traiguén (IX Región). El examen macro y microscópico consistió en la observación de las plantas, del tejido afectado, y en el raspado superficial de la zona afectada con el extremo de un bisturí sobre una gota de agua destilada estéril depositada sobre un portaobjeto limpio. Trozos de 2-3 cm de la zona basal de cañas afectadas se desinfectaron superficialmente en una solución de hipoclorito de sodio al 2% + etanol al 20% por 2 min, seguidos de dos lavados consecutivos en agua destilada estéril , y secados sobre papel filtro estéril bajo campana de aire de flujo laminar. Secciones del tejido afectado de 2-3 mm se sembraron en medio agar-agua (AA) + sulfato de estreptomicina (SE) (150 mg mL-1) y mantenidos por 10 días a temperatura ambiente, seguido de 20 días a 10-12ºC.

La identificación del hongo se basó en la observación y medición bajo microscopio óptico (Carl Zeiss, Mod. Standard) con contraste de fases, de las características morfológicas de las conidias desarrolladas en medio de cultivo.

Pruebas de patogenicidad

Se realizaron pruebas de patogenicidad con el hongo multiplicado en AA, en plántulas de trigo de la var. Otto-Baer de 12 días de crecimiento. Para esto, se desarrollaron primeramente cultivos monospóricos en medio AA + SE, colectando conidias con micropipeta accionada repetidamente sobre una gota de agua destilada estéril depositada sobre los conidióforos. Luego, la suspensión obtenida se distribuyó con rastrillo de vidrio estéril en un nuevo medio AA + SE. Las placas se mantuvieron a temperatura de laboratorio (15-20ºC) por 7 días. Posteriormente, se repicaron individualmente las conidias germinadas visualizadas bajo microscopio óptico, a medio AA, incubando las placas por 20 días a temperatura de laboratorio.

Se realizaron dos pruebas de patogenicidad: una de ellas consistió en la inoculación directa de trozos de agar con crecimiento del hongo, en la base de plántulas desarrolladas en mezcla 1:1 de suelo y arena esterilizada contenida en tubos de ensayo de 25 x 190 mm, incubadas en condiciones de laboratorio a 15-20ºC por 25 a 30 días. Un total de 12 plantas se inocularon de esta forma, y otras 6 se inocularon con agar sin el hongo para emplearlas como testigos. Las plantas se regaron con agua destilada estéril cada 3-4 días. La segunda prueba consistió en la colocación en forma de anillo de cilindros de cañas de trigo maduras y sanas de 1 cm de largo, en la base de plantas de trigo var. Otto-Baer (Macer, 1966, citado por Murray, 1992), los cuales se esterilizaron previamente en matraces de vidrio en autoclave, inoculados con trozos de agar con crecimiento del hongo y dejados colonizar por el microorganismo por 35-45 días bajo temperatura de laboratorio. Se inocularon un total de 5 macetas con 4 plantas cada una, desarrolladas en mezcla 1:1 de suelo y arena esterilizada contenida en macetas de plástico desechables de 150 mL de capacidad. Otras dos macetas, con 4 plantas cada una, se dejaron como testigos, inoculando con cilindros de cañas esterilizados, pero sin el hongo. Todas las macetas se incubaron en invernadero por 50 días, regándolas cada 4 días con agua destilada hasta la evaluación.

La evaluación de las plantas inoculadas se realizó a través del examen visual de lesiones en el tejido de la zona inoculada, la observación bajo microscopio óptico de las vainas foliares desprendidas de la zona de inoculación, y la tinción del hipocotilo con una solución al 10% de tinta azul Pelikan en 25% de ácido acético, para detectar la presencia de placas de infección del hongo y sitios de penetración de las hifas. Estos últimos presentan la característica de pequeños collares o anillos de material mucilaginoso extracelular, alrededor del sitio de penetración de las hifas bajo las placas de infección en las vainas foliares internas (Daniels, 1993). Inmediatamente después de la evaluación, tejido proveniente de las plantas inoculadas se desinfectó superficialmente con hipoclorito de sodio al 1,5% por 2 min, separando posteriormente las láminas, cortándolas en pequeños trozos y sembrando estos últimos en AA + SE con el propósito de reaislar el agente causal.

