Presencia e incidencia de virus de la vid en la zona central de Chile (página 2)

MATERIALES Y MÉTODOS

El trabajo se realizó en 33 predios con vides en producción, y en 6 viveros con plantas madres y material de propagación, ubicados en la V, VI y Región Metropolitana, entre los meses de septiembre y enero de las temporadas 1996 a 2000. En cada predio se colectaron muestras al azar, según el siguiente esquema: en cada décima hilera de plantas se colectaron sucesivamente muestras de cada décima planta. La muestra estuvo constituida por material verde (hojas y brotes) de una sola planta, la cual se identificó adecuadamente, se colocó en bolsa plástica y se almacenó en una caja de plástico a temperatura regulada (inferior a 20°C) para ser llevadas para análisis al laboratorio de virología del Centro Regional de Investigación La Platina, perteneciente al Instituto de Investigaciones Agropecuarias (INIA), ubicado en Santiago.

El número de muestras por campo fue variable, dependiendo de su tamaño. Generalmente, se tendió a colectar aproximadamente el 10% del total de plantas. Todas las muestras se analizaron serológicamente según el procedimiento ELISA indirecto, utilizando antisueros para los siguientes virus; GFLV, GLRV, TomRSV y CLRV (SANOFI, Francia). Asimismo, en los predios visitados se colectaron muestras de plantas con síntomas atribuibles a una virosis, las que fueron procesadas en forma similar a las anteriores. Cuando los cuatro virus prospectados dieron resultados negativos, las mismas muestras se sometieron a una batería de antisueros que incluyeron a los siguientes virus reportados por Martelli (1993) como presentes en vides en diferentes localidades del mundo: Alfalfa Mosaic Virus (AMV) (Bercks et al., 1973), Apple Mosaic Virus (ApMV), Arabis Mosaic Virus (ArMV), Carnation Mottle Virus (CarMV), Cucumber Mosaic Virus (CMV), Potato Virus X (PVX), Tomato Black Ring Virus (TBRV), Tobacco Streak Virus (TSV), Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV) (Stobbs y Broadbent, 1993), Raspberry Ringspot Virus (RRV), Strawberry Latent Ringspot Virus (SLRV), Tobacco Mosaic Virus (TMV) y Tobacco Ringspot Virus (TRSV). Además, las muestras se estudiaron serológicamente por ELISA con antisueros policlonales específicos para la detección de la bacteria Xillela fastidiosa, agente causal de la enfermedad de Pierce, ausente aún en los viñedos chilenos.

La ejecución de la prueba ELISA se realizó de la siguiente manera: con un rodillo manual se trituró aproximadamente 1 g de hojas y brotes nuevos, se diluyó (1/10 p/v) en tampón de extracción (Na2CO3 1,5 mM, NaHCO3 3,5 mM, pH 9,6). Luego, las muestras se centrifugaron a 3000 rpm durante 5 min. En placas de poliestireno se adicionaron 100 m uL del sobrenadante por muestra (antígeno) a cada celda, incluyendo siempre una repetición (dos celdas), incubándose la placa bajo condiciones de refrigeración, toda la noche. Enseguida, las placas se lavaron con solución de lavado PBST (NaCl 137 mM, KH2PO4 1,47 mM NaHPO4x12H20 8,09 mM, KCl 2,68 mM y 0,05 % Tween-20) cinco veces, cada vez durante 5 min. Luego, se adicionó solución de bloqueo albúmina de huevo al 3% en PBS 1X (NaCl 137 mM, KH2PO4 1,47 mM, Na2HPO4x12H2O 8,09 mM, KCl 2,68 mM) incubándose durante 2 h a 37 ºC. Después de un lavado similar a los anteriores, se agregaron las inmunoglobulinas policlonales diluidas en tampón conjugado (albúmina de bovino 0,2%, PVP-40 0,5 M en PBS 1X), incubándose durante 3 h a 37 ºC. Posteriormente, después de lavar se les incorporó el segundo anticuerpo producido en cabra conjugado con la enzima fosfatasa alcalina, incubándose las placas durante toda la noche a 4ºC. Finalmente, la reacción se reveló adicionando 1 mg mL-1 de p-nitrofenilfosfato en tampón dietanolamina (9,7% v/v). Las reacciones inmunológicas se evaluaron en un lector ELISA (modelo EL 312e, marca Bio Kinetic, USA), considerando como muestras positivas, todas aquellas superiores al doble del valor de absorbancia de los controles sanos.

