Síntesis de biomasa o proteína de origen unicelular de Saccharomyces exiguus en ácido acético

1. Resumen
2. Introducción y Antecedentes
3. Materiales y Métodos
4. Resultados y Discusión
5. Literatura citada

Resumen

La producción de alimentos con proteína de calidad nutricional se limita por diversas razones: una de ellas, el deterioro del suelo, el costo de los fertilizantes químicos y el agua. Por ello, otras alternativas se proponen como la obtención de proteína microbiana. Conocida como "single cell protein" (SCP) del tipo de la levadura Saccharomyces exiguus. El objetivo de este trabajo fue establecer las mejores condiciones para la producción de S. exiguus. Para ello la levadura se cultivo en ácido acético (AA), sales minerales y extracto de malta, su crecimiento se escalonó en un reactor de 14L. Los resultados indican que el AA es una excelente fuente de carbono para la producción de biomasa microbiana de S. exiguus como fuente de proteína si se usa extracto de malta como factor de crecimiento.

Palabras clave: Proteína, levadura, dieta, alimento.

Introducción y Antecedentes

En la actualidad el aumento acelerado de la población no es proporcional a la cantidad y calidad de la proteína disponible de origen vegetal y animal, por ello se buscan otras fuentes de proteína para la alimentación humana e incluso animal. Este problema se intenta resolver de diversas formas mediante el mantenimiento de la producción agrícola como la fertilización biológica, capacitación de personal en centros de adiestramiento para un mejor aprovechamiento, de los recursos naturales, marinos y terrestres. Sin embargo, esto no es suficiente.

Así se investigan otras alternativas de proteína como la unicelular SCP o "biomasa" (2,3) este término "proteína de origen unicelular" nació en el Instituto Tecnológico de Massachussets EUA, por el profesor Wilson en 1966, (5). Aceptado para denominar de esa forma a células de bacterias, hongos y algas usadas como una fuente de proteína como se indica en el Cuadro 1, que muestra el análisis químico de las SCP derivadas de diferentes microorganismos en donde es evidente que el contenido de nitrógeno y los ácidos nucleicos tienen un valor considerable. (10,11). Esta opción tiene ven tajas sobre otras proteínas (3,12) ya que se obtiene de sustratos relativamente baratos, con alto rendimiento y de calidad nutricional. Además está sujeta a control lo que hace posible que su fabricación sea maximizada (2, 4, 13).

Algunas ventajas de la proteína de microorganismos cultivada en biorectores o sistemas similares, sobre la similar de plantas y animales se indica como sigue (1, 14, 15):

1) Los microorganismos tienen tiempos de generación cortos e incrementan rápidamente su masa; las bacterias y levaduras bajo condiciones de laboratorio alcanzan tiempos de generación entre un 0.5-2h o de 1-3h (19).

2) Los microorganismos poseen una concentración de proteína elevada entre un 10-50% (3).

3) La SCP es de alta digestibilidad no es tóxica y de buen sabor (8,10).

4) La producción de SCP se basa en sustratos relativamente baratos y abundantes como la celulosa, el AA o el petróleo, etc. (2,6).

5) La producción de SCP se logra con relativa facilidad en un cultivo controlado independientemente de factores ambientales (5, 7, 11).

CUADRO I.

PORCENTAJE PROMEDIO DE LA COMPOSICIÓN QUÍMICA PROXIMAL DE LA PROTEÍNA UNICELULAR EN BASE A SU PESO SECO.

(Anupama y Ravindra, 2000; Rhishipal y Philip, 1998; Ghose, 1969; Bressani, 1968.)

Existen datos sobre la utilización del nylon para la producción de SCP, que prueban que la celulosa es una opción como fuente de carbono para la síntesis de proteína microbiana. Enebo (10) en un cultivo mixto con Celullomonas y Alcaligenes a nivel de planta piloto, comprobó la disponibilidad de este sustrato para la producción de SCP. Con respecto al AA como sustrato para la manufactura de biomasa, se evaluaron 103 hongos; los resultados indican que efectivamente esta es una opción como fuente de carbono para la producción de SCP bajo las siguientes condiciones de trabajo: AA (1 Y 2% v/v), pH 5.9 Y 6.3, amonio 0.07 y 0.28%.