Prospección de sementeras de trigo

Durante las temporadas agrícolas 1994/95 a 1996/97 se revisaron sementeras de trigo ubicadas preferentemente en zonas de suelos rojo-arcillosos a transicionales de la VIII y IX regiones, que presentaban "espigas blancas" y/o tendedura de plantas. Además se examinaron en laboratorio plantas de trigo traídas por agricultores de la X Región. La identificación se basó en la detección de síntomas típicos de la enfermedad.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Observación macro y microscópica de plantas afectadas, y aislamiento del agente causal

El examen macro y microscópico de las plantas afectadas permitió observar los síntomas característicos de la mancha ocular, esto es, lesiones ovaladas en sentido longitudinal de las cañas, con bordes más oscuros y centro grisáceo, y masas estromáticas de color negro en el centro de la lesión (Figura 1). Además, micelio grisáceo en el tejido interno de las cañas, pudrición de la base y quiebre de éstas en esta misma zona, "espigas blancas" sin granos o con granos "chupados", y ausencia de pudrición de raíces. El raspado superficial de la zona afectada permitió observar la presencia de esporas hialinas, filiformes, aciculares, con 4 a 7 septos, de longitud variable entre 50 y 70 m m y diámetro entre 1,8 y 2,8 m m (Figura 2).

Figura 1. Cañas de trigo var. SNA 400 con lesiones elípticas, típicas de la mancha ocular. Figure 1. Stems of wheat cv. SNA 400 with elliptical "eye" lesions, typical of eyespot.

Figura 2. Conidias de Pseudo-cercosporella herpotrichoides obtenidas por raspado de tejido desde plantas de trigo infectadas (40X). Figure 2. Conidia of Pseudo-cercosporella herpotrichoides obtained from infected wheat plants by seraping the affected tissue (40X).  

Figura 3. Desarrollo de Pseudo-cercosporella herpotrichoides en medio AA + estreptomicina (40X). Figure 3. Growth of Pseudo-cercosporella herpotrichoides on AA +streptomycin medium (40X).

Figura 4. Plantas de trigo var. Otto-Baer inoculadas con Pseudocercosporella herpotrichoides aislado de la zona de Traiguén. Una planta testigo (izq.) y tres plantas inoculadas mostrando las zonas afectadas (flechas). Figure 4. Wheat plants cv. Otto Baer inoculated with Pseudocercosporella herpotrichoides isolated from the Traiguén farmland area. One check plant (left) and three inoculated ones showing the affected zones (arrows).  

Figura 5. Placas de infección observ adas en las vainas foliares inernas de las plantas de trigo inoculadas (25X). Figure 5. Infection pllaques observed in the internal leaf sheaths of inoculated wheat plants (25 X).

Figura 6. Sitios de penetración de hifas de Peseudocercosporella herpotrichoides observadas en las vainas foliares internas de plantas de trigo inoculads, con la formación de anillos o collares de mucílago extracelular(flecha) (40X). Figure 6. Penetration sites of Peseudocercosporella herpotrichoides hypae observed in the internal leaf sheaths of inoculated wheat plants, with the formation of extrecellular mucilage collars (arrow) (40X).

En la siembra en medio AA + SE, al cabo de 20 días se observaron colonias de desarrollo lento con 0,7 cm de diámetro en promedio, de color gris verdoso muy claro, de bordes enteros, y que produjeron conidias hialinas, filiformes, rectas a curvadas, con 3-6 septas, mayoritariamente con 4-5 y ocasionalmente con 7 septas, aciculares, y una longitud promedio determinada en 87 conidias elegidas al azar, de 63,5 µm (40,9-81,9 µm) (Cuadro 1), y un diámetro de 1,9 a 2,8 m m. Las conidias se originaron agrupadas desde conidióforos libres, cortos, con ninguna o escasa ramificación (Figura 3). La longitud de las conidias resultó similar a lo señalado por Nicholson et al. (1991), para aislamientos de P. herpotrichoides var. herpotrichoides de Inglaterra (Cuadro 1).

Cuadro 1. Longitud de conidias (µm) de Pseudocercosporella herpotrichoides obtenidas desde aislamientos de la zona de Traiguén, IX Región, Chile, comparadas con aislamientos de Inglaterra y Alemania. Table 1. Length of conidia (µm) of Pseudocercosporella herpotrichoides obtained from isolates from Traiguén locality, 9th Region, Chile, compared to isolates from England and Germany.

a Nicholson et al. (1991). b Nirenberg, 1981 (citado por Daniels, 1993).