RESULTADOS

Considerando vides en producción, los resultados indicaron que en los 33 predios prospectados con un total de 16974 muestras, se encontró una infección virosa promedio de 9,8% (Cuadro 1). Sólo 5 de los 33 campos estudiados no presentaron presencia de ninguno de los 4 virus analizados, constituyendo el 15,1%. Otros 21 predios mostraron infecciones totales inferiores a 10% y en 7 campos las infecciones fluctuaron de entre 11 y 72%. Los virus que se encontraron con mayor frecuencia, en términos de predios infectados, fueron TomRSV y GLRV con 45,4 y 63,6%, respectivamente. En niveles inferiores se presentaron GFLV y CLRV con 30,3 y 27,2%, respectivamente.

Cuadro 1. Incidencia (%) de los virus GFLV1, GLRV2, TomRSV3 y CLRV4 en cultivos de vid en la zona central de Chile. Table 1. Incidence (%) of GFLV, GLRV, TomRSV and CLRV in grapevine in the central zone of Chile.

1 Grape Fan Leaf Virus 2 Grape Leaf Roll Virus 3 Tomato Ringspot Virus 4 Cherry Leaf Roll Virus 5 Región Metropolitana

Un análisis individual de cada uno de los virus, en relación al número total de muestras colectadas, indicó que el virus de mayor incidencia fue TomRSV con un 8,7%. El resto de los virus no superó la barrera del 1%. Sin embargo, cuando se analizaron los resultados de cada uno de los virus en particular, dentro de cada predio, los resultados fueron altamente variables. En algunos campos, los niveles de incidencia, tanto de GLRV como de TomRSV, alcanzaron el 20 ó 63% de plantas infectadas.

Considerando las prospecciones de virus en material madre para propagación, que incluyeron 6 viveros con un total de 7963 muestras, mostraron una incidencia promedio de infección virosa de 22,1% (Cuadro 2). Particularmente, en cada vivero los niveles de incidencia fueron relativamente altos. Por ejemplo, viveros ubicados en la VI Región presentaron infecciones del orden del 25% en el material madre, llegando en un caso al 42,2%. El análisis individual de cada virus mostró que el virus prevalente en los viveros fue TomRSV. Este virus mostró infecciones promedios para todos los viveros de 14,4%, con un rango variable entre 0 y 30,7%. Otro virus encontrado en niveles importantes fue GLRV, con una incidencia de 7,5% y un rango de 2,0 a 21,4%. Con menor incidencia se determinaron a GFLV y CLRV (Cuadro 2).

Cuadro 2. Incidencia (%) de los virus GFLV1, GLRV2, TomRSV3 y CLRV4 en viveros de vides en la zona central de Chile. Table 2. Incidence (%) of GFLV1, GLRV2, TomRSV3 and CLRV4 in grapevine nurseries in the central zone of Chile..

1 Grape Fan Leaf Virus. 2 Grape Leaf Roll Virus. 3 Tomato Ringspot Virus. 4 Cherry Leaf Roll Virus.

En los distintos predios visitados se encontraron, en forma esporádica, plantas con destacada disminución de crecimiento, manchas cloróticas en las hojas, mosaico leve en la lámina de las hojas, malformación de sarmientos y/u hojas, diferencias en brotación dentro del sarmiento, etc. Muestras de estas plantas, que fueron negativas a reacciones con antisueros de los 4 virus utilizados en los estudios de incidencia (14 muestras), se sometieron a prueba ELISA con otros antisueros de virus detectados en vides en diferentes partes del mundo. Así, en el Cuadro 3 se indican las diferentes reacciones para estos antisueros. Se obtuvieron reacciones positivas para los siguientes virus; ArMV, RRV, SLRV, PVX, TSWV, TSV y TBRV. Por otro lado, todas las reacciones fueron negativas para los virus AMV, ApMV, CarMV, CMV, TMV, ToRSV y GFV. También los resultados fueron negativos contra antisuero para la bacteria Xilella fastidiosa..

