Efecto de un surfactante sobre la integridad de espermatozoides ovinos crioconservados

• Material y métodos
• Resultados
• Discusión
• Resumen
• Agradecimientos
• Bibliografía
• Notas

SUMMARY: Effect of a surfactant on the integrity of frozen ram spermatozoa. In order to test the effect of the addition of the commercial surfactant Equex STM to TRIS and Na-Citrate extenders on the survival of ram semen, four trials using factorial designs were conducted freezing separate ejaculates collected from 2 Austral and l Border Leicester rams. Common for all trials was a monophasic dilution at room temperature, with 20% egg-yolk containing extenders split in fractions with 0.5% and without surfactant, packing of extended semen in 0.25 Minitüb-straws, an adaptation period at 5°C for 3-4 h, a freezing rate of about 5°C/min performed 10 cm above level of liquid nitrogen, and thawing of straws for 15 seconds in a 40°C water bath. Quality criteria for thawed semen were motility index (MI) and normal intact acrosomes (NA). With the use of STATGRAF 5.1, results were submitted to ANOVA and Duncan test, complemented with "t"-test (TWOSAM), assuming P < 0.05.

In the 1st trial, the comparison of TRIS-extender (T) vs. 2.9% Na-Citrate extender (C), MI was significantly lower in C-extenders, specially in C-extender without surfactant, which caused high rates of bent tails indicating osmotic damage. This was not observed in C with surfactant nor in T- fractions. The effect of surfactant on NA was significant with both extenders. In the 2nd trial, Citrate extender was comparatively modified, adding 0.3% (w/v) Sulphanilamide to increase osmolarity and pH. The results were basically the same as in the 1st trial: addition of surfactant gave significantly higher NA-rates in TRIS and Citrate extenders and significantly higher MI in both Citrate-extenders. In the 3rd trial, designed to compare two concentrations of Na-Citrate (2.9% vs. 3.1% w/v), and to compare a fast vs. a slow dilution, no differences between extenders nor between fast and slow dilution were found. Again, the effect of the surfactant on NA and MI was significant. In the 4th trial, conducted mainly to compare fast and slow dilution with TRIS extender, no difference was found. Again there was a significant effect of the surfactant on NA. There was no interaction between tested variables. It was concluded that Na-Citrate extenders without surfactant are deleterious to ram spermatozoa, as was evident by bent tails immediately after dilution. The addition of surfactant to TRIS extender yielded about 60% more intact spermatozoa after freezing. This would make it possible to reduce spermatozoa concentration per frozen straw in order to obtain a better sperm survival.

Palabras claves: semen, ovino, congelación, crioprotección, surfactante.

Key words: semen freezing, ram, cryopreservation, surfactant.

INTRODUCCIÓN

En la especie ovina, la baja fertilidad del semen crioconservado es atribuida a cambios ultraestructurales, bioquímicos y funcionales que sufre una proporción significativa de las células espermáticas y que conducen a un transporte insuficiente y pérdida de viabilidad de los espermatozoides en el tracto genital (Salamon y Maxwell, 1995a, 1995b). Los cambios ultraestructurales afectan principalmente a las membranas, debido a reordenación de los lípidos membranosos durante la congelación-descongelación, alterando las asociaciones lípido-lípido y lípido-proteínas, necesarias para una función normal de las membranas (Parks y Graham, 1992). Se ha constatado que el daño por la congelación es más severo en espermatozoides ovinos que en espermatozoides bovinos, particularmente sobre la integridad de su borde apical, área que es más sensible que el segmento postacrosomal y de la pieza intermedia. Por ello, la motilidad espermática de los espermatozoides ovinos crioconservados es habitualmente mayor que la integridad morfológica de sus acrosomas (Salamon y Maxwell, 1995b).

Graham y col. (1971) utilizaron sustancias tenso activas en ensayos de criopreservación de semen porcino. Entre 78 compuestos ensayados, la adición al diluyente de un detergente comercial (Orvus Es Paste OEP1) demostró tener un efecto favorable sobre la integridad de los acrosomas en presencia de yema de huevo. El compuesto comercial utilizado fue descrito como un tensido constituido por una mezcla de Na- y trietanolamino-laurilsulfato (STLS). De acuerdo con esa definición, contiene tanto una sal sódica anionactiva (dodecilo hidrógeno-sulfato, sal sódica), como también una sal de etanolamonio (no ionogénica) del laurilsulfato (Habermehl, 1987).

El efecto favorable del tensido nombrado sobre la integridad de las membranas de espermatozoides porcinos fue corroborado por Graham y Crabo (1972) y Pursel y col. (1978), quienes observaron que su efecto sobre la motilidad espermática e integridad de acrosomas se relacionaba con la concentración de yema de huevo en el diluyente de congelación. El mismo surfactante se ha ensayado también en semen de otras especies, como conejo (Hellemann, 1976; Weitze, 1977), equino (Martin y col, 1978), caprino (Velasco, 1985; Strohmeyer, 1988; Hellemann y col., 1992), bovino (Arriola y Foote, 1987; Foote y Arriola, 1987) y ovino (Tekin, 1982; Sánchez y Hellemann, 1993).

El objetivo del presente trabajo fue determinar en semen ovino el efecto crioprotector del detergente Equex STM®, agregado comparativamente a diluyentes tris y citrato de Na.

MATERIAL Y MÉTODOS

Se colectó semen de dos carneros de raza Austral de 2 años y un carnero Border Leicester de 8 años de edad. Los eyaculados obtenidos mediante vagina artificial se sometieron a una estimación de porcentaje de motilidad por microscopía de contraste de fases (x200) sobre platina temperada (38° a 40°C), descartando del ulterior procesamiento el semen con menos de 70% de células con movimiento progresivo. La concentración espermática se midió con contador de partículas.

Se realizaron cuatro ensayos. Fue común para ellos el procesamiento individual de los eyaculados, la determinación de la concentración espermática por dosis a un total de 150 millones de células espermáticas totales. Todos los diluyentes utilizados tuvieron un contenido final de 20% de yema de huevo. La concentración de glicerina fue de 6.4% (v/v) en los diluyentes tris (Steinbach y Foote, 1966) y de 7% (v/v) en los de citrato de Na (Salisbury y VanDemark, 1961). La dilución de todas las fracciones se realizó en forma monofásica, con los diluyentes glicerinados a temperatura de laboratorio (18° a 22°C). Las fracciones diluidas se envasaron en pajuelas Minitüb® de 0.25 ml, las cuales se colocaron dentro de tubos de aluminio, sometiéndolas a un período de adaptación a +5°C por 3 a 4 h antes de su congelación. La congelación misma se realizó a 10 cm sobre el nivel de nitrógeno líquido (N2L), por 15 min., en una caja de poliestireno expandido, logrando una curva de congelación de aproximadamente 5°C/min, tras lo cual el semen se sumergió en N2L y almacenó por al menos una semana.

Se evaluó el efecto de los diferentes tratamientos en el semen descongelado mediante microscopía de contraste de fases (x200), por la estimación del porcentaje de motilidad progresiva (MOT) y de la intensidad del movimiento (I) en una escala ascendente de 1 a 5. Ambos parámetros se transformaron a un índice de motilidad (IM), de acuerdo a la fórmula: IM = MOT (I x 20) / 100. Como segundo criterio de evaluación se utilizó el porcentaje de células espermáticas que mantuvieron la integridad del borde apical de sus acrosomas (AN), observadas con microscopio de contraste de fases (x 1000) en semen fijado con una solución de citrato de Na al 2.9% adicionada con 2% de formalina comercial al 40%.