Pruebas de patogenicidad

En la prueba de patogenicidad efectuada en tubos de ensayo, a los 30 días se observó en 10 de las 12 plantas la presencia de hojas amarillentas en los tubos inoculados y un menor desarrollo de éstas. En la base de las mismas se observó una coloración café pálida a oscura, longitudinal, de 0,5 a 1,5 cm, en algunos casos circundando el tallo (Figura 4). El examen de la zona afectada bajo el microscopio óptico, permitió observar masas estromáticas o placas de infección (Figura 5) con hifas corredizas desarrollándose sobre el tejido del hipocotilo y entre las láminas foliares internas, además de sitios de penetración de hifas que conforman una especie de anillo o collar (Figura 6). Todas estas estructuras corresponden a las descritas por Daniels (1993). Las plantas testigo presentaron un mayor desarrollo que las inoculadas con el patógeno, con hojas verdes y ausencia de síntomas de la enfermedad en la base de las cañas. De la siembra del tejido afectado proveniente de las plantas inoculadas con el hongo patógeno, a los 25-30 días se obtuvo el desarrollo de colonias características de P. herpotrichoides.

En la prueba de patogenicidad efectuada en macetas plásticas con la inoculación de anillos de cañas de trigo colonizadas con el hongo patógeno, a los 20-25 días se observó una notoria amarillez de todas las plantas inoculadas y menor desarrollo de éstas. La zona de inoculación presentó una evidente coloración café a café oscuro, circundando completamente el tallo en la mayoría de los casos, o con el desarrollo de lesiones elípticas longitudinales características de mancha ocular en 4 de 20 plantas. Al observar la zona basal de las láminas foliares bajo el microscopio óptico, se detectó la presencia de placas de infección típicas del agente infeccioso, y los sitios de penetración de las hifas con la formación de collares o anillos de exudados mucilaginosos alrededor de estos sitios. Las plantas testigo presentaron un mayor desarrollo, con láminas foliares verdes y ausencia de síntomas en la base de las cañas.

Prospección de sementeras de trigo

Tanto la prospección de sementeras de trigo como la evaluación de plantas en laboratorio, determinaron la presencia de la enfermedad en las localidades de Mulchén y Santa Bárbara en la VIII Región; Traiguén, Quilquén, Quino, Galvarino, Lautaro y Perquenco en la IX Región; y en los sectores de Cudico y el camino San Pablo a Trumao, en la X Región.

CONCLUSIONES

La sintomatología observada en las plantas afectadas provenientes de la zona de Traiguén, los resultados obtenidos en las observaciones macro y microscópicas del tejido afectado, las características morfológicas del hongo aislado, la forma y tamaño de las conidias, los resultados de las pruebas de patogenicidad, la formación y características de las placas de infección y sitios de infección observadas en las láminas foliares internas del hipocotilo de las plantas inoculadas, permiten identificar la sintomatología descrita como la enfermedad conocida como "mancha ocular del trigo", y al organismo aislado como Pseudocercosporella herpotrichoides (Fron) Deighton, hongo Deuteromycete causante de esta patología. Además, de acuerdo a las características de las conidias obtenidas de los aislamientos de la zona de Traiguén, los resultados sugieren que se trataría de P. herpotrichoides var. herpotrichoides.

La enfermedad se encontró afectando con particular intensidad a sementeras de trigo ubicadas en suelos rojos-arcillosos y transicionales de la zona comprendida entre Quilquén y Galvarino, en la IX Región. También fue detectada en localidades de la VIII y X regiones.

Esta corresponde a la primera detección de la presencia de la mancha ocular y su agente causal afectando sementeras de trigo en Chile.

LITERATURA CITADA

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Nicholson, P., T.W. Hollins, H.N. Rezanoor, and K. Anamthawat-Jonsson. 1991. A comparison of cultural, morphological and DNA markers for the classification of Pseudocercosporella herpotrichoides. Plant Pathol. 40:584-594.

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Orlando Andrade V. 2 2 Instituto de Investigaciones Agropecuarias, Centro Regional de Investigación Carillanca, Casilla 58-D, Temuco, Chile.