Utilización de lectina Pisum sativum y yoduro de propidio para la evaluación rápida de integridad de acrosoma en espermatozoides caprinos

1. Introduccion
3. Resultados
4. Discusion
5. Bibliografia

RESUMEN: La lectina Pisum sativum (PSA) ha sido usada exitosamente como marcador de glicoconjugados localizados en la membrana acrosomal interna, pero debido a las variaciones en los constituyentes de membranas existentes entre especies, su utilización requiere una validación preliminar. Este estudio compara los resultados obtenidos en la tinción acrosomal con una combinación de yoduro de propidio (PI) y PSA con la tinción Rosa de Bengala que se utiliza corrientemente como estándar, y además compara la interpretación de los resultados obtenidos con la tinción PI/PSA por dos evaluadores independientes.

En el experimento 1, semen de chivos fue colectado por vagina artificial, lavado del plasma seminal y teñido comparativamente con PI/PSA y con Rosa de Bengala, inicialmente en forma directa después de la colección y posteriormente luego de preparar fracciones con diferente proporción de espermatozoides vivos y muertos. En el experimento 2, semen de diferentes chivos congelado a -196° C en el diluyente a base de Tris, citrato y yema de huevo, fue descongelado a 37° C por 30 seg ó a 65° C por 5 seg y los espermatozoides fueron teñidos con PI/PSA. La interpretación de los resultados de integridad de acrosoma fue realizada por dos evaluadores independientes. Para comparar los resultados los porcentajes fueron transformados y las medias y correlaciones fueron calculadas por medio del paquete estadístico Systat®.

Los resultados muestran que la tinción PI/PSA y Rosa de Bengala da resultados similares y positivamente correlacionados (r = 0.99) y que la interpretación de los evaluadores también fue positivamente correlacionada (r = 0.98). De acuerdo a lo anterior, se concluye que la tinción PI/PSA es útil para la evaluación rápida de integridad de acrosoma en caprinos.

SUMMARY: Use of propidium ioide and Pisum sativum for fast assessment of acrosome integrity in goat spermatozoa

Lectins are used for studies in mammalian sperm surface and organelles because of their ability to specifically link sugar residua. Fluorescein labeled Pisum sativum (PSA) has been used successfully in several mammalian spermatozoa, as a marker of the inner acrosomal membrane but, because of interspecific variations in membrane constituents, its use requires a preliminary validation. This study compared the results obtained by staining goat spermatozoa with a combination of propidium ioide (PI) and PSA vs those of Bengal Red. Also the interpretation of the results achieved were compared with the results obtained by two external technicians.

In Experiment 1, goat spermatozoa collected by artificial vagina were washed once, immediately after collection, and stained with PI/PSA and Bengal Rose. Then, to prepare sperm groups with different proportions of live and dead sperm, spermatozoa were fractionated and one fraction was damaged by freezing at -196° C without cryoprotectans. In Experiment 2, semen from different males was frozen in a Tris-base d extender, and thawed either at 37° C for 30 sec or at 65° C for 5 sec, and then stained with PI/PSA. Two independent technicians assessed the results of both series of experiments. Percentage transformations, media comparison and correlation were obtained by using the Systat® computing package.

The results showed that PI/PSA and Bengal Rose gave similar and positively correlated results and that both technicians gave similar interpretations (r = 0.98). It can be concluded that PI/PSA is a useful staining for fast assessment of goat spermatozoa.

Palabras claves: espermatozoides, lectinas, acrosoma, caprinos.

Key words: spermatozoa, lectins, acrosome, goats.

Introducción

El acrosoma es un organelo espermático que cumple una función esencial en el proceso de fecundación. Está revestido externamente por el plasmalema y la membrana acrosomal externa e internamente por la membrana acrosomal interna (Bedford, 1990). La importancia funcional del acrosoma se debe a su rol en la fijación y penetración espermática de la zona pelúcida y en la fusión entre gametos (Yanagimachi, 1988). Aun cuando la membrana acrosomal interna es bastante resistente, la doble membrana que constituye la pared acrosomal puede alterarse fácilmente por efectos fisiológicos (ej. reacción de acrosoma) o no fisiológicos (ej. degeneración, daño físicoquímico).

La evaluación de la integridad de acrosoma ha sido relevante, tanto desde un punto de vista clínico y tecnológico como desde la investigación de la biología espermática (Bavister, 1990;Cross y Meizel, 1989), por lo que en especies con un acrosoma relativamente poco notorio, como en rumiantes domésticos, se han desarrollado diversas técnicas para facilitar su identificación.

Teniendo presente las variaciones entre especies, los procedimientos tintoriales estándares han mostrado ser bastante útiles, pero a su vez son laboriosos, demandantes de tiempo y a veces sus resultados son algo ambiguos (Cross y Meizel, 1989).

Recientemente se ha incorporado la utilización de lectinas asociadas a fluoresceínas como marcadores de acrosoma y de modificaciones plasmáticas en espermios eyaculados (Cummins, 1995; Medeiros y Parrish, 1996). Las lectinas son glicoproteínas que se unen específicamente a terminales azúcares ubicados en las estructuras celulares y, por lo mismo, se han utilizado como marcadores específicos de glicoconjugados localizados, tanto en el acrosoma intacto como en la matriz acrosomal (Cross y col., 1986; Nolan y col., 1992; Way y col., 1995). La lectina Pisum sativum (PSA) permite reconocer terminales manosa, glucosa y glucosamina (Goldstein y Portez, 1986) de glicoconjugados localizados en la matriz acrosomal, por lo que asociada a una fluoresceína puede identificar espermatozoides con el acrosoma dañado o ausente (Nolan y col., 1992; Aitken y Brindle, 1993). El yoduro de propidio (PI) es una tinción nuclear y por lo mismo sirve como tinción espermática de contraste. En combinación, permiten una evaluación rápida, simple y sin ambigüedad de la presencia o ausencia del saco acrosomal.

En general, las pruebas espermáticas ideales deberían ser sencillas, rápidas de interpretar, confiables, repetibles y debieran aportar información relevante (Bavister, 1990). La gran utilidad del uso de lectinas en la evaluación funcional de espermatozoides es que cumplen la mayor parte de estos requisitos (Kawakami y col., 1993), por lo que se han utilizado crecientemente en estudios de la biología espermática.

Como marcador de la función acrosomal, la lectina PSA se ha utilizado exitosamente en toros (Nolan y col., 1992;Way y col., 1995), potros (Farlin y col., 1992; Casey y col., 1993) y perros (Kawakami y col., 1993; González-Chábarri y col., 1994), mientras que en muchas clínicas humanas se ha empezado a utilizar en conjunto con la lectina Arachis hipogea (PNA) como técnica de elección para la evaluación acrosomal (Kinger y Rajalakshmi, 1995). El presente trabajo tiene por función describir la utilización de la combinación de PI y PSA ajustada para la evaluación de integridad de acrosoma en caprinos.