El análisis químico proximal de los hongos señaló 38 y 50% de proteína cruda respectivamente, y de un 7 y 8% de ácidos nucleicos con un bajo en el contenido en metionina (15), Moo-Young (16) al evaluar este proceso en países desarrollados se determinó el costo de la producción de SCP, a partir de AA, en comparación con otros sustratos como se presenta en el Cuadro 11 en el que se señala su factibilidad económica. Al determinar la síntesis de SCP, Sal daña (19) en su investigación con S. exiguus, obtuvo 6 g/L de peso seco con AA a una concentración de 0.75 %, amonio 5 g/L Y 30 ppm de extracto de levadura como factor de crecimiento con agitación mecánica de 250 rpm y temperatura de 25-30°C.

CUADRO II.

DIFERENCIAS ENTRE EL COSTO DE LA PRODUCCIÓN DE LA PROTEÍNA UNICELULAR A PARTIR DE ACETATO EN RELACIÓN A OTRAS FUENTES DE CARBONO.

(Amrane y Prigent, 1998 -2000; Moo-Young. 1977).

Esta investigación señala que S. exiguus, posee excelentes características fisiológicas para desarrollarse en AA, la que incluye su tolerancia al pH ácido, y que además responde rápidamente a la adición de tiamina, niacina, botina y ácido pantotenico de las melazas lo cual incrementó al rendimiento de su SCP (2,9,12), así como el tiempo de duplicación, la velocidad de crecimiento (1,2). Los objetivos de éste trabajo fueron: i) obtener biomasa a partir de AA por Saccharomyces exiguus en medio de cultivo con extracto de malta como factor de crecimiento y ii) optimizar su producción en un fermentador automatizado.

Materiales y Métodos

I ORIGEN DE LA LEVADURA

La cepa de Saccharomyces exiguus se aisló de aguamiel (Agave sp) y se identificó por Saldaña (22); pertenece a la colección del laboratorio de microbiología industrial y del suelo del área de microbiología de la Facultad de Ciencias Biológicas UANL, de donde se obtuvo para la realización de este trabajo.

II CONSERVACIÓN

La levadura fue mantenida por resiembra periódica mensualmente en agar Sabouraud glucosa al (p/v) 2%, (Merck) pH 5, a temperatura de refrigeración y agar acetato diferencial (Difco), pH6 y 7.

III MEDIO DE CULTIVO

Se probaron dos medios base denominados M-I y M-II

a) El medio M-I contenía: (g/L) NH42S04 (Reactivos Monterrey) 4.0; KH2PO 4 (Merck) 0.8; MgSO J H20 (Merck) 0.25; agua de la llave 1000mL; extracto de malta (Merck) 30 ppm. AA (Reactivos Monterrey) en concentración de 1, 2, 3, 4, Y 5 %; v/v pH final 4.5 ajustado con NaOH concentrado con potenciómetro.

b) El medio M-II contenía: (g/L) NH4Cl (Reactivos Monterrey) 5.0; KH2PO4 (Merck) 5.0, MgSO4.7 HP (Merck) 2.5; CaCl2. HP (Baker) 0.8; agua de la llave 1000mL; extracto de malta (Merck) 30 ppm. AA (Reactivos Monterrey) en concentración de 1, 2, 3, 4, y 5 (%); pH de 4.5 ajustado con NaOH.

IV CONDICIONES DE FERMENTACIÓN

a) Se realizaron experimentos en matraces Erlenmeyer de 500ml con 100ml del medio de cultivo en un agitador mecánico 250 rpm (Eberbach), a temperatura ambiente con un tiempo de fermentación de 96-120h, se seleccionó la mejor concentración de AA para la producción de levadura en base a su rendimiento y se escalonó a nivel de microfermentador M F-114 (New Brunswick Scientific Co. Inc.) con capacidad de 14L agitación de 300-500 rpm temperatura 30°C, aeración de 1 VVM, con dos antiespumantes; antifoam (Sigma) y el Dow corning FG-10 (Siliconas), se usó 1 mi del antiespumante concentrado al iniciar la fermentación y luego se diluyó al 10 % en agua destilada como acarreador durante la fermentación.

b) Preparación del inóculo. Para los experimentos en matraces Erlenmeyer se preparó una suspensión de S. exiguus en solución salina 0.85% estéril a partir de un cultivo de 48h, crecida en agar Sabouraud glucosa 2%, se tomaron 5ml para cada matraz hasta alcanzar una absorbancia de 0.60 a una longitud de onda de 650m en un espectrofotómetro Coleman júnior 11 en celdas de 5mm de diámetro y 2.5ml de capacidad. Para los experimentos en el microfermentador se emplearon dos matraces de 1000ml; con un volumen de medio de cultivo de 350ml la levadura se activó de la manera mencionada hasta alcanzar 0.60 de absorbancia con estos 700ml se inocularon los 7.7L del medio de cultivo para el microfermentador.