Cuadro 3. Reacción ELISA a antisueros de virus reportados en vides de muestras de vides con síntomas virosos provenientes de diferentes localidades. Table 3. ELISA reaction to antisera of reported viruses in grapevine samples with viral symptoms in grapevines coming from different localities.

DISCUSIÓN

Se han identificado a nivel mundial, 44 virus pertenecientes a 5 familias y 16 géneros en el cultivo de la vid (Martelli, 1994). En Chile, la mayoría del material de propagación disponible para la venta, tanto para uva de mesa como vides para vinificación, se caracterizan por ser plantas calificadas como corrientes. Esto significa que los diferentes viveros sólo pueden acreditar que el material es obtenido de plantas madres vigorosas y aparentemente libres de enfermedades sobre la base de una inspección visual. No existen entidades públicas o privadas que tengan sistemas de certificación de plantas o sistemas intermedios que aseguren la ausencia de virus.

La consecuencia de esta situación se ha visto reflejada en otros estudios, así por ejemplo, Herrera y Madariaga (1994) indicaron infecciones de 16 y 22% en parronales de la zona central para los virus GFLV y GLRV, respectivamente. El presente estudio en viñas y/o parronales de las regiones V, Región Metropolitana y VI, y que incluyó 16.974 muestras tomadas al azar, indica infecciones promedios de 9,8%. No obstante, se observó una heterogeneidad en la incidencia de los virus en los distintos predios estudiados. Esta heterogeneidad sugiere que, en aquellos predios sin infección virosa, el material de propagación provino de plantas madres sin estos virus, contrastando con los predios de elevada infección, donde probablemente el material provino de plantas madres infectadas. Más preocupante es la situación de viveros de producción de plantas de vides, en los cuales los promedios de infección llegaron al 22,1%.

Cabe destacar, que de acuerdo a los resultados expuestos, se observa una predominancia de la incidencia de TomRSV en relación a los otros virus estudiados. TomRSV se presenta en el Este de EE.UU. y Canadá, siendo de muy baja incidencia en California (Gonzalves, 1988). Estos resultados confirman la detección del virus en Chile por Herrera y Madariaga (1994) y Herrera (1996), y sugieren que en ciertas localidades podría constituirse en un factor detrimental de los rendimientos. Se indica a TomRSV como el causante del declinamiento progresivo de la vid. En los primeros años, los síntomas pasan inadvertidos, excepto por heterogeneidad en la brotación, especialmente en las regiones más frías. Posteriormente, las plantas infectadas muestran acortamiento de entrenudos, hojas pequeñas, deformadas y disminuciones de crecimiento. Bajo las condiciones de comercialización de plantas de vides en Chile, en que predomina la venta de plantas corrientes, y las características de este grupo de virus (transmisión por nemátodos y material de propagación), en el futuro podrían constituirse en un serio problema para el cultivo de la vid en Chile.

La presente investigación también demostró que los cultivos de vides en Chile, no sólo están afectados por las enfermedades más comunes a nivel mundial, sino también por otros virus que se presentan en este cultivo. Así se detectó la presencia de ArMV, PVX, TomBRV, RRV, SLRV, TSV y TSWV. De estos virus, PVX y TSWV son patógenos importantes en otros cultivos, pero en la vid tienen importancia secundaria.

Los resultados expuestos en la presente investigación permiten dimensionar la situación virológica de la vid en Chile. Los virus más importantes de la vid en el mundo están presentes en nuestras condiciones, con mayor o menor incidencia, dependiendo principalmente del origen del material propagado. Esto se ve reflejado en los resultados de la incidencia virosa en viveros; se observó una variación entre viveros y, dentro del vivero, entre diferentes virus. Probablemente, las plantas de vides en producción con baja incidencia virosa provienen de viveros poco infectados, y viceversa. Aunque mayores y más detalladas investigaciones son necesarias, los resultados expuestos proveen de información necesaria para enfatizar el establecimiento de programas integrados de control de estas enfermedades.

CONCLUSIONES

La incidencia promedio de infección virosa en plantaciones de vides en producción, en un total de 16.974 muestras, fue de 9,8%. En plantas madres para propagación se encontró un 22,1% en un total de 7.963 muestras.. En los diferentes predios fluctuó entre 0 y 72%.

En 16.974 muestras colectadas en plantaciones de vides en producción, se determinó una incidencia de 0,2% para GFLV, 0,66% para GLRV, 8,6% para TomRSV y 0,28% para CLRV.

En 7.963 muestras colectadas en viveros de vides se determinó una incidencia de 0,2% para GFLV, 7,5% para GLRV, 14,4% para TomRSV y 0,1% para CLRV.

El virus de mayor incidencia, tanto en plantaciones de vides en producción como en material madre para propagación, fue TomRSV.

Se detectaron mediante ELISA los siguientes virus de importancia secundaria en el cultivo de la vid; ArMV, RRV, SLRV, PVX, TSWV, TSV y TBRV. No se detectó la presencia de X. fastidiosa.

LITERATURA CITADA

Arancibia, M.R. 1988. Identificación de los virus asociados al enrollamiento de la hoja de la vid (V. vinifera L.) presentes en el cv. Black seedless y la obtención de plantas limpias mediante termoterapía y cultivo de meristemas. 100 p. Tesis Ingeniero Agrónomo.. Universidad de Chile, Facultad de Agronomía, Santiago. Chile.

Auger, S.J., E. Aballay, M. Pinto, y C. Pastenes. 1994. Efectos del virus de la hoja en abanico VHA en el desarrollo y productividad de plantas de vid cv. Thompson seedless. ACONEX 46:20-23.

Bercks, R., D. Leseman, and G. Querfurth. 1973. On detection of alfalfa mosaic virus in a grapevine. Phytopathology 76:166-171.

Cereceda,C., y J. Auger. 1979. Aislamiento y caracterización del virus Mosaico Amarillo de la vid (Vitis vinifera L. cv. Semillón), presente en Chile. Investigación Agrícola 5:83-88.

Goheen, A.C. 1977. The California clean grape stock program. Calif. Agric. 34:15-16.

Gonsalves, D. 1988. Tomato Ringspot Virus decline. p. 49-50. In Compendium of grape diseases. The American Phytopathological Society. APS Press, St. Paul, Minnesota, USA.

Herrera, M.G. 1996. Panorama de enfermedades causadas por virus en frutales de carozo pomáceas y vides. Simiente 66: 35-36.

Herrera, M.G., y M. Madariaga. 1994. Detección de los virus Tomato Ringspot Virus y Arabis Mosaic Virus en vides en Chile. Fitopatología 44:42.

Hewitt, A.C. 1965. Las enfermedades y otros problemas de los viñedos chilenos. 28 p. Informe al Gobierno de Chile. Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO). Roma, Italia.

Martelli, G. (ed.) 1993. Graft-transmissible diseases of grapevines. 263 p. Handbook for detection and diagnosis. Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO), Rome, Italy.

Martelli, G. 1994. Inquadramento sistematico dei virus delle vite. p. 245-254. In Atti Giornate Fitopatologiche 1994. Vol. 2. Editrice CLUEB, Bologna, Italia.

Martelli, G., and B Walter. 1998. Virus certification in grapevines. 684 p. In A. Hadidi, R. Khetarpal and H. Koganezawa (eds.). Plant virus disease control. APS Press, St. Paul, Minnesota. USA.

ODEPA, 1998. Cifras de presentación de la agricultura chilena. 69 p. Oficina de Estudios y Políticas Agrarias (ODEPA), Santiago, Chile.

Sanchez, C. R. 1995. Prospección de Nepovirus y Closterovirus en zonas vitivinícolas de la VIII Región. 46 p. Tesis Ingeniero Agrónomo. Universidad de Concepción, Facultad de Agronomía, Chillán, Chile.

Sanchez, R., y R. Hepp. 1994. Prospección de nepovirus y closterovirus en viñedos de la VIII Región. Simiente 64:100 (Resumen).

Stobbs, L., and A. Broadbent. 1993. Susceptibility of grapevine cultivars to Tomato Spotted Wilt Virus in Southern Ontario Canada. Plant Dis. 73:318.

Volosky, D. 1967. Primera trasmisión de virosis de la vid en Chile. Fitopatología 2:35-44.

Guido Herrera M. 2 y Mónica Madariaga V. 2

2 Instituto de Investigaciones Agropecuarias, Centro Regional de Investigación La Platina, Casilla 439 Correo 3, Santiago, Chile.