V CINÉTICA DE FERMENTACIÓN

Los principales parámetros considerados para establecer la cinética de fermentación de S. exiguus en AA y sales minerales además del extracto de malta fueron: densidad óptica, peso seco (g/L) y pH.

a) Densidad óptica.

Se tomaron muestras cada 0, 24, 48, 72, y 96h para los matraces y 2, 3, o 4h, para los experimentos en el microfermentador se colectaron 4ml del medio de cultivo para las lecturas a una longitud de onda de 650nm. En un espectrofotómetro Coleman júnior 11.

b) Determinación del peso seco.

Para el peso seco se usaron membranas milipore de 25m m de diámetro (Gelman) de 0.2 micras de diámetro se llevaron a peso constante en un horno a 11 OOC/18h, después se depositaron en un portafiltros con una jeringa hipodérmica adaptada y se filtró 1 mi del medio de cultivo, se lavaron las células con 2ml de solución salina al 0.85 % Y se secaron a 40°C. Las membranas se llevaron a peso constante en el horno a 11 OOC/18h. El pH se determinó con un potenciómetro Corning Scientific Instruments Mod.5.

c) Coeficiente de rendimiento del sustrato.

Se calculó en base a la ecuación y = X/S donde x representa los gramos de peso seco de la levadura IL de medio de cultivo y s los gramos de AA/L para obtener los gramos de peso seco de la levadura I gramo de AA.

d) Análisis estadístico.

Se desarrolló un análisis estadístico de regresión simple exponencial con una calculadora T1 Programable 58 Texas Instruments, (19), para obtener la cantidad de células secas por unidad de volumen a un tiempo determinado con la siguiente ecuación:

x = xo eµح

x = gramos de células por litro (g/L) a un tiempo determinado.

xo = gramos de células por litro (g/L) iniciales.

e = representa una constante.

µ = velocidad de crecimiento.

T = tiempo.

Resultados y Discusión

En el Cuadro III se muestran los experimentos realizados a nivel de microfermentador, en donde fue evidente que el 1 % (v/v) de AA fue adecuado para la producción de biomasa, pues el ácido se consumió totalmente al controlar estrictamente las condiciones de producción celular con un volumen de 7.700, con extracto de malta a 30 ppm el cual fue fundamental como fuente de vitaminas para la síntesis de enzimas que necesita la levadura en su fase logaritima y que influye directamente en su rendimiento a una temperatura de 30°C; una agitación de 400 rpm; y una aeración de un volumen de aire/L de medio de cultivo, a un pH de 4.5 antiespumante FG-10 al 10% que redujo considerablemente la formación de espuma En esta condición se encontró un y= X/S 0.49 y un rendimiento celular de 5.1 g de peso seco/L lo que significa un eficiente uso del AA para su conversión en biomasa (20,21) a un costo relativamente bajo.

El principal problema para la producción de SCP de AA fue el pH, la levadura mostró tendencia a elevarlo a un valor tan alto que causó un evidente olor a amonio, lo que facilitó su contaminación por bacterias. La espuma no controlada también ocasionó pérdidas, así que se recomienda evitar la con un buen antiespumante. Estos resultados sugieren un estudio bioquímico de los productos de fermentación y de la fisiología de la levadura cuando crece en AA para reducir el problema de la alcalización del pH (2,3,).

Por lo anterior, se concluye que a ninguna concentración de AA, a nivel de matraz se inhibió el crecimiento de S. exiguus. El extracto de malta fue esencial para la producción de biomasa pues al suprimirse, el rendimiento disminuyó notablemente, lo que indica que es incapaz de sintetizar vitaminas del complejo B. Durante la cinética de fermentación el pH se elevó lo que provoca la contaminación del medio del cultivo, por ello se recomienda observar máximas medidas de asepsia al trabajar con esta levadura y fuente de carbono.

CUADRO III.

CRECIMIENTO DE Saccharomyces exiguus EN MEDIO MINERAL CON ÁCIDO ACÉTICO-EXTRACTO DE MALTA EN FERMENTADOS DE 14 LITROS DE CAPACIDAD CON UN VOLUMEN DE TRABAJO DE 7.700 LITROS.

*ácido acético adición inicial.

Agradecimientos

Al proyecto 2.7 (2005-2006 de la CIC- UMSNH por el apoyo para su publicación. Al similar "Biomasa" de la FCB – UANL, Monterrey, N.L, México, por el financiamiento para su realización.

Literatura citada

1. Amrane, A, ando Prigent, Y. 1998. Effect of culture conditions of Kluyveromyces marxianous on its autolysins and process optimization. Bioprocess Engineering. 18:383-388.

2. Amrane, A, and Prigent, Y. 2001. Studies on production of single cell protein by Aspergillus's Niger in solid state fermentation of rice bran. Brazilian Archives of Biology and Technology. 44:79-78.

3. Anupama, A. and Ravindra, P. 2000. Value-added food: Single cell protein. Biotechnology Advances 18:459-479.

4. Benjamin, S. and Pandey, A. 1998. Candid a rugosa lipases: Molecular biology and versatil. ity in biotechnology. Yeast. 14:1069-1087.

5. Bressani, K. 1968. Single cell protein. Ed. Mateles, R.I. Tannenbaum S.R. Mass. Inst. Tech. Cambridge, Mass USA pp: 21-90.

6. Casas-Campillo, C., Medrano, H. y Larrea, J. 1971. Obtención de proteína de origen unicelular con hidrocarburos del petróleo. Revista del Instituto Mexicano del Petróleo 4:58-71.

7. Chiou, P.W.S., Chiu, S,W. 2001. Value of Aspergillus's niger fermentation product as a dietary ingredient for broiler chickens. Animal Feed Science and Technology 91:171-182.

8. Choi, M.H. and Park Y. H. 1999. Growth of Pichia guilliermondii A9, an osmotolerant yeast in waste brine generated from Kim chi production. Bioresource Technology 70:231-236.

9. El-Sayesd, A.F.M. 1999. Alternative dietary protein sources for farmed tilapia Oreochromis spp. Aquaculture 179: 149-168.

10. Enebo, L. 1970. Single cell protein in evaluation protein products ed. Program Press- Oxford, New York, N. Y. USA.

11. Heden, C.G. Enebo, L. 1969. The Potential of microbiol food resources. International Botany Congress, II th Seattle, USA. (abstract).

12. Kihlberg, R. 1972. The Microbe as source of protein. Annual Review Microbiology 20:427-466.

13. Kim, JK and Lee, B. K., 2000. Mass production of Rhodopseudomonas palustris as diet for aquaculture. Aquacultural engineering 23:281293.

14. Litchfield. J. H. 1977. Comparative technical and economics aspects of single cell protein process. Advances in Applied Microbiology. 22: 267-305.

15. Matssura, S., Takahashi, Hand Manabe, M. 1973. Biomasa production of Koji molds from acetate as a sole carbon source. Journal of Fermentation Technology 51: 783-789.

16. Moo-Young, M. 1977. Economics of SCP production. Process biochemistry. 12: 6-10,

17. Nigam, J.N., 2000. Cultivation of Candidalangeronii in sugar cane bagasse hemicellulosic hydroIyzed for the production of singJe cell protein World.Journal of Microbial Advances Biotechnology. 16:367-372.

18. Oliva-Teles, A and Goncalves, P. 2001. Partial replacement of fish meal by brewer yeast (Aaccaromyces cerevisae) in diets for sea bass (Dicentrarchus labrax) juveniles. Aquaculture 202:269"278.

19. Ostle, B. 1973. Estadística Aplicada. The lowa State University Press. 8: 222-223.

20. Pandey, A, Soccol, C.R. 2000. Biotechnological potential of agro-industrial residues. Sugarcane bagasse. Bioresource Technology 74:6980,

21. Rhishipal, R. and Philip, R. 1998. Selection of marine yeasts for the generation of single cell protein from prawn-shell waste. Bioresource Technology 65:255-256.

22. Saldaña-Acosta, J.M. 1979. Obtención de Biomasa a partir de ácido acético por Saccharomyces exíguus. Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Autónoma Nuevo León, Monterrey N.L. México. (Tesis inédita).

23. Texas Instruments 1977 Personal Programming. 5: V-39. T1 Programmable 58/59

Sánchez-Yáñez, J. M.1*

Galán-Wong, L. J.2*

1Microbiología ambiental,

*autor correspondiente

Instituto de Investigaciones Químico Biológicas, Ed B-1, Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo., CP. 58030 Morelia, Michoacán.

2Microbiología Industrial y del suelo. Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Autónoma Nuevo León, AP. 414, CP. 64000. San Nicolás de los Garzas, N.L